Qui, viene presentato un protocollo per isolare e stabilire colture primarie di fibroblasti/miofibroblasti (MF) da cellule gastriche, piccole cellule intestinali e di tessuto del colon congelate con un fenotipo MF. Queste cellule esprimono CD90, α-SMA e vimentina. Le MF possono essere utilizzate per una varietà di saggi funzionali, tra cui l'attività enzimatica e la produzione di citochine.
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Articolo metodologico
Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fibroblasti / miofibroblasti (MFS) stanno guadagnando sempre maggiore attenzione per il loro ruolo nella patogenesi e il loro contributo sia per la guarigione della ferita e la promozione del microambiente tumorale. Mentre ci sono attualmente molte tecniche per l'isolamento di MF da gastrointestinali (GI) tessuti, questo protocollo introduce un elemento nuovo di isolamento di queste cellule stromali di tessuti congelati. Congelamento campioni di tessuto GI non solo permette al ricercatore di acquisire campioni di collaboratori in tutto il mondo, le biobanche e fornitori commerciali, permette anche il trattamento ritardato dei campioni freschi. Il protocollo descritto sarà costantemente produrrà caratteristici cellule fusiformi con il fenotipo MF che esprimono i marcatori CD90, α-SMA e vimentina. Poiché queste cellule sono derivate da campioni di pazienti, l'uso di cellule primarie conferisce anche il vantaggio di MF mimando da stati, cioè il cancro e malattie infiammatorie intestinali malattie. Questa tecnica ha apen convalidato gastrico, piccolo intestino, colon e MF generazione coltura principale. Colture primarie MF possono essere utilizzati in una vasta gamma di esperimenti su un numero di passaggio e la loro purezza valutate sia immunocitochimica e analisi citofluorimetrica.
Introduzione
Miofibroblasti / fibroblasti (MFS) rappresentano una popolazione abbondante di cellule gastrointestinali (GI) mucosa. Queste cellule stromali si trovano appena sotto l'epitelio e formano una rete interconnessa all'interno della mucosa lamina propria nell'intestino. MF non sono responsabili solo per la deposizione della matrice extracellulare, ma attraverso la regolamentazione paracrina possono influenzare il trasporto di elettroliti, la restituzione, e la funzione di barriera dell'epitelio adiacente 1, 2. Inoltre, MF hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave nel processo infiammatorio e tessuti rimodellamento 3, 4. miofibroblasti sono una parte critica del microambiente tumorale, dove sono conosciuti anche come i fibroblasti associati al cancro, e contribuire alla crescita delle cellule tumorali e servire come una nicchia per le cellule staminali del cancro 3. Dati emergenti suggeriscono che MF può anche servire le cellule presentanti l'antigene come locali. Inoltre, la funzione MF come importanti regolatori della risposta immunitaria innata e adattativa, prcing una varietà di citochine e fattori di crescita 5.
Negli individui sani, le cellule MFS si ritiene da differenziare da cellule staminali mesenchimali ed esprimere sulla loro superficie delle cellule, il marcatore mesenchimale, CD90 3, 5. Queste cellule sono anche positivi per vimentina, ma negativo per epiteliali e marker delle cellule ematopoietiche, EpCAM e CD45 rispettivamente. Miofibroblasti sono suggeriti per essere una forma attiva di fibroblasti e possono essere distinti dai fibroblasti non attivati mediante l'espressione di α-SMA 5.
Negli ultimi dieci anni, più approcci per l'isolamento di miofibroblasti dalla mucosa del colon umani sono stati pubblicati per lo più basato sul metodo originariamente descritto da Mahida et al. 5-8. Mentre i singoli studi riportano procedure di isolamento di varie mucosa intestinale, nessun protocollo universale per l'isolamento di MF da più zone del tratto gastrointestinale (ad esempio, gastrico, piccolo e large mucosa intestinale) è stato pubblicato. Il protocollo qui presentata è stato testato ed usato con successo per tutti e tre tipo di tessuto sopra menzionato. . Inoltre, non sono stati segnalati procedure per isolare MFs da mucosa GI congelati.
