Articolo metodologico

Avvio di differenziazione in cellule multipotenti immortalizzate Otic progenitrici

DOI:

10.3791/53692

⸱

2 gennaio 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vengono descritti gli attuali protocolli per mantenere le cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate (iMOP) e la differenziazione otica. Vengono evidenziate le condizioni di coltura e i marcatori molecolari che indicano la differenziazione in epiteli sensoriali e neuroni gangliari spirali (SGN).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) o cellule staminali embrionali (ESC) per terapie di sostituzione cellulare è molto promettente. Diverse limitazioni, tra cui basse rese e popolazioni eterogenee di cellule differenziate, ostacolano il progresso delle terapie con cellule staminali. È stata generata una linea cellulare di progenitori otici multipotenti immortalizzati (iMOP) a destino limitato per facilitare la differenziazione efficiente di un gran numero di cellule ciliate funzionali e neuroni gangliari spirali (SGN) per terapie di sostituzione delle cellule dell'orecchio interno. A partire da colture dissociate di singole cellule iMOP, sono stati descritti protocolli che promuovono l'uscita dal ciclo cellulare e la differenziazione mediante prelievo del fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF). Una significativa diminuzione delle cellule proliferanti dopo la sospensione del bFGF è stata confermata utilizzando un saggio di proliferazione cellulare EdU. In concomitanza con una diminuzione della proliferazione, il successo della differenziazione ha portato all'espressione di marcatori molecolari e cambiamenti morfologici. L'immunocolorazione di Cdkn1b (p27KIP) e Cdh1 (E-caderina) nelle otosfere derivate da iMOP è stata utilizzata come indicatore per la differenziazione negli epiteli sensoriali dell'orecchio interno, mentre l'immunocolorazione di Cdkn1b e Tubb3 (β-tubulina neuronale) è stata utilizzata per identificare i neuroni derivati da iMOP. L'uso di cellule iMOP fornisce uno strumento importante per comprendere le decisioni sul destino cellulare prese dai progenitori neurosensoriali dell'orecchio interno e aiuterà a sviluppare protocolli per la generazione di un gran numero di cellule ciliate derivate da iPSC o ESC e SGN. Questi metodi accelereranno gli sforzi per la generazione di cellule otiche per le terapie sostitutive.

Introduzione

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Gli organi dell'orecchio interno, la coclea, l'utricolo, il sacculo e tre canali semicircolari, mediano la capacità di sentire e di stare in equilibrio. All'interno della coclea, le cellule ciliate convertono i suoni in segnali elettrici che vengono trasmessi ai neuroni gangliari a spirale (SGN). Gli SGN attivano potenziali d'azione per propagare i segnali neurali attraverso il circuito uditivo. Le mutazioni genetiche, i farmaci ototossici e l'esposizione a suoni forti contribuiscono alla morte delle cellule ciliate e del SGN che provocano la perdita dell'udito1-4. Una volta perse, queste celle non vengono sostituite. L'uso di iPSC ed ESC per generare cellule ciliate nascenti o SGN è molto promettente per le terapie di sostituzione delle cellule dell'orecchio interno5-8. Una raffica di progressi ha dimostrato che le cellule staminali pluripotenti e i progenitori derivati dall'orecchio interno possono differenziarsi in cellule ciliate e SGN a vari stadi di maturità. Le cellule staminali embrionali di mammifero (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere utilizzate per generare cellule ciliate funzionali e SGN9-11. È stato anche dimostrato che le cellule staminali e le cellule progenitrici derivate dall'orecchio interno dei mammiferi formano cellule ciliate e neuroni con proprietà delle loro controparti cellulari in vivo 12-16.

L'uso di progenitori otici derivati da iPSC o ESC per sostituire le cellule ciliate perse e gli SGN richiede una differenziazione efficiente. Una differenziazione impropria o la continua proliferazione di progenitori derivati dallo stelo innestato nell'orecchio interno possono esacerbare la funzione dell'orecchio interno e rappresentare un rischio tumorigenico come la formazione di teratomi nell'orecchio interno17. C'è una chiara necessità di sviluppare le condizioni di coltura e comprendere la differenziazione dei progenitori otici. Una strategia nello sviluppo di questi metodi è quella di ricapitolare le decisioni sul destino cellulare prese dai progenitori neurosensoriali durante lo sviluppo dell'orecchio interno. I protocolli che prevengono la proliferazione e dirigono i progenitori otici nelle cellule ciliate o SGN contribuiranno a migliorare la sicurezza e l'efficacia delle terapie sostitutive.

