Qui, viene presentato un protocollo per isolare e stabilire colture primarie di fibroblasti/miofibroblasti (MF) da cellule gastriche, piccole cellule intestinali e di tessuto del colon congelate con un fenotipo MF. Queste cellule esprimono CD90, α-SMA e vimentina. Le MF possono essere utilizzate per una varietà di saggi funzionali, tra cui l'attività enzimatica e la produzione di citochine.
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Articolo metodologico
Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fibroblasti / miofibroblasti (MFS) stanno guadagnando sempre maggiore attenzione per il loro ruolo nella patogenesi e il loro contributo sia per la guarigione della ferita e la promozione del microambiente tumorale. Mentre ci sono attualmente molte tecniche per l'isolamento di MF da gastrointestinali (GI) tessuti, questo protocollo introduce un elemento nuovo di isolamento di queste cellule stromali di tessuti congelati. Congelamento campioni di tessuto GI non solo permette al ricercatore di acquisire campioni di collaboratori in tutto il mondo, le biobanche e fornitori commerciali, permette anche il trattamento ritardato dei campioni freschi. Il protocollo descritto sarà costantemente produrrà caratteristici cellule fusiformi con il fenotipo MF che esprimono i marcatori CD90, α-SMA e vimentina. Poiché queste cellule sono derivate da campioni di pazienti, l'uso di cellule primarie conferisce anche il vantaggio di MF mimando da stati, cioè il cancro e malattie infiammatorie intestinali malattie. Questa tecnica ha apen convalidato gastrico, piccolo intestino, colon e MF generazione coltura principale. Colture primarie MF possono essere utilizzati in una vasta gamma di esperimenti su un numero di passaggio e la loro purezza valutate sia immunocitochimica e analisi citofluorimetrica.
Introduzione
Miofibroblasti / fibroblasti (MFS) rappresentano una popolazione abbondante di cellule gastrointestinali (GI) mucosa. Queste cellule stromali si trovano appena sotto l'epitelio e formano una rete interconnessa all'interno della mucosa lamina propria nell'intestino. MF non sono responsabili solo per la deposizione della matrice extracellulare, ma attraverso la regolamentazione paracrina possono influenzare il trasporto di elettroliti, la restituzione, e la funzione di barriera dell'epitelio adiacente 1, 2. Inoltre, MF hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave nel processo infiammatorio e tessuti rimodellamento 3, 4. miofibrobla....
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Protocollo
Il protocollo per l'ottenimento di tessuti umani scartati da pazienti chirurgici e la creazione di colture primarie è stato approvato dalla University of Texas Medical Branch e University of New Mexico revisione istituzionale Boards. I requisiti generali per l'approvvigionamento di campioni di tessuto umano è descritto di seguito. Si noti che, poiché MF può essere isolato da tessuti congelati, le biobanche e fornitori commerciali sono anche opzioni praticabili.
1. Ottenere Human Tissue
- Invia un protocollo per ottenere dei tessuti del colon umano al comitato istituzionale di revisione per l'approvazione.
- St....
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Risultati
Usando questo protocollo digestione enzimatica, abbiamo sempre stati in grado di isolare e far crescere CD90 + cellule stromali della mucosa intestinale MF popolazione da GI campioni chirurgici e biopsie (Figura 1). Visibile MF colonia proliferazione potrebbe essere osservato il giorno 2-5 dopo la semina di cellule mononucleate sospensioni in 6 pozzetti (Figura 1A-B). Le colture primarie MF raggiungono ~ 50 - 70% confluenza di giorno 7 - 11
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Discussione
Mentre questo protocollo è stato sviluppato per l'applicazione solo ricerca, alla luce della crescente importanza critica di cellule stromali come un cancro potenziali biomarker prognostici e obiettivo terapeutico, la capacità di congelare campioni biologici "funzionali" per un uso successivo offre un vantaggio significativo. Questo rappresenta un vantaggio unico per la creazione di biorepository clinica, che può servire come strumenti aggiuntivi che servono per promuovere lo sviluppo della medicina person.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) e dall'Institute for Translational Sciences presso l'Università del Texas Medical Branch, e da un Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| salina bilanciata di Hanks | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotico-Antimicotico, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacina HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutammina, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Aminoacidi non essenziali | Corning | 25-025-CI | |
| Dimetil solfossido (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Ditiotreitolo soluzione (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Soluzione di dissociazione cellulare Accumax | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Contatore di Celle Automatizzato | Invitrogen | C10227 | |
| Filtro Cellulare (70 &; micro; m) | Corning | 352350 | |
| PE Topo Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonale Anti-Actina, &alfa;-Muscolo liscio | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Topo Anti-Umano CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
Riferimenti
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485(2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R.
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Ristampe e permessi
