Amministrazione e Rilevamento di segni di proteine ​​su artropodi per Dispersione ricerca

Summary

Le proteine sono spesso utilizzate per marcare gli artropodi per la ricerca sulla dispersione. Vengono dimostrati i metodi per la somministrazione di marcature proteiche interne ed esterne sugli artropodi. Vengono inoltre illustrate le tecniche di rilevamento dei marcatori proteici, sia attraverso saggi di immunoassorbimento enzimatico indiretto che a sandwich (ELISA).

Abstract

È spesso richiesto il monitoraggio movimento artropodi per meglio comprendere dinamiche relative popolazioni, i modelli di dispersione, preferenze pianta ospite, e altre interazioni ecologiche. Gli artropodi sono solitamente monitorati in natura da loro codifica con un segno unico e poi ri-raccogliere loro nel tempo e nello spazio di determinare le loro capacità di dispersione. Oltre ai tag fisici, come polvere o vernice colorata, vari tipi di proteine ​​sono dimostrati molto efficaci per la marcatura per artropodi ricerca ecologica. Le proteine ​​possono essere somministrati internamente e / o esternamente. Le proteine ​​possono poi essere rilevate su artropodi ricatturati con un saggio di immunoassorbimento specifiche proteina enzimatica (ELISA). Qui si descrive protocolli per esternamente ed internamente la codifica artropodi con proteine. Due semplici esempi sperimentali sono dimostrati: (1) un marchio di proteine ​​interno introdotto un insetto fornendo una dieta proteici e (2) un marchio proteina esterna topicamente unapplied di un insetto con un nebulizzatore medico. Abbiamo poi rapportiamo una guida passo-passo del panino e metodi ELISA indiretti impiegati per rilevare segni di proteine ​​sugli insetti. In questa dimostrazione, vari aspetti della acquisizione e l'individuazione di marcatori proteici su artropodi per mark-release-ricattura, mark-cattura, e tipi di auto-mark-cattura di ricerca sono discussi, insieme con i vari modi in cui la procedura immunomarking è stato adattata per una vasta gamma di obiettivi di ricerca.

Introduction

Registrazione della movimentazione dei parassiti artropodi, nemici naturali (parassitoidi e predatori) e degli impollinatori in natura è essenziale per una migliore comprensione su come migliorare i servizi ecosistemici. La componente chiave per la maggior parte dei tipi di ricerca dispersione sta avendo un metodo affidabile per contrassegnare il artropodi (s) di interesse. Una varietà di materiali (ad esempio, vernici, coloranti, polveri colorate, etichette, elementi rari, proteine) sono stati utilizzati per marcare artropodi per valutare le loro dinamiche di popolazione, capacità di dispersione, l'alimentazione, i comportamenti e altre interaz....

Protocol

1. Mark interno, di conservazione, e procedura di rilevazione

1. Procedura marcatura interna
   1. Raccogliere insetti di interesse (n ≈ 100 individui) da una colonia di laboratorio allevati con una dieta artificiale o dal campo e dividere in due contenitori di allevamento puliti.
   2. Collocare un normale pacchetto di dieta 20 ml (trattamento di controllo negativo non marcato) in uno dei contenitori. Supplemento un secondo 20 ml pacchetto dieta artificiale con 1,0 ml di una / IgG pollo ml di soluzione 1,0 mg / IgY, mescolare accuratamente, e inserirlo in un altro contenitore.
      Nota: se l'insetto di interesse non ha una dieta artificiale,....

Results

Interno marcatura:

I risultati del test di ritenzione contrassegno interno sono mostrati nella Figura 2A. Il test ELISA valore di soglia critica calcolato era 0,054. Nel complesso (tutte e quattro le date seguenti combinati), gli insetti trattati senza proteine ​​hanno prodotto valori costantemente bassi ELISA (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Al contrario, tutti gli inset.......

