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Articolo metodologico

Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine ​​su artropodi per Dispersione ricerca

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DOI:

10.3791/53693

⸱

28 gennaio 2016

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

In questo articolo

Sommario

Le proteine sono spesso utilizzate per marcare gli artropodi per la ricerca sulla dispersione. Vengono dimostrati i metodi per la somministrazione di marcature proteiche interne ed esterne sugli artropodi. Vengono inoltre illustrate le tecniche di rilevamento dei marcatori proteici, sia attraverso saggi di immunoassorbimento enzimatico indiretto che a sandwich (ELISA).

Abstract

È spesso richiesto il monitoraggio movimento artropodi per meglio comprendere dinamiche relative popolazioni, i modelli di dispersione, preferenze pianta ospite, e altre interazioni ecologiche. Gli artropodi sono solitamente monitorati in natura da loro codifica con un segno unico e poi ri-raccogliere loro nel tempo e nello spazio di determinare le loro capacità di dispersione. Oltre ai tag fisici, come polvere o vernice colorata, vari tipi di proteine ​​sono dimostrati molto efficaci per la marcatura per artropodi ricerca ecologica. Le proteine ​​possono essere somministrati internamente e / o esternamente. Le proteine ​​possono poi essere rilevate su artropodi ricatturati con un saggio di immunoassorbimento specifiche proteina enzimatica (ELISA). Qui si descrive protocolli per esternamente ed internamente la codifica artropodi con proteine. Due semplici esempi sperimentali sono dimostrati: (1) un marchio di proteine ​​interno introdotto un insetto fornendo una dieta proteici e (2) un marchio proteina esterna topicamente unapplied di un insetto con un nebulizzatore medico. Abbiamo poi rapportiamo una guida passo-passo del panino e metodi ELISA indiretti impiegati per rilevare segni di proteine ​​sugli insetti. In questa dimostrazione, vari aspetti della acquisizione e l'individuazione di marcatori proteici su artropodi per mark-release-ricattura, mark-cattura, e tipi di auto-mark-cattura di ricerca sono discussi, insieme con i vari modi in cui la procedura immunomarking è stato adattata per una vasta gamma di obiettivi di ricerca.

Introduzione

Registrazione della movimentazione dei parassiti artropodi, nemici naturali (parassitoidi e predatori) e degli impollinatori in natura è essenziale per una migliore comprensione su come migliorare i servizi ecosistemici. La componente chiave per la maggior parte dei tipi di ricerca dispersione sta avendo un metodo affidabile per contrassegnare il artropodi (s) di interesse. Una varietà di materiali (ad esempio, vernici, coloranti, polveri colorate, etichette, elementi rari, proteine) sono stati utilizzati per marcare artropodi per valutare le loro dinamiche di popolazione, capacità di dispersione, l'alimentazione, i comportamenti e altre interazioni ecologiche 1,2.

L'adeguatezza di un marcatore utilizzato per una qualsiasi ricerca dispersione dipenderà dal tipo di studio condotto. Ci sono tre categorizzazioni di massima per marcatura artropodi: (1) mark-release-ricattura (MRR), (2) mark-capture, e (3) auto-mark-capture. Per ricerche mark-release-ricattura, l'investigatore segna in genere i artropodi collettivamente alla laboratory e li rilascia in un punto nel campo centrale. Gli artropodi sono poi ripresi a vari intervalli spaziali e temporali con diversi dispositivi di raccolta (ad esempio, al netto spazzata, il vuoto, appiccicoso trappola) 3,4,5. I campioni ricatturati vengono esaminate per il marchio specifico di distinguere la liberato da individui nativi. Per ricerche mark-cattura, l'investigatore di solito si applica il marchio direttamente nel spruzzo campo usando (per esempio, zaino spruzzatore, braccio e l'ugello spruzzatore). I migliori marcatori per la ricerca mark-cattura sono poco costosi e facilmente applicata al habitat della artropodi. Per la ricerca di auto-mark-capture, l'investigatore si applica di solito segni di un artropode esca 6,7 o nido ingresso 8. A sua volta, il artropodi si contraddistingue all'interno divorando l'esca marcata o esternamente da "spazzolatura" contro il marchio come esce il nido.