Durante lo sviluppo, l'orecchio interno inizia con l'ispessimento dell'ectoderma superficiale in una regione ristretta tra i rombomeri 5 e 6 per diventare il placode otico. Quando il placode otico si invagina per formare una coppa otica, un insieme di cellule nella regione anteriore della coppa otica dà origine al dominio neurale-sensoriale-competente (NSD), che contiene i precursori delle cellule ciliate e dei neuroni dell'orecchio interno18. Studi di mappatura del destino su topi, polli e pesci zebra che sviluppano l'orecchio interno suggeriscono popolazioni multiple di progenitori neurosensoriali che danno origine alle cellule ciliate sensoriali, che circondano le cellule di supporto e i neuroni otici19-22. Il fattore di trascrizione del gruppo ad alta mobilità, Sox2, è stato implicato nella specificazione delle cellule sensoriali e utilizzato come marcatore per i progenitori dell'orecchio interno23,24. Le mutazioni ipomorfiche che diminuiscono i livelli di espressione di Sox2 nell'orecchio interno provocano la perdita delle cellule ciliate, delle cellule di supporto e degli SGN nella coclea25,26.

Per studiare le cellule progenitrici otiche sottoposte a decisioni sul destino cellulare, è stata precedentemente stabilita una linea cellulare di progenitori otici multipotenti immortalizzati (iMOP) con restrizione del destino da progenitori cocleari che esprimono Sox2. Le cellule iMOP sono state originariamente derivate dalla coclea embrionale E12.5-13.5 e infettate con un retrovirus c-Myc27. Le cellule iMOP possono proliferare continuamente come cellule formanti colonie note come otosfere e hanno la capacità di differenziarsi in cellule ciliate, cellule di supporto e SGN27. La comprensione della capacità delle cellule iMOP di differenziarsi in linee otiche distinte consente l'applicazione di questi risultati per generare in modo efficiente cellule ciliate derivate da iPSC o ESC e SGN. Protocolli di differenziazione efficienti apriranno nuove strade per le terapie di sostituzione cellulare delle malattie dell'orecchio interno che sono recalcitranti ai trattamenti convenzionali. Una questione cruciale nella generazione di cellule otiche mediante coltura cellulare in vitro è quella di avere marcatori di differenziazione che aiutino a determinare se le cellule sono in fase di differenziazione. Cdkn1b (p27KIP) è stato ampiamente utilizzato come marcatore precoce per il differenziamento nello sviluppo dell'orecchio interno, tuttavia, l'espressione di Cdkn1b nelle cellule iMOP e il modo in cui è correlato al differenziamento non sono stati affrontati. In questo studio, vengono descritte le attuali condizioni di coltura e il modo in cui l'espressione di Cdkn1b è correlata ad altri marcatori di differenziazione di iMOP.

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Protocollo

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1. Mantenere auto-rinnovamento nelle celle IMOP