Qui, vi presentiamo un metodo ottimizzato, che si basa sulla digestione enzimatica, e permette contemporaneamente per l'isolamento di mucosa dell'intestino umano MF per la cultura e citometria a flusso analisi appena digerito, singola cella, i preparativi della mucosa. Questa tecnica produce in modo affidabile colture primarie con un fenotipo MF. Inoltre, gli stessi metodi possono essere utilizzati per isolare MFs da campioni congelati di tessuti intestinali gastriche e piccoli pure. Isolamento di miofibroblasti da tessuto fresco GI è stata precedentemente descritta; tuttavia, l'utilizzo di campioni congelati presenta molti vantaggi. Vale a dire, i ricercatori saranno in grado di raccogliere e conservare i tessuti da un qualsiasi numero di collaboratori in tutto il mondo che hanno il capabilità per spedire campioni di tessuto congelato. Inoltre, i ricercatori potrebbero trovare la collezione di tessuti scartati dalla sala operatoria e / o suite endoscopia e immediata elaborazione del tessuto per l'isolamento di conflitto con il loro programma di sperimentazione in corso. Inoltre, a causa della natura imprevedibile di un intervento chirurgico, di approvvigionamento dei tessuti può verificarsi molto tardi nel corso della giornata, che limiterà il tempo rimasto per il tessuto lavorazione. Congelamento dei tessuti per successive elaborazioni si migliorare queste sfide.
Infine, questi metodi sono stati utilizzati con successo nell'isolamento di colon, gastrici e piccole miofibroblasti intestinali in stati di malattia come il carcinoma colorettale e malattie infiammatorie intestinali.
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Protocollo
Il protocollo per l'ottenimento di tessuti umani scartati da pazienti chirurgici e la creazione di colture primarie è stato approvato dalla University of Texas Medical Branch e University of New Mexico revisione istituzionale Boards. I requisiti generali per l'approvvigionamento di campioni di tessuto umano è descritto di seguito. Si noti che, poiché MF può essere isolato da tessuti congelati, le biobanche e fornitori commerciali sono anche opzioni praticabili.
1. Ottenere Human Tissue
- Invia un protocollo per ottenere dei tessuti del colon umano al comitato istituzionale di revisione per l'approvazione.
- Stabilire collaborazioni con chirurghi generali e / o chirurghi colorettali al fine di ottenere tessuti umani per la ricerca. La collaborazione con il reparto di patologia è obbligatoria anche in quanto saranno determinare il tessuto che non è richiesto per la diagnosi e può essere designato per la ricerca.
- Informare il patologo di fornire il tessuto dalla neoplasia e poi grossly mucosa normale di almeno 5 cm dal tumore. Porre immediatamente i campioni nei media lavaggio gelide e disporli sul ghiaccio. Il patologo determina la quantità di tessuto che può essere dato in modo sicuro per la ricerca. Il tessuto minimo richiesto per l'isolamento MF è di 1,5 mm 2.
- Utilizzare il tessuto ottenuto o immediatamente per stabilire le colture primarie o congelamento e posto a -80 ° C per l'isolamento futuro.
- Se il congelamento per l'isolamento più tardi, tagliate il tessuto in circa 1-2 mm 2 pezzi, mettere in un tubo criogenico con 1 ml di mezzi di congelamento (vedi sotto), e conservare a -80 ° C. Nota: Utilizzando questo protocollo, è stato osservato con successo l'isolamento di MF da tessuto congelato per oltre 4 anni.
2. Preparare Reagenti
- Per la soluzione Collagenase: Preparare 100 U / ml di collagenasi I, II e IV, in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con Ca2 + / Mg 2+ (vedi Tabella Materiali ). ATTENZIONE: collagenasi concentrazione unità attiva e purezza può varia da produttore a produttore, che possono ostacolare l'efficienza della digestione tessuti e / o conservazione dell'epitopo sulla superficie delle cellule della mucosa. Per evitare questi potenziali insidie, utilizzare collagenasi con più alto grado di purezza (≥95%) e preparare la soluzione madre basata sulla concentrazione unità attiva.
