Sintesi di Cd-libera InP / ZnS Quantum Dots adatto per applicazioni biomediche

Sommario

In questo protocollo, la sintesi di punti quantici (QD) InP/ZnS privi di Cd è dettagliata. I QD basati su InP stanno guadagnando popolarità a causa della tossicità degli ioni Cd²⁺ che possono essere rilasciati attraverso la degradazione delle nanoparticelle. Dopo la sintesi, i QD vengono solubilizzati in acqua utilizzando un polimero anfifilico per l'uso in applicazioni biomediche.

Abstract

I nanocristalli fluorescenti, in particolare i punti quantici, sono stati uno strumento utile per molte applicazioni biomediche. Per un uso efficace nei sistemi biologici, i punti quantici dovrebbero essere altamente fluorescenti e di dimensioni piccole/monodisperse. Sebbene i punti quantici a base di cadmio comunemente usati possiedano queste qualità, sono potenzialmente tossici a causa del possibile rilascio di ioni Cd²⁺ attraverso la degradazione delle nanoparticelle. I punti quantici a base di indio, in particolare InP/ZnS, sono stati recentemente esplorati come una valida alternativa ai punti quantici a base di cadmio a causa delle loro caratteristiche di fluorescenza e dimensioni relativamente simili. La sintesi qui presentata utilizza tecniche standard di iniezione a caldo per un'efficace crescita delle nanoparticelle; Tuttavia, le proprietà delle nanoparticelle come le dimensioni, la lunghezza d'onda e l'intensità di emissione possono cambiare drasticamente a causa di piccoli cambiamenti nelle condizioni di reazione. Pertanto, le condizioni di reazione come la temperatura, la durata della reazione e la concentrazione dei precursori devono essere mantenute con precisione per produrre prodotti riproducibili. Poiché i punti quantici non sono intrinsecamente solubili in soluzioni acquose, devono anche subire modifiche superficiali per conferire solubilità in acqua. In questo protocollo, un polimero anfifilico viene utilizzato per interagire sia con i ligandi idrofobici sulla superficie del punto quantico che con le molecole d'acqua del solvente sfuso. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per la sintesi di punti quantici InP/ZnS altamente fluorescenti adatti per l'uso in applicazioni biomediche.

Introduzione

Punti quantici (QDs) sono semiconduttori nanocristalli che presentano proprietà fluorescenti quando irradiato con luce ^1. A causa delle loro piccole dimensioni (2-5 nm), che è simile a molte biomolecole più grandi, e facilità di biofunzionalizzazione, QD sono uno strumento estremamente interessante per applicazioni biomediche. Hanno trovato l'uso in etichettatura biologica, imaging singola molecola live-cell, la somministrazione di farmaci, imaging in vivo, il rilevamento degli agenti patogeni, e il monitoraggio delle cellule, tra molti altri usi ^2-8.

QD basata su CD sono stati più comunemente usato in applicazioni biomediche a causa della loro intensa fluorescenza e una ridotta larghezza picco di emissione ^9. Tuttavia, le preoccupazioni sono state sollevate a causa della potenziale tossicità del Cd ²⁺ ioni ¹⁰ che possono essere immesse attraverso la degradazione della nanoparticella. Recentemente, QD InP basati sono stati esplorati come alternativa alla QD Cd basati perché mantengono molte caratteristiche fluorescenzadi QD Cd-based e può essere più biocompatibile ^11. QD basata su CD sono stati trovati per essere significativamente più tossico QD InP a base di saggi in vitro a concentrazioni basse quanto 10:00, dopo solo 48 ore ^11.