  1. Preparare IMOP cultura dei media: DMEM / F12, 1X B27 supplemento, 25 mg / ml carbenecillin e 20 ng / ml bFGF. Fai 50 ml di IMOP coltura utilizzando reagenti sterili. Warm up 49 ml di DMEM / F12 in una conica da 50 ml in un bagno d'acqua a 37 °.
    1. Disgelo 50X B27 supplemento e 100 mg / ml carbenecillin aliquote sterilizzate per filtrazione, per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Scongelare 100 mg / ml bFGF aliquota a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml 50X B27, 10 pl di 100 ug / ml bFGF e 12,5 ml di 100 mg / ml in DMEM carbenecillin / F12.
  2. Utilizzare 3 ml di media in un piatto di coltura di tessuti 60 mm per le cellule di coltura IMOP. Aggiungere mezzi freschi a culture ogni altro giorno raddoppiando il volume del supporto. Assicurarsi che la concentrazione di bFGF non scenda sotto i 5 ng / ml.
    1. Cultura cellule IMOP a 37 ° C con 5% di CO 2. Le cellule Passage dopo 5 - 7 giorni in coltura elencati nella procedura riportata di seguito. Cultura Trasferire in un 15ml conica utilizzando un puntale 10 ml.
  3. Rendere EDTA 1 mM in HBSS diluendo 0,1 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml di HBSS. Preriscaldare 1 mM EDTA fatto in HBSS in un bagno d'acqua a 37 ° C.
  4. Celle di raccolta di sedimentazione per gravità o centrifugazione a 200 xg per 5 min. a RT. Per gravità sedimentazione, posizionare la conica 15 ml contenente le culture del C incubatore 37 ° per 5-10 minuti. Dopo tale tempo, osservare le otospheres raccolgono sul fondo del cono 15 ml.
    NOTA: la forza centrifuga eccessiva può causare danni alle cellule.
  5. Attentamente aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta senza disturbare il pellet. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di pre-riscaldato 1 mM EDTA HBSS alla cella pellet. Usando una pipetta P1000, delicatamente pipettare su e giù 2 - 3 volte. Posizionare conica a 37 ° C e incubare per <5 min a facilitare la dissociazione in cellule singole.
  6. Agitare delicatamente la soluzione di cellule per determinare se otospheres sono dissociate. Se no otosfere sedimentare sul fondo del cono, le cellule sono dissociate. Il tempo di incubazione può variare.
    NOTA: prolungata incubazione con EDTA provoca la morte delle cellule eccessivo.
  7. Rimuovere le cellule da 37 ° C, aggiungere 2 ml di mezzi per neutralizzare e diluire l'EDTA. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare diluito EDTA utilizzando un 2 ml aspirazione pipetta e aggiungere 5 ml di PBS 1X per lavare le cellule.
  8. Spin giù le cellule a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare fuori 1X PBS usando una pipetta 2 ml aspirazione. Risospendere le cellule utilizzando una pipetta P1000 in 0,5 ml di IMOP cultura mediatica pipettando gentilmente su e giù 2 - 3 volte.
  9. Contare le cellule utilizzando un contatore di particelle microfluidica con le cassette appropriate 28. Un piatto confluenti di cellule IMOP conterrà ~ 6 X10 6 celle. Diluire le cellule 1: 100 in media e aggiungere 75 ul di soluzione di cellule nel cassetto per il conteggio. Piastra 1 x 10 6 cellule in un piatto di 6 cm di IMOP culture dei media (~ 1: 10 diluizione). IMOPs Passage ogni 5 - 7 giorni.
    NOTA: Le cellule che formano grandi otospheres o si attaccano al fondo del piatto di coltura tissutale saranno differenziare. Le cellule saranno anche morire se le culture sono sopra confluenti.

2. gelo e disgelo Celle IMOP

  1. Preparare medio di congelamento scongelamento e sintetico, per equilibrare la soluzione a 4 ° C prima di cellule congelamento.
  2. Raccogliere le cellule da un cm piatto di cellule IMOP confluenti 6. Utilizzare una pipetta da 10 ml e cellule di trasferimento (~ 6 - 8 x 10 6 celle) in una conica da 15 ml.
  3. Celle di raccolta di sedimentazione per gravità o centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Se i otospheres sono piccole, le cellule non si depositano per gravità sedimentazione. Opzionale: Contare le cellule utilizzando passo 1.9 per determinare il numero di cellule totali.
  4. Aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2ml aspirazione pipetta lasciando il pellet sciolto dietro.
  5. Aggiungere 0,25 ml di media congelamento sintetici di riattivare cells ad una densità di 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 cellule / ml. Pipettare delicatamente le cellule con una pipetta P1000. Trasferire la sospensione cellulare di fiale criogeniche con una pipetta P1000 con 1 ml di filtrati punta.
  6. Porre le fiale in un contenitore di congelamento senza alcool e posizionare il contenitore di congelamento a -80 ° C per ridurre la temperatura di 1 ° C al minuto fino a quando la temperatura raggiunge i -80 ° C.
  7. Per la conservazione a lungo termine delle cellule, trasferire i flaconi alla fase vapore di un serbatoio di stoccaggio azoto liquido. Per scongelare le cellule per la cultura, equilibrare fiala criogenico contenente cellule congelate a -80 ° C.
  8. Terreni di coltura IMOP Pre-caldo in un bagno di 37 ° C Acque.
  9. Scongelare il flacone congelato rapidamente agitando il fondo della provetta in un bagno di acqua 37 ° C. Aggiungere 1 ml di terreni di coltura pre-riscaldato IMOP alle cellule scongelate una volta che il cristallo glaciale scompare. Trasferire le cellule in un ml conica 15 e aggiungere un ulteriore 4 ml di IMOP cultura mediatica
  10. Gira la 15 ml conico per 5 min. a 200 xg e aspirare i media spesi. Risospendere le cellule in 2 ml di terreni di coltura e le cellule IMOP piastra in un piatto 6 cm. Incubare culture a 37 ° C con 5% di CO 2 per l'espansione.