Discussion

La procedura immunomarking proteina artropodi è stato descritto quasi un quarto di secolo fa ^9. Da allora, la procedura è stato adattato per studiare i modelli di dispersione di una vasta gamma di artropodi utilizzando sia internamente che esternamente amministrati IgG / IgYs. Queste proteine ​​sono rivelati marcatori risoluti per la grande varietà di specie di insetti testati finora. Tuttavia, come già detto, la principale limitazione per l'utilizzo di IgG / IgYs è che sono molto costosi. Di conseguenza, IgG.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Contenitore per alimenti (per l'allevamento di insetti)	Rubbermaid/Tupperware	Varie dimensioni	Vari produttori e venditori. Il tessuto a rete è incollato in una finestra
Nebulizzatore di piccolo volume (Micro Mist)	Teleflex-Hudson RCI	1881	Disponibile online e nei negozi di forniture mediche. Anche altre marche funzioneranno.
Provette per microcentrifuga, 1,6 ml con tappo	Continental Lab Products	4445.X	Qualsiasi tipo simile funzionerà. Preferiamo le marche che hanno coperchi facili da aprire.
Scatola di stoccaggio in polistirolo per provette per microcentrifuga (griglia 5x20)	RPI Corp.	145746	Questo design è bello perché non affolla i tubi.
Dispenser, ripetitore	Eppendorf	4982000322	Qualcosa di simile aiuterà a velocizzare l'erogazione.
Pestelli, smerigliatrici per fazzoletti usa e getta in plastica, 1,5 ml	Kimble Chase	749521-1500	Disponibile con vari fornitori. I pestelli possono essere puliti e sterilizzati in autoclave per il riutilizzo.
Piastre ELISA BD Falcon, 96 pozzetti (fondo piatto)	Pipetta BD	351172
Ovation, manuale (20-200 &; l)	VistaLab	1057-0200 o 1070-0200	Qualsiasi tipo simile funzionerà. Questo modello è ergonomico.
Serbatoi, reagente sterile	VistaLab	4054-1000	Qualcosa di simile funzionerà.
Pipetta elettronica, 8 canali (50-1.200 &; micro; l) (Biohit eLine)	Sartorius	730391	Se dovessi scegliere un modello elettronico, questa dimensione è molto utile.
Pipetta elettronica, 8 canali (10-300 & micro; l) (Biohit eLine)	Sartorius	730361	Qualsiasi cosa simile funzionerà.
Colletto, rondella per piastre multipozzetto (8 posizioni, diritta)	Sigma-Aldrich	Z369802	Qualcosa di simile funzionerà per il lavaggio manuale delle lastre.
Lettore di micropiastre con rilevamento dell'assorbanza	Molecular Devices	SpectraMax 250	Qualsiasi cosa simile funzionerà.
Pollo IgG/IgY	Stati Uniti Biologico	I1903-15R	Disponibile anche da altre fonti
Albumi d'uovo Negozio di	alimentari	" Tutti bianchi", " Frulli", ecc.	Mescolare 5 ml con 95 ml dH2O per soluzione al 5%
Tris (Trizma Base)	Sigma-Aldrich	T1503	2,42 g/L per fare TBS
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	29,22 g/L per fare TBS e 8.0  g⁠/⁠ L per PBS
Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	1,14 g/L per PBS
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	0,2 g/L per PBS
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	0,2 g/L per PBS
Tween 20, Grado EIA	Sigma-Aldrich	P1379	Aggiungere 0,5 ml per L a PBS dopo che i sali sono stati disciolti.
PBS con 1% BSA	Sigma-Aldrich	P3688	Mix 1 bustina in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (molecola intera) anticorpo prodotto nel coniglio (1:500)	Sigma-Aldrich	C6409	Mix 100 &; l in 50 ml TBS
Latte in polvere, latte in polvere o fresco (1%)	di		Mescolare 10 g con 1 L dH2O per soluzione all'1%
Anti-pollo IgY (IgG) (molecola intera)-Anticorpo perossidasi prodotto nel coniglio (1:10.000)	Sigma-Aldrich	A9046	Mix 100 &; l in 1 L di latte
Anti-uovo di gallina Anticorpo all'albumina prodotto nel coniglio (1:8.000)	Sigma-Aldrich	C6534	Diluire 125 &; l in 1 L PBS-BSA
Capra Anti-Coniglio Perossidasi Perossidasi (1:2.000)	Sigma-Aldrich	A6154	Diluire 0,5 ml in 1 L PBS-BSA, quindi aggiungere 1,3  ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolimero silicio-polietere	Lehle Seeds	VIS-01	Aggiungere come ultimo ingrediente
TMB Microwell Substrato di perossidasi monocomponente	SurModics	TMBW-1000-01