Come accennato in precedenza, molti tipi di marcatori ci sono statied al tag una varietà di specie di artropodi. Tuttavia, molto pochi sono utili per tutte e tre queste categorie di ricerca di dispersione. Lo sviluppo della procedura proteine ​​immunomarking era un importante passo avanti per la marcatura insetti. Immunomarking mette un'etichetta di proteine ​​su artropodi sia internamente che esternamente, che, a sua volta, viene rilevato da una specifica immunosorbent assay anti-proteina enzimatica (ELISA). I primi marcatori proteici come usati erano immunoglobulina coniglio (IgG) e IgG pollo / IgY 9,10. Hanno dimostrato di essere i marchi molto efficaci per la MRR e di ricerca di auto-mark-capture (vedi la discussione). Purtroppo, le proteine ​​IgG / IGY sono costosi e non sono quindi pratico per la ricerca mark-cattura e la maggior parte dei tipi di ricerca auto-mark-capture. Successivamente, ELISA di rilevamento di proteine ​​di seconda generazione sono stati sviluppati per le proteine ​​contenute nel albumi pollo (albumina), latte vaccino (caseina) e latte di soia (tripsina proteina inibitrice). Ciascun test è altamente sensibile, specifico, e, piùimportante, utilizza proteine ​​che sono molto meno costoso rispetto alle proteine ​​IgG / IGY 11. Queste proteine ​​si sono dimostrati efficaci per MRR, mark-cattura, e la ricerca di auto-mark-capture (vedi la discussione).

In questo articolo, si descrive e dimostrare come condurre marchio proteina studi di ritenzione di laboratorio. Tali studi sono la prima fase di ricerca necessaria per ogni tipo di studio sul campo dispersione. In particolare, è fondamentale che gli investigatori sanno quanto tempo il marchio sarà mantenuto sulle specie di artropodi bersaglio prima di intraprendere gli studi di campo di dispersione. Qui, descriviamo e dimostrare come contrassegnare internamente ed esternamente insetti per MRR, mark-cattura, e studi di settore di tipo auto-mark-capture. Abbiamo poi dimostrare come rilevare la presenza dei marchi con ELISA indiretta e sandwich.