3. differenziazione delle cellule IMOP in epiteli sensoriali

  1. Preparare 50 ml di IMOP supporti differenziazione epiteli sensoriali: DMEM / F12, 1X B27 supplemento, 25 mcg / ml carbenecillin. Fai 50 ml di IMOP supporti differenziazione epiteli sensoriali. Warm up 49 ml di DMEM / F12 in una conica da 50 ml in un bagno d'acqua a 37 °. Supplemento B27 disgelo 50X e 100 mg / ml carbenecillin aliquote per 5 min. in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aggiungere 1 ml 50X B27 e 12,5 ml di 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12.
  2. Per raccogliere, dissociarsi, risospendere e contare le cellule ripetere i passaggi 1,4-1,9
  3. Piastra 1 x 10 6 cellule in una capsula di 6 cm in Giorno -3 utilizzando IMOP coltura. Il giorno 0, culture di trasferimento con una pipetta 10 ml in una conica da 15 ml. Raccogliere il otosfere di gravità sedimentazione a quanto dichiarato nella fase 1.6. Aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i otospheres sul fondo del cono.
  4. Aggiungere delicatamente in 2 ml di mezzi differenziazione sensoriale epiteli. Trasferimento otospheres a un piatto 6 centimetri con un grande foro da 10 ml pipetta.
    NOTA: tosatura meccanica da duro pipettaggio può dissociarsi cellule dagli otospheres.
  5. Aggiungere 2 ml di fresco supporti differenziazione epiteliale sensoriale culture ogni altro giorno. Se necessario, le cellule possono essere raccolte mediante sedimentazione gravità e supporti sostituito.
  6. Raccogliere otospheres al giorno 10 con il trasferimento ad un ml conica 15 e permettendo ai otospheres di sedimentare, come indicato al punto 1.6.Aspirate media spesi utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i otospheres indisturbati.
  7. Fissare otospheres incubando a 4% formaldeide in PBS 1X per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione di formaldeide, lavare otospheres con tampone di lavaggio (1X PBS contenente 0,1% TritonX-100) prima incubazione in tampone di bloccaggio (1X PBS contenente 10% siero di capra normale e 0,1% Triton X-100) per 1 ora.
    1. Sostituire buffer e incubare i campioni in tampone di bloccaggio con l'anticorpo diluito. Incubare a 4 ° C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente 0,1% Triton X-100 soggetti la otosphere dell'immunocolorazione 27. Trasferire otospheres in PBS 1X e luogo otospheres in mezzo di montaggio su un vetrino con una pipetta P1000. Mettere un vetrino sul campione e permettono mezzi di montaggio a secco a 4 ° C.
  8. Acquisire immagini epifluorescenza utilizzando una configurazione microscopio rovesciato dotato di una fotocamera CCD a 16 bit e di un aereo o di un 20X 0,75 NA obiettivo 40X 1.3 immersione in olio. Raccogliere la fluorescenza da diversi canali di colore utilizzando la elencati (di eccitazione e di emissione) le lunghezze d'onda: blu (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rosso (562 ± 20 nm / e 625 20nm ±) e infrarossi (628 ± 20 nm / e 692 ± 20nm).