Il colore emissione di fluorescenza di QD è formato-sintonizzabile ^1. Cioè, come la dimensione degli aumenti QD, l'emissione di fluorescenza è spostata verso il rosso. Le dimensioni e la dimensione dispersity dei prodotti QD può essere modificata variando la temperatura, la durata di reazione, o condizioni di concentrazione precursori durante la reazione ^12. Mentre il picco di emissione di InP QD è in genere più ampio e meno intensa rispetto QD basata su CD, InP QD può essere fatta in una grande varietà di colori progettate per evitare la sovrapposizione spettrale, e sono sufficientemente intenso per la maggior parte delle applicazioni biomediche ^12. La sintesi descritto in questo protocollo produce QD con un picco di emissione rosso centrato a 600 nm.

Diversi passaggi sono prese afSintesi ter delle anime QD per mantenere l'integrità ottica dei QD e la compatibilità per applicazioni biologiche. La superficie del nucleo QD deve essere protetto da difetti di ossidazione o di superficie che possono causare tempra; di conseguenza, un guscio di ZnS è rivestito sopra il nucleo di produrre InP / ZnS (core / shell) QD ^13. Questo rivestimento è stato dimostrato di proteggere la fotoluminescenza del prodotto QD. La presenza di ioni zinco durante la sintesi InP QD ha dimostrato di limitare difetti superficiali, nonché distribuzione dimensionale diminuzione ^12. Anche con la presenza di Zn ²⁺ nel mezzo di reazione, sintesi di InZnP sono altamente improbabili ^12. Dopo il rivestimento, con conseguente QD InP / ZnS sono rivestiti in ligandi idrofobici come l'ossido di trioctylphosphine (TOPO) o oleilammina ^12,14. Un polimero amfifilico può interagire con leganti idrofobi sulla superficie QD e molecole di acqua bulk per conferire solubilità in acqua ^15. polimeri anfifilici con carbogruppi chimici xylate possono essere utilizzate come "maniglie chimici" di funzionalizzare ulteriormente i QD.

Dettagli Questo protocollo la sintesi e funzionalizzazione di idrosolubili InP / ZnS QD con molto intensa emissione di fluorescenza e dimensioni relativamente piccole-dispersity. Questi QD sono potenzialmente meno tossici comunemente usati QD CdSe / ZnS. Qui, la sintesi di InP / ZnS QD offre una pratica alternativa per QD Cd-based per applicazioni biomediche.