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Protocollo

1. Mark interno, di conservazione, e procedura di rilevazione

  1. Procedura marcatura interna
    1. Raccogliere insetti di interesse (n ≈ 100 individui) da una colonia di laboratorio allevati con una dieta artificiale o dal campo e dividere in due contenitori di allevamento puliti.
    2. Collocare un normale pacchetto di dieta 20 ml (trattamento di controllo negativo non marcato) in uno dei contenitori. Supplemento un secondo 20 ml pacchetto dieta artificiale con 1,0 ml di una / IgG pollo ml di soluzione 1,0 mg / IgY, mescolare accuratamente, e inserirlo in un altro contenitore.
      Nota: se l'insetto di interesse non ha una dieta artificiale, il marchio può essere posizionato su o in qualunque dieta sono normalmente sostenuti su (ad esempio, fagiolini, uova falena, acqua, zucchero, miele).
    3. Consentire agli insetti di riprendere la loro attività di alimentazione per 24 ore.
  2. Marchio interno Procedura ritenzione
    1. Rimuovere i pacchetti di dieta di ogni contenitore e fornire gli insetti with un'altra fonte di cibo per sostenerli tutta la durata dell'esperimento (ad esempio, fagiolini).
    2. Raccogliere una coorte (n = 20) di insetti giornaliera (o in qualsiasi intervallo di tempo desiderato) da ciascun trattamento e congelare immediatamente a -20 ° C.
  3. Sandwich procedura ELISA
    1. Aggiungere 50 ml di coniglio anti-pollo IgY anticorpo primario diluito 1: 500 in Tris Buffered Saline (TBS) a ciascun pozzetto di una micropiastre ELISA pulito e incubare per un minimo di 1 ora a temperatura ambiente (nota: i micropiastre può anche essere incubate O / N a 4 ° C).
    2. Scartare l'anticorpo dalla piastra e bloccare ogni pozzetto con 300 ml di una soluzione non grasso secco 1,0% per 30 min.
    3. In attesa che le fasi di incubazione precedenti, posizionare insetti congelati singolarmente in 1,6 ml microprovette con 1,0 ml di TBS.
    4. Grind ogni insetto con un pestello pulito fino al completo omogeneizzato e aggiungere 100 ml di ciascun campione di un bene individuale del ELISApiatto. Lasciare i campioni incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
    5. Aggiungere 100 pl di negativo (solo TBS) e positivi (albumi in TBS) controlli nei pozzetti nella prima colonna di ciascuna piastra ELISA. Inoltre, aggiungere 100 ml di controlli negativi insetti (insetti non marcati) per le 8 pozzetti nell'ultima colonna di ciascuna piastra (Figura 1). Lasciare i campioni di controllo per incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Si noti che il modello fornito nella figura 1 è il modello che utilizziamo per i nostri test standardizzati. Il posizionamento dei campioni nei pozzetti è a discrezione del ricercatore.
    6. Lavare i pozzetti tre volte con tampone fosfato salino (PBS) -tween e poi aggiungere 50 ml di IgG di coniglio anti-pollo / IgY coniugato con perossidasi diluito 1: 10.000 in 1% soluzione di latte e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    7. Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e aggiungere 50 ml di tetrametilbenzidina (TMB) substrato in ogni pozzetto.
    8. Dopo 10 min, leggere i pozzetticon uno spettrofotometro per micropiastre impostato alla lunghezza d'onda di 650 nm.

figure-protocol-1
Figura 1. Un diagramma schematico che illustra le denominazioni e standardizzati utilizzati per un tipico 96 ben ELISA micropiastra. Ciascuna piastra contiene 7 pozzetti dedicate ai controlli negativi salina tamponata con Tris (TBS), un pozzo dedicato a un controllo positivo proteine ​​(Pos Ctrl), 80 singoli pozzetti dedicati agli insetti ricatturati (campione 1 ... 80), e 8 pozzetti dedicati alla non marcati (negativi) di controllo degli insetti (Neg Ctrl 1 ... 8). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Mark esterno, di conservazione, e procedura di rilevazione

