Vengono descritti gli attuali protocolli per mantenere le cellule progenitrici otiche multipotenti immortalizzate (iMOP) e la differenziazione otica. Vengono evidenziate le condizioni di coltura e i marcatori molecolari che indicano la differenziazione in epiteli sensoriali e neuroni gangliari spirali (SGN).
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Articolo metodologico
Avvio di differenziazione in cellule multipotenti immortalizzate Otic progenitrici
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Sommario
Abstract
L'uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) o cellule staminali embrionali (ESC) per terapie di sostituzione cellulare è molto promettente. Diverse limitazioni, tra cui basse rese e popolazioni eterogenee di cellule differenziate, ostacolano il progresso delle terapie con cellule staminali. È stata generata una linea cellulare di progenitori otici multipotenti immortalizzati (iMOP) a destino limitato per facilitare la differenziazione efficiente di un gran numero di cellule ciliate funzionali e neuroni gangliari spirali (SGN) per terapie di sostituzione delle cellule dell'orecchio interno. A partire da colture dissociate di singole cellule iMOP, sono stati descritti protocolli che promuovono l'uscita dal ciclo cellulare e la differenziazione mediante prelievo del fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF). Una significativa diminuzione delle cellule proliferanti dopo la sospensione del bFGF è stata confermata utilizzando un saggio di proliferazione cellulare EdU. In concomitanza con una diminuzione della proliferazione, il successo della differenziazione ha portato all'espressione di marcatori molecolari e cambiamenti morfologici. L'immunocolorazione di Cdkn1b (p27KIP) e Cdh1 (E-caderina) nelle otosfere derivate da iMOP è stata utilizzata come indicatore per la differenziazione negli epiteli sensoriali dell'orecchio interno, mentre l'immunocolorazione di Cdkn1b e Tubb3 (β-tubulina neuronale) è stata utilizzata per identificare i neuroni derivati da iMOP. L'uso di cellule iMOP fornisce uno strumento importante per comprendere le decisioni sul destino cellulare prese dai progenitori neurosensoriali dell'orecchio interno e aiuterà a sviluppare protocolli per la generazione di un gran numero di cellule ciliate derivate da iPSC o ESC e SGN. Questi metodi accelereranno gli sforzi per la generazione di cellule otiche per le terapie sostitutive.
Introduzione
Gli organi dell'orecchio interno, la coclea, l'utricolo, il sacculo e tre canali semicircolari, mediano la capacità di sentire e di stare in equilibrio. All'interno della coclea, le cellule ciliate convertono i suoni in segnali elettrici che vengono trasmessi ai neuroni gangliari a spirale (SGN). Gli SGN attivano potenziali d'azione per propagare i segnali neurali attraverso il circuito uditivo. Le mutazioni genetiche, i farmaci ototossici e l'esposizione a suoni forti contribuiscono alla morte delle cellule ciliate e del SGN che provocano la perdita dell'udito1-4. Una volta perse, queste celle non vengono sostituite. L'uso di iPSC ed ESC per generare cel....
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Protocollo
1. Mantenere auto-rinnovamento nelle celle IMOP
- Preparare IMOP cultura dei media: DMEM / F12, 1X B27 supplemento, 25 mg / ml carbenecillin e 20 ng / ml bFGF. Fai 50 ml di IMOP coltura utilizzando reagenti sterili. Warm up 49 ml di DMEM / F12 in una conica da 50 ml in un bagno d'acqua a 37 °.
- Disgelo 50X B27 supplemento e 100 mg / ml carbenecillin aliquote sterilizzate per filtrazione, per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Scongelare 100 mg / ml bFGF aliquota a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml 50X B27, 10 pl di 100 ug / ml bFGF e 12,5 ml di 100 mg / ml in DMEM carbenecillin / F12.
- Utilizzare 3 ml di media in un....
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Risultati
bFGF Ritiro Decrementi proliferazione in cellule IMOP
Per diminuire la capacità proliferativa delle cellule IMOP e avviare la differenziazione delle cellule IMOP, bFGF è stato ritirato dalle culture. Per confermare che il fattore di crescita ritiro diminuisce la proliferazione, EdU incorporazione è stato impiegato come un saggio di proliferazione. La percentuale di cellule che incorporava EdU da otospheres col.......
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Discussione
Monitoraggio Culture IMOP
Un protocollo per mantenere auto-rinnovamento e promuovere la differenziazione di una linea cellulare IMOP romanzo è descritto e formati placcatura aggiuntivi sono inclusi (Tabella 1). Diversi passaggi critici che aiutano con l'espansione di routine e la differenziazione delle cellule IMOP sono noti. Simile a colture di cellule staminali pluripotenti, le cellule IMOP teoricamente hanno una durata indefinita. Per garantire che le.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto in parte dal Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), dal Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) e dal Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CoolCell LX Contenitori per il congelamento delle cellule senza alcool | BioCision | BCS-405 | |
| Fiale criogeniche (2 ml) | Corning | 430654 | |
| Vetrino coprioggetti in vetro spessore 1,5 (rotondo 12 mm) | Scienze della microscopia elettronica | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Soluzione salina bilanciata (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Integratore B27 (50X) Senza siero | Life Technologies | 17504-044 | Conservato come aliquote da 1 ml |
| di L-glutammina (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Conservato come aliquote da 5 ml |
| Laminin di topo naturale | Life Technologies | 23017-015 | Conservato come aliquote da 1 mg/ml |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Mezzi di crioconservazione | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Conservato come 10 mg/ml 100 &; l aliquote Moxi |
| Z Mini contatore di celle automatizzato | Orflo | MXZ001 | |
| Cassetta Moxi Z Tipo S | Orflo | MXC002 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti murini ricombinanti, basico (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Risospeso in 0,1% BSA in H20 e conservato come aliquote da 20 mg/ml |
| Poli-D-lisina | Sigma | P7886 | Risospeso in 1X PBS e conservato come 10 mg/ml 100 &; l aliquote |
| Carbenicillina, sale disodico | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Risospeso in 10 mM Hepes pH 7,4 e conservato come aliquote da 100 mg/ml |
| pipetta in brossura da 5 ml in brossura (200/astuccio) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Pipetta da 10 ml in brossura confezionata singolarmente (200/confezione) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Piastra a 24 pozzetti trattata per coltura tissutale Biolite | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Piastra a 6 pozzetti trattata Biolite | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Piatto da 6 cm trattato con coltura tissutale | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Siringa Sterile Filtro PVDF Dimensione dei pori: 0,22 &; m | Thermo Fisher Scientific SLGV033RS | ||
| TipOne puntali per pipette con filtro 0,1 - 10 μ l puntale filtrante allungato | USA Scientific | 1120-3810 | |
| Puntali per pipette filtranti TipOne 1 - 20 μ l puntale filtrante | USA Scientific | 1120-1810 | |
| Puntali per pipette filtranti TipOne 1 - 200 μ l puntale con filtro | USA Scientific | 1120-8810 | |
| Puntali per pipette con filtro TipOne 101 - 1000 μ l puntale filtrante | USA Scientific | 1126-7810 | |
| Provette coniche da 15 ml sterili 20 buste da 25 provette (500 provette) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| Provette coniche da 50 ml sterili 20 bustine da 25 provette (500 provette) | USA Scientific | 1500-1211 |
Riferimenti
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary'....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to the Authors section in: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.
One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali
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