Protocollo

1. Sintesi di fosfuro di indio / solfuro di zinco (INP / ZnS) Quantum Dots

1. Sintesi di fosfuro di indio (InP) Quantum Dot Cores
   1. Montare un fondo da 100 ml rotondo, 3-collo, pallone con un condensatore da 12 pollici. Aggiungere 30 ml oleilammina (OLA), 0,398 g di indio (III) cloruro (compresi _3), 0,245 g di zinco (II) cloruro (ZnCl ₂₎ e mescolare mentre evacuare a temperatura ambiente usando un vuoto per 1 ora. La soluzione deve apparire incolore con un precipitato bianco.
   2. Utilizzando un mantello di riscaldamento con una termocoppia e regolatore di temperatura proporzionale-integrale-derivativa (PID), aumentare la temperatura della soluzione a 120 ° C. Evacuare la soluzione sotto vuoto per 20 minuti per eliminare le impurezze a basso punto di ebollizione che possono influenzare la crescita nucleo.
      Nota: Mentre è possibile utilizzare un bagno di sabbia e termometro, con un mantello riscaldante e PID aumenta l'uniformità e la riproducibilità dei prodotti di reazione.
   3. Sotto gas inerte (ad esempio, N _2), riflusso della soluzione e aumentare la temperatura a 220 ° C per 15 min. Il Incl ₃ e ZnCl ₂ completamente dissolvono, per ottenere una soluzione di colore giallo pallido. Lasciare che la temperatura si stabilizzi per 10 minuti.
   4. Purge una siringa monouso da 3 ml di plastica e 4 pollici, 22 G ago con azoto gassoso. Usando la siringa, fornire rapidamente 0,5 ml tris (dimetilammino) fosfina (TDMAP) alla soluzione incl _3. La temperatura della soluzione diminuisce leggermente e ritorna a 220 ° C. I cambiamenti soluzione da trasparente, giallo pallido a opaco, nero.
   5. Dopo 9,5 min, togliere il pallone di reazione dal mantello di riscaldamento fino a quando la temperatura scende al di sotto di 200 ° C. Per proteggere l'integrità dei nuclei InP, procedere direttamente al rivestimento ZnS nel passaggio 1.2.1.
2. Sintesi di solfuro di zinco Conchiglie (ZnS) Quantum Dot
   1. Porre il pallone di reazione dal punto 1.1.5 su un mantello riscaldante e stabilizzare il temperature a 200 ° C. Aggiungere lentamente 3,58 g dodecantiolo (DDT) nel corso di 15 sec per la soluzione contenente InP QD. Lasciare la soluzione di reagire per 1 ora.
      Nota: spessore del guscio ZnS può essere variata aumentando o diminuendo la quantità di stearato di zinco aggiunto nel passaggio 1.2.4. Che modifica l'importo di ZnCl _{2 o} dodecantiolo in passi 1.1.1 e 1.2.1 può avere un impatto significativo sulla qualità della QD, modificando la cinetica di reazione.
      1. In seguito, rimuovere il pallone di reazione dal mantello di riscaldamento e lasciar raffreddare la soluzione a circa 60 ° C.
   2. Una volta che la soluzione InP / ZnS raggiunge ~ 60 ° C, aggiungere 10 ml esano e trasferire l'intera soluzione di circa 45 ml in una provetta da centrifuga da 50 ml in polipropilene. Centrifugare il campione (3000 xg per 10 min) per rimuovere precursori solidi non reagiti.
   3. trasferire con cautela il surnatante in una bottiglia in polipropilene centrifuga da 250 ml, aggiungere 200 ml di acetone, e centrifugare la soluzione (3.000 xg per 10 minuti) per far precipitare QD InP / ZnS. Questo volume può essere diviso equamente in quattro 50 ml provette per centrifugazione se una centrifuga con le necessarie rotore / accessori non è disponibile. Decantare il surnatante e asciugare il pellet QD a fondo con azoto per eliminare l'acetone.
   4. Risospendere le QD in 20 ml OLA utilizzando sonicazione, il trasferimento ad un fondo da 50 ml rotondo, 3-collo, pallone contenente 0.474 g di zinco stearato, e mescolate. Evacuare la soluzione sotto vuoto per 20 minuti a RT.
   5. Sotto azoto gassoso, aumentare la temperatura a 180 ° C e lasciare che la reazione di procedere per 3 ore. Mentre non ci sono cambiamenti visivi notevoli alla soluzione di reazione che si verificano durante questa reazione, l'aggiunta di stearato di zinco aumenta ZnS spessore del guscio, aumentando così QY migliorando passivazione della superficie di QD ^12.. Una volta che la reazione è completa, togliere il pallone dal mantello di riscaldamento e lasciare raffreddare la soluzione a circa 60 ° C.
   6. Una volta che i soluti InP / ZnSsulla raggiunge ~ 60 ° C, aggiungere 20 ml esano e trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml in polipropilene. Centrifugare il campione (3000 xg per 10 min) per rimuovere stearato di zinco non reagito.
   7. Trasferire accuratamente surnatante in un flacone da centrifuga da 250 ml polipropilene, aggiungere 200 ml di acetone, e centrifugare la soluzione (3000 xg per 10 min) per precipitare InP / ZnS QD. decantare con cautela il surnatante e asciugare accuratamente con azoto per eliminare l'acetone.
   8. Sciogliere il pellet InP / ZnS QD in 30 ml di esano. Vortex e Sonicare la soluzione per breve tempo per garantire la completa dispersione.
   9. purificazione Ripetere i punti 1.2.6-1.2.8 altre due volte per assicurare la rimozione completa di leganti organici in eccesso. Le interazioni tra il polimero amfifilico ed il QD nel passo 1.2 possono essere compromessi in presenza di leganti eccesso.
   10. Con calcoli dettagliati da Xie, et al. ^16, determinare la dimensione e la concentrazione dei QD InP / ZnS sintetizzati mediante Spettroscopia UV-Vis.
       Nota: La caratteristica spettrale importante per questa analisi è la spalla del picco di assorbimento. Il valore di lunghezza d'onda e l'assorbanza del massimo della spalla è utilizzato per calcolare le dimensioni e la concentrazione dei QD rispettivamente. Questa reazione produce tipicamente di circa 5 micromole di QD con un picco di emissione a 600 nm. Per sintetizzare QD di diversi colori, la durata e / o la temperatura della reazione può essere cambiato. Un tempo di reazione più lungo e / o superiore temperatura dei risultati della soluzione in un picco di emissione rossa spostata. Ad esempio, aumentando la temperatura di reazione a 240 ° C e mantenendo il tempo di reazione di 10 min comporterà QD con nm picco 680 emissioni massime. Analogamente, riducendo il tempo di reazione per 2 min e raddoppiando cloruro di zinco utilizzato comporterà QD con nm picco massimo di emissione 470. Questi QD InP / ZnS sono stabili per almeno un mese a 4 ° C al buio sotto gas inerte.