  1. Procedura marcatura esterna
    1. Raccogliere insetti di interesse (n ≈ 100individui) da una colonia laboratorio o dal campo e posto in due contenitori di plastica 1.0 L con un foro di diametro 2.5 cm perforato del lato di ciascun contenitore.
    2. Spray insetti nel primo contenitore con 1,0 ml di dH 2 O (trattamento di controllo negativo) utilizzando un nebulizzatore medico. Spray insetti nel secondo contenitore con 1,0 ml di una soluzione 5,0% di albumi pollo usando un nebulizzatore medico.
    3. Attaccare il tubo del nebulizzatore ad una presa d'aria di laboratorio standard e quindi inserire la bocca del nebulizzatore nel foro 2.5 cm del contenitore. Quindi, accendere l'uscita dell'aria gradualmente fino il nebulizzatore produce un vapore.
    4. Continuare a spruzzo (marcatura) fino a quando la soluzione albumi è stato erogato (ca. 2-5 minuti).
    5. Rimuovere il nebulizzatore e posizionare un tappo nel foro del contenitore di plastica. Lasciare gli insetti di stare a temperatura ambiente fino a quando la soluzione si è asciugato completamente.
  2. Contrassegno esterno Procedura ritenzione
    1. Mettere ogni trattamento degli insetti secchi in un contenitore pulito allevamento separato per evitare ulteriore esposizione al marchio.
    2. Aggiungere cibo e acqua ai contenitori puliti per sostenere gli insetti per tutta la durata dello studio.
    3. Raccogliere una coorte (n = 20) di insetti di ogni trattamento giornaliero e congelare immediatamente a -20 ° C.
  3. Procedura indiretta ELISA
    1. Posizionare gli insetti congelati singolarmente in 1,6 ml microprovette e aggiungere 1,0 ml di TBS.
    2. Mettere a bagno i campioni per 1 ora su un set agitatore orbitale a 120 giri al minuto.
    3. Aggiungere i controlli negativi e positivi come descritto al punto 1.3.5.
    4. Dopo l'immersione, pipettare un'aliquota di 100 microlitri di ciascun campione in uno dei 80 pozzetti del campione designati su un nuovo 96 pozzetti ELISA come mostrato in Figura 1 consentire ai campioni di incubare per 1 ora a RT (nota:. Micropiastra può anche essere incubati O / N a 4 ° C).
    5. Lavare i pozzetti tre volte conPBS-Tween e poi aggiungere 300 ml di tampone fosfato salino contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA PBS-) a ciascun pozzetto.
    6. Dopo 30 min a RT lavare due volte con PBS-Tween.
    7. Aggiungere 50 ml di coniglio anti-albumina d'uovo anticorpo primario diluito 1: 8000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) in ogni pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    8. Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e poi aggiungere 50 ml di IgG anti-coniglio di capra coniugato con perossidasi diluito 1: 2000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) per 1 ora a temperatura ambiente.
    9. Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e aggiungere 50 ml di substrato TMB in ogni pozzetto.
    10. Dopo 10 min, leggere i pozzetti con uno spettrofotometro per micropiastre impostato alla lunghezza d'onda di 650 nm.

Analisi 3. Dati

  1. Calcolare il valore medio delle 8 insetti di controllo negativo su ogni piastra ELISA e poi calcolare la deviazione standard in base ai controlli negativi pool from tutte le piastre ELISA di un dato studio 12.
  2. Aggiungere sei volte la deviazione standard aggregata al medio ottenuto per ogni piastra ELISA per ottenere un valore di soglia positivo ELISA. Ogni campione insetto ottenendo un valore di assorbanza uguale o superiore a questo valore è considerato positivo per la presenza del marchio proteine.

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Risultati

Interno marcatura:

I risultati del test di ritenzione contrassegno interno sono mostrati nella Figura 2A. Il test ELISA valore di soglia critica calcolato era 0,054. Nel complesso (tutte e quattro le date seguenti combinati), gli insetti trattati senza proteine ​​hanno prodotto valori costantemente bassi ELISA (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Al contrario, tutti gli inset...

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Discussione

La procedura immunomarking proteina artropodi è stato descritto quasi un quarto di secolo fa 9. Da allora, la procedura è stato adattato per studiare i modelli di dispersione di una vasta gamma di artropodi utilizzando sia internamente che esternamente amministrati IgG / IgYs. Queste proteine ​​sono rivelati marcatori risoluti per la grande varietà di specie di insetti testati finora. Tuttavia, come già detto, la principale limitazione per l'utilizzo di IgG / IgYs è che sono molto costosi. Di conseguenza,...