4. Saggio EdU Costituzione

  1. Il giorno -3, piastra 1 x 10 6 cellule IMOP in un piatto di 6 centimetri. Tre giorni dopo il giorno 0, vendemmia, dissociarsi, risospendere e contare le cellule ripetendo i passi 1.4-1.9.
  2. Piatto 2,5 x 10 5 cellule in mezzi di coltura IMOP e 5 x10 5 cellule in sensoriale mezzi differenziazione epiteli in diversi pozzetti di un piatto 6 bene.
  3. Determinare la percentuale di cellule in fase S di Edu incorporazione il giorno 3 utilizzando un saggio di incorporazione EdU
    1. Aggiungere EdU magazzino direttamente alle culture IMOP per ottenere una concentrazione finale di 1 micron EdU nei mezzi di coltura.
    2. Incubare EdU nelle culture IMOP per 2 ore e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Harvest, dissociare e raccogliere le cellule ripetere i punti 1.4-1.9. Aggiungere a 4% formaldeide in PBS 1X per 15 min. a RT per riparare le cellule. Celle di raccolta per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di formaldeide e properly smaltire.
    3. Etichetta nuclei di cellule con la Hoechst e incorporati EdU con verde fluorescente dye-azide secondo il protocollo del produttore.
      NOTA: Tutti i lavaggi sono fatti con PBS 1X, 3% BSA e lo 0,1% di cellule Tween 20. Lavare con PBS 1X due volte.
    4. Montare le cellule su un vetrino utilizzando antifade reagenti e posizionare un bicchiere di 1,5 copertura sul campione. Acquisire le immagini fluorescenti di cellule marcate con un epifluorescenza.

5. Differenziare neuroni IMOP-Derived

  1. Fai 50 ml di media differenziamento neuronale: Neurobasal multimediali, 1X B27 supplemento, 2 mM L-glutammina. Bottiglia disgelo di 50X B27 e 200 mm L-glutammina in 37 ° C bagnomaria per 5 min. Aggiungere 1 ml 50X B27 e 0,5 ml 200 mm L-glutammina a 48,5 ml di mezzi Neurobasal.
  2. Cappotto coprioggetti mettendo 12 mm rotonde 1,5 vetrini in un piatto sterile, 10 centimetri e aggiungere il 70% EtOH al piatto per sterilizzare e pulire le lamelle.
  3. Agitare delicatamente la baiarslips per assicurarsi che sono coperti in etanolo. Lasciare la piastra per 10 minuti a RT. Lavare i coprioggetti 3 volte con sterili 1X PBS per lavare l'etanolo residuo. Sciacquare il vetrino una volta con H 2 0 sterili per lavare rimanente PBS 1X.
  4. Aspirare il H 2 0 utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i coprioggetti asciutto. Esporre i coprioggetti alla luce UV nella cappa coltura tissutale per 15 min. Conservare coprioggetto in un ambiente sterile, se non utilizzato immediatamente.
  5. Posizionare vetrino uno 12 millimetri rotonda in ogni pozzetto di un piatto 24 bene. Agitare gentilmente piastra per garantire che i coprioggetti sdraiarsi sul fondo del pozzo.
  6. Scongelare 2 mg / ml di soluzione di lisina poli-D-at RT e diluire a 10 ug / ml concentrazione poli-D-lisina in 1X PBS. Aggiungere 0,25 ml di 10 ug / ml di poli-D-lisina ai pozzetti. Lasciare la piastra nel 37 ° C incubatore per 1 ora.
  7. Lavare i pozzetti 3 volte con sterili 1X PBS. Thaw / ml di soluzione laminina magazzino 10 mg a temperatura ambiente e portare a 10 mg / ml in PBS 1X. Aggiungere 0,25 ml di 10 mg / ml soluzione di lavoro laminina in un singolo pozzetto di un piatto 24 multi-pozzo. Incubare la piastra a 37 ° C incubatore. Aspirare la soluzione laminina utilizzando un 2 ml aspirazione pipetta.
  8. Lavare il coprioggetto 3 volte con PBS 1X aggiungendo in 1 ml di PBS 1X con una pipetta P1000 e rimuovendo il 1X PBS aspirando con 2 ml aspiranti pipetta. Lasciare PBS 1X da ultimo lavaggio del bene fino a quando le cellule sono pronte per essere placcato. Avviare la differenziazione neuronale per la raccolta, dissociandosi e il conteggio delle cellule nei passaggi 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 cellule in una capsula di 6 cm in Day -3.
  9. Il giorno 0, vendemmia, dissociarsi e contare le cellule ripetendo 1,4-1,9. Seed 1 x 10 5-1,5 x 10 5 cellule IMOP in 0,5 ml di pre-riscaldato multimediali differenziamento neuronale per bene in un piatto multi-pozzo 24. Aspirare e aggiungere pre-riscaldato supporti differenziamento neuronale a culture ogni altro giorno.
  10. Fissare neuroni IMOP derivati ​​a 4% di formaldeide per 15 min. unt RT il giorno di soluzione di formaldeide 7. Rimuovere, lavare i neuroni IMOP derivati ​​con tampone di lavaggio (1X PBS contenente 0,1% TritonX-100) prima di incubazione in tampone di bloccaggio (1X PBS contenente il 10% di siero normale di capra e lo 0,1% Triton X-100) per 1 ora.
    1. Sostituire buffer e incubare i campioni in tampone di bloccaggio con l'anticorpo diluito. Incubare a 4 ° C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente 0,1% Triton X-100 cellule soggette a immunocolorazione 27. Lavare il coprioggetti con PBS 1X prima di mettere su un supporto di montaggio. Lasciare i supporti di montaggio a secco a 4 ° C prima di acquisire immagini epifluorescenza come indicato al punto 3.8.