2. acquaSolubilizzazione del InP / ZnS Quantum Dots Utilizzando un Amphiphilic Polymer

1. solubilizzazione acqua
   1. Usando i QD InP / ZnS dal passaggio 1.2.10, diluire una parte dei QD con esano per ottenere 1 ml di 1 pM QD.
      1. In una provetta da centrifuga, trasferire 0,25 ml InP / ZnS QD in ogni provetta. Aggiungere 1 ml di acetone o metanolo al tubo da centrifuga e centrifugare (3000 xg per 10 min). Rimuovere con attenzione il surnatante e sciogliere ogni precipitato in 1 ml di tetraidrofurano (THF).
      2. Trasferire i QD InP / ZnS disciolto in THF in un 100 ml pallone da fondo e diluire con 16 ml di THF. Per ridurre il numero di aggregati in soluzione, sonicare i QD per 5-10 min.
   2. Sciogliere 30 mg di poli (maleica andhydride- alt -1-ottadecene), 3- (dimetilammino) -1-propilammina (PMAL-d) in 10 ml di acqua grado molecolare. Bagnomaria sonicazione o blanda agitazione fino a quando la soluzione è trasparente è sufficiente per sciogliere completamente il polimero. iluso di vortice o vigorosa agitazione può produrre molte bolle, che ostacola l'interazione del polimero con il QD. Aggiungere la soluzione di polimero 10 ml ai 100 ml rotonda pallone a fondo contenente InP / ZnS QDs in THF.
   3. Evaporare THF dalla soluzione QD / polimero utilizzando un evaporatore rotante. Collocare la beuta in un bagno di ghiaccio evaporando facilitare l'interazione tra il polimero e QD. A seconda della forza del vuoto, più THF viene evaporato dopo 10 minuti e la soluzione appare torbida.
      1. Una volta che la soluzione viene evaporata a 10 ml, togliere il matraccio dall'evaporatore rotante e aggiungere 30 ml di acqua molecolare. Riportare il pallone evaporatore rotante e continuare ad evaporare a 2 ml. Questa fase di evaporazione finale può richiedere molte ore; assicurare il bagno di ghiaccio viene mantenuta.
   4. Rimuovere i QD InP / ZnS idrosolubili dal pallone a fondo tondo con una pipetta. Filtrare la soluzione QD usando una siringa di plastica 3 ml collegata ad un nylon sy 0,1 umRinge filtrare in una provetta da centrifuga da 5 ml.
   5. Mettere i QD in una unità di dialisi membrana 20.000 MWCO e dializzare contro 0,05 M tampone borato pH 8,5 per rimuovere l'eccesso di polimero. (Aggiungere lentamente 0,05 M di sodio tetraborato decaidrato a M di acido borico 0.05, sotto vigorosa agitazione, fino a quando il pH è 8,5 a rendere questa soluzione tampone borato.) Utilizzando un concentratore a vuoto, concentrare gli QD in tampone borato a 1 ml.
   6. Per la conservazione, eliminare la soluzione con azoto prima di sigillare con parafilm. I QD InP / ZnS idrosolubili sono stabili per almeno 4 mesi a 4 ° C al buio.