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Dichiarazioni

Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

Ringraziamenti

Il finanziamento è stato fornito da USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, in parte, dalla dell'agricoltura e dell'alimentazione iniziativa di assegno di ricerca competitiva no. 2011-67009-30141 dal National Institute USDA di alimentazione e l'agricoltura. Siamo grati per il supporto tecnico di Johanna Nassif. Ringraziamo anche Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff per la fornitura di alcune delle immagini usate in figura 3.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Contenitore per alimenti (per l'allevamento di insetti)Rubbermaid/TupperwareVarie dimensioniVari produttori e venditori. Il tessuto a rete è incollato in una finestra
Nebulizzatore di piccolo volume (Micro Mist)Teleflex-Hudson RCI1881Disponibile online e nei negozi di forniture mediche. Anche altre marche funzioneranno.
Provette per microcentrifuga, 1,6 ml con tappoContinental Lab Products4445.XQualsiasi tipo simile funzionerà. Preferiamo le marche che hanno coperchi facili da aprire.
Scatola di stoccaggio in polistirolo per provette per microcentrifuga (griglia 5x20)RPI Corp.145746Questo design è bello perché non affolla i tubi.
Dispenser, ripetitoreEppendorf4982000322Qualcosa di simile aiuterà a velocizzare l'erogazione.
Pestelli, smerigliatrici per fazzoletti usa e getta in plastica, 1,5 mlKimble Chase749521-1500Disponibile con vari fornitori. I pestelli possono essere puliti e sterilizzati in autoclave per il riutilizzo.
Piastre ELISA BD Falcon, 96 pozzetti (fondo piatto)Pipetta BD351172
Ovation, manuale (20-200 &; l)VistaLab1057-0200 o 1070-0200Qualsiasi tipo simile funzionerà. Questo modello è ergonomico.
Serbatoi, reagente sterileVistaLab4054-1000Qualcosa di simile funzionerà.
Pipetta elettronica, 8 canali (50-1.200 &; micro; l) (Biohit eLine)Sartorius730391Se dovessi scegliere un modello elettronico, questa dimensione è molto utile.
Pipetta elettronica, 8 canali (10-300 & micro; l) (Biohit eLine)Sartorius730361Qualsiasi cosa simile funzionerà.
Colletto, rondella per piastre multipozzetto (8 posizioni, diritta)Sigma-AldrichZ369802 Qualcosa di simile funzionerà per il lavaggio manuale delle lastre.
Lettore di micropiastre con rilevamento dell'assorbanzaMolecular DevicesSpectraMax 250Qualsiasi cosa simile funzionerà.
Pollo IgG/IgYStati Uniti BiologicoI1903-15RDisponibile anche da altre fonti
Albumi d'uovo Negozio dialimentari" Tutti bianchi", " Frulli", ecc.Mescolare 5 ml con 95 ml dH2O per soluzione al 5%
Tris (Trizma Base)Sigma-AldrichT15032,42 g/L per fare TBS
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS988829,22 g/L per fare TBS e 8.0  g⁠/⁠ L per PBS
Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS08761,14 g/L per PBS
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)Sigma-AldrichP56550,2 g/L per PBS
Cloruro di potassio (KCl)Sigma-AldrichP95410,2 g/L per PBS
Tween 20, Grado EIASigma-AldrichP1379Aggiungere 0,5 ml per L a PBS dopo che i sali sono stati disciolti.
PBS con 1% BSASigma-AldrichP3688Mix 1 bustina in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (molecola intera) anticorpo prodotto nel coniglio (1:500)Sigma-AldrichC6409Mix 100 &; l in 50 ml TBS
Latte in polvere, latte in polvere o fresco (1%)diMescolare 10 g con 1 L dH2O per soluzione all'1%
Anti-pollo IgY (IgG) (molecola intera)-Anticorpo perossidasi prodotto nel coniglio (1:10.000)Sigma-AldrichA9046Mix 100 &; l in 1 L di latte
Anti-uovo di gallina Anticorpo all'albumina prodotto nel coniglio (1:8.000)Sigma-AldrichC6534Diluire 125 &; l in 1 L PBS-BSA
Capra Anti-Coniglio Perossidasi Perossidasi (1:2.000)Sigma-AldrichA6154Diluire 0,5 ml in 1 L PBS-BSA, quindi aggiungere 1,3  ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolimero silicio-polietereLehle SeedsVIS-01Aggiungere come ultimo ingrediente
TMB Microwell Substrato di perossidasi monocomponenteSurModicsTMBW-1000-01
Negozio alimentari

Riferimenti

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