- Preparare la soluzione di DNasi magazzino a base di acqua a 10 mg / ml (3.55 UA / mg).
- Preparare lavaggio mezzi: (MEM: 89 ml, antibiotici contro funghi, 100x: 1 ml; FCS inattivato al calore: 10 ml)
- Preparare Fibroblast crescita dei media: MEM: flacone da 500 ml; L-glutammina (200 mM): 5 ml; MEM non essenziali aminoacidi, 100x soluzione: 5 ml; ciprofloxacina HCl (10 mg / ml): 570 ml; Antibiotico-Antimicotici soluzione 100x: 10 ml; piruvato di sodio (100 mM): 5 ml; FCS inattivato al calore: 50 ml
- Preparare supporti Fermo: i media di crescita dei fibroblasti (reagente 2.4) con l'aggiunta del 10% di dimetilsolfossido (DMSO), poi filtrare-sterilize con un filtro di 0,22 micron.
Tissue 3. enzimaticamente Digest umana
- Se il tessuto è stato congelato nei media congelare, posto esageratamente a (~ 37 ° C) acqua calda fino a quando viene scongelato dei tessuti e dei media.
- Per 4-5 di 2 mm 2 pezzi di tessuto, lavare il tessuto due volte con 10 ml di HBSS senza Ca 2 + / Mg 2+.
- Una volta che il tessuto è stabilito per gravità, eliminare accuratamente il surnatante, senza girare campione.
- Aggiungere 10 ml della soluzione di collagenasi al campione e trasferire la miscela di tessuto in una soluzione sterile tubo DNasi / RNasi-free con incorporato rotori per campione dissociazione. Utilizzare collagenasi dissociare la matrice extracellulare che circonda l'aspetto basale delle cellule epiteliali e costituisce la frazione non cellulare della propria mucosa lamina.
- Chiudere bene il tubo e collegarlo a testa in giù sul manicotto del dissociatore (ad esempio, gentleMACS). Se il laboratorio non ha l'accesso a tegli summenzionato attrezzature, aumentare il tempo di ciascuna fase di digestione per ottenere risultati comparabili.
- Eseguire il h_tumor_01 Programma, un profilo preimpostato in dotazione con la macchina (durata complessiva di 36 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 268 colpi per corsa).
- Dopo la cessazione del programma, staccare il tubo dal dissociatore.
- Incubare campione per 45 min a 37 ° C in rotazione continua su agitatore a 140 rpm. Nota: Per le diverse quantità di campioni di tessuto, il tempo di digestione può essere proporzionalmente ridotto o aumentato (ad esempio, grandi quantità di tessuto possono richiedere tempo supplementare).
- Collegare il tubo a testa in giù sul manicotto del dissociatore.
- Scegliere ed eseguire il programma h_tumor_02 (durata complessiva di 37 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 235 colpi per corsa).
- Dopo la cessazione del programma, staccare il tubo dal dissociatore.
- Aggiungere 50 ml di soluzione madre DNasi. Utilizzare DNAse dissociare / rimuovere le cellule morte e la frazione di DNA di detriti cellulari che porta alla cella aggregazione.
- Incubare campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua su agitatore a 60 rpm.
- Collegare il tubo a testa in giù sul manicotto del dissociatore di nuovo.
- Scegliere ed eseguire il programma h_tumor_03 (durata complessiva di 37 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 168 colpi per corsa).
Nota: Se il tessuto non è completamente digerito, centrifugare a 250 xg per 10 min a 20 ° C, scartare il surnatante, risospendere in 2 ml di soluzione di dissociazione cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10 min. - Passare la sospensione cellulare attraverso sterile 70 micron colino cella.