Risultati

I nuclei InP non rivestiti non dimostrano sostanziale fluorescenza visibile ad occhio. Tuttavia, InP / ZnS (core / shell) punti quantici sembrano fluorescenza brillantemente ad occhio sotto irraggiamento UV. La fluorescenza di InP / ZnS QD è stato caratterizzato mediante spettroscopia di fluorescenza. Lo spettro di fluorescenza della QDs in esani (figura 1) eccitato a 533 nm mostra un picco principale centrato a 600 nm con una larghezza a metà massimo (FWHM) di 73 nm. Me...

Discussione

dettagli Questo protocollo sintesi altamente fluorescenti QD InP / ZnS che possono essere utilizzati in molti sistemi biologici. I prodotti QD sintetizzati qui esposti un singolo picco di emissione di fluorescenza centrato a 600 nm con una FWHM di 73 nm (figura 1), che è paragonabile ad altre sintesi precedentemente descritti ^12. Tempo di reazione e temperatura di reazione sono passi estremamente importanti a causa del loro effetto profondo sulla qualità sintesi QD e ripetibilità. Dopo solubi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Oleylamine	Acros	129540010
Cloruro di zinco (II)	Sigma	030-003-00-2
Cloruro di indio (III)	Chem-Impex	24560
Tris(dimetilammino)fosfina	Encompass	50-901-10500
1-dodecanetiolo	Acros	117625000
Hexanes	Fisher Sci	H292-4
Acetone	TransChemical	UN 1090
Zinco Stearato	Aldrich Chem	307564-1KG
Tetraidrofurano	Acros	34845-0010
Acqua molecolare	Fisher Sci	BP2470-1
Poli(anirdride maleico-alt-1-tetradecene), 3-(dimetilammino)-1-propilammina	derivato Sigma	90771-1G
Acido borico	Fisher Sci	BP168-500
Tetraborato di sodio Decaidrato	Fisher Sci	BP175-500
Rodamina B	Aldrich Chem	R95-3
Azoto gassoso	Airgas	UN1066
Trypan blue	Thermo Sci	SV30084.01
Siringa Luer-lock in plastica da 3 ml	BD	309657
Luer-lock Needle	Air-Tite	8300014471	4 pollici, 22 gauge
50 ml tubo da centrifuga in polipropilene	Falcon	352098
flacone da centrifuga da 250 ml	Thermo Sci	05-562-23	Nalgene PPCO
5 ml provette da centrifuga	Argos-Tech	T2076
1,5 ml	Bio Plas	4150
0,1 μ m Filtro per siringa	Whatman	6786-1301	Puradisc Filtro in nylon da 13 mm
Slide-A-Lyzer MINI Unità di dialisi	Thermo Sci	69590	20.000 MWCO
Evaporatore rotante	Heidolph
Centrifuge 5072	Eppendorf		Secchio oscillante con 50  Adattatori per tubi ml
Spettrometro UV/VIS Lambda 650 Spettrofotometro	UV-Vis	Perkin Elmer
LS 55 Spettrometro a fluorescenza	Perkin Elmer		Fluorimetro
Axio Observer.A1	Microscopio a epifluorescenza Zeiss
AxioCam MRm	Fotocamera CCD Zeiss
Microscopio Tecnai TF20	FEI		Miscroscopio elettronico a trasmissione
TEM Eagle CCD	FEI		TEM CCD Camera
NanoBrook Omni DLS	Brookhaven		Strumento di diffusione dinamica della luce