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro è stato sostenuto in parte dal Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), dal Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) e dal Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CoolCell LX Contenitori per il congelamento delle cellule senza alcoolBioCisionBCS-405
Fiale criogeniche (2 ml) Corning430654
Vetrino coprioggetti in vetro spessore 1,5 (rotondo 12 mm)Scienze della microscopia elettronica72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Neurobasal MediumLife Technologies21103
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4Life Technologies10010-023
Hank's Soluzione salina bilanciata (HBSS)Life Technologies14025-092
Integratore B27 (50X) Senza sieroLife Technologies17504-044Conservato come aliquote da 1 ml
di L-glutammina (200 mM) Life Technologies25030-081Conservato come aliquote da 5 ml
Laminin di topo naturaleLife Technologies23017-015Conservato come aliquote da 1 mg/ml
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze Mezzi di crioconservazioneLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-736Conservato come 10 mg/ml 100 &; l aliquote Moxi
Z Mini contatore di celle automatizzatoOrflo MXZ001
Cassetta Moxi Z Tipo SOrflo MXC002
Fattore di crescita dei fibroblasti murini ricombinanti, basico (bFGF)Peprotech450-33Risospeso in 0,1% BSA in H20 e conservato come aliquote da 20 mg/ml
Poli-D-lisinaSigmaP7886Risospeso in 1X PBS e conservato come 10 mg/ml 100 &; l aliquote
Carbenicillina, sale disodicoThermo Fisher ScientificBP2648-1Risospeso in 10 mM Hepes pH 7,4 e conservato come aliquote da 100 mg/ml
pipetta in brossura da 5 ml in brossura (200/astuccio)Thermo Fisher Scientific1367811D
Pipetta da 10 ml in brossura confezionata singolarmente (200/confezione)Thermo Fisher Scientific1367811E
Piastra a 24 pozzetti trattata per coltura tissutale BioliteThermo Fisher Scientific130188
Piastra a 6 pozzetti trattata BioliteThermo Fisher Scientific130184 
Piatto da 6 cm trattato con coltura tissutaleThermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex Siringa Sterile Filtro PVDF Dimensione dei pori: 0,22 &; mThermo Fisher Scientific SLGV033RS
TipOne puntali per pipette con filtro 0,1 - 10 μ l puntale filtrante allungatoUSA Scientific1120-3810
Puntali per pipette filtranti TipOne 1 - 20 μ l puntale filtranteUSA Scientific1120-1810
Puntali per pipette filtranti TipOne 1 - 200 μ l  puntale con filtroUSA Scientific1120-8810
Puntali per pipette con filtro TipOne 101 - 1000 μ l puntale filtranteUSA Scientific1126-7810
Provette coniche da 15 ml sterili 20 buste da 25 provette (500 provette)USA Scientific1475-0511
Provette coniche da 50 ml sterili 20 bustine da 25 provette (500 provette)USA Scientific1500-1211

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
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