- Sospensione cellulare Centrifugare a 250 xg per 10 min a 20 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
- Lavare pellet di cellule due volte con 25 ml di HBSS senza Ca 2 + / Mg 2+ e scartare il surnatante.
- Prima dell'ultima erah, contare il numero di cellule utilizzando un sistema di conteggio delle cellule automatizzato disponibile in laboratorio o manualmente utilizzando emocitometro. Per MF generazione coltura primaria proseguire per passo 3.19.1, per l'analisi o l'ordinamento di MF in citometria a flusso proseguire per passo 3.19.2.
- Per l'isolamento e la crescita della coltura pura MF (Figura 1), scartare il surnatante da ultima centrifugazione, il pellet cellulare risospendere in quantità appropriata di terreni di isolamento fibroblasti necessaria per seminare fino a 4 x 10 6 cellule in 3 ml di media per pozzetto in 6 piatti ben, coltura cellulare trattati. Passare al punto 3.20.
- Per l'analisi o l'ordinamento di MF in citometria a flusso, collocare fino a 2 x 10 6 a 2 ml di terreni di isolamento dei fibroblasti in 24 bene, piatto a basso legame e incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Questo è quello di ripristinare le epitopi di superficie delle cellule che potrebbero essere interessati dalla procedura enzimatica. Poi raccogliere sospensione cellulare e contare le cellule recuperate e procedereper la immunocolorazione e citometria a flusso di analisi 8.
- Crescere le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Modificare i media ogni 2 - 3 giorni fino alla formazione del ~ 80% confluenti MF monostrato (Figura 1D-E).
- Cellule Passage in fusti T25 con da 6 pozzetti in rapporto 1: 1 e crescere per circa 10 - 14 giorni nei media di crescita dei fibroblasti per raggiungere 80-100% di confluenza.
- Espandere cultura, passaging cellule da T25 a cellule T75 in rapporto 1: 2. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, usare un pallone per l'analisi di isolati purezza MF usando da citofluorimetria come descritto in precedenza 5. Congelare o di passaggio un altro pallone T75 della cultura MF in rapporto 1: 3.
Nota: Quando analizzate mediante citometria di flusso, si prevede che la mucosa GI stromale MF di origine mesenchimale quando cresce nella cultura avrà seguente fenotipo: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +.
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Risultati
Usando questo protocollo digestione enzimatica, abbiamo sempre stati in grado di isolare e far crescere CD90 + cellule stromali della mucosa intestinale MF popolazione da GI campioni chirurgici e biopsie (Figura 1). Visibile MF colonia proliferazione potrebbe essere osservato il giorno 2-5 dopo la semina di cellule mononucleate sospensioni in 6 pozzetti (Figura 1A-B). Le colture primarie MF raggiungono ~ 50 - 70% confluenza di giorno 7 - 11
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Discussione
Mentre questo protocollo è stato sviluppato per l'applicazione solo ricerca, alla luce della crescente importanza critica di cellule stromali come un cancro potenziali biomarker prognostici e obiettivo terapeutico, la capacità di congelare campioni biologici "funzionali" per un uso successivo offre un vantaggio significativo. Questo rappresenta un vantaggio unico per la creazione di biorepository clinica, che può servire come strumenti aggiuntivi che servono per promuovere lo sviluppo della medicina person...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) e dall'Institute for Translational Sciences presso l'Università del Texas Medical Branch, e da un Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| salina bilanciata di Hanks | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotico-Antimicotico, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacina HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutammina, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Aminoacidi non essenziali | Corning | 25-025-CI | |
| Dimetil solfossido (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Ditiotreitolo soluzione (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Soluzione di dissociazione cellulare Accumax | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Contatore di Celle Automatizzato | Invitrogen | C10227 | |
| Filtro Cellulare (70 &; micro; m) | Corning | 352350 | |
| PE Topo Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonale Anti-Actina, &alfa;-Muscolo liscio | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Topo Anti-Umano CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
Riferimenti
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