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Articolo metodologico

Sintesi di Thermogelling poli (N-isopropilacrilammide) -graft-condroitin solfato compositi con alginato microparticelle per ingegneria dei tessuti

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DOI:

10.3791/53704

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26 ottobre 2016

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1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

In questo articolo

Sommario

Un iniettabili impalcatura ingegneria tissutale composta da poli (N-isopropilacrilammide) solfato -graft-condroitina (PNIPAAm-g-CS) contenenti, microparticelle di alginato è stato preparato. La forza adesiva, gonfiore proprietà e in biocompatibilità vitro vengono analizzati in questo studio. Le tecniche di caratterizzazione sviluppate qui possono essere applicabili ad altri sistemi thermogelling.

Abstract

Biomateriali iniettabili sono definiti come materiali impiantabili che possono essere introdotte nel corpo come un liquido e solidificano in situ. Tali materiali offrono i vantaggi clinici di essere impiantati minimamente invasivo e facilmente formare solidi spazio-riempimento in difetti di forma irregolare. biomateriali iniettabili sono stati ampiamente studiati come scaffold per l'ingegneria tissutale. Tuttavia, per la riparazione di alcune zone portanti nel corpo, quale il disco intervertebrale, scaffold dovrebbero possedere proprietà adesive. Ciò minimizza il rischio di lussazione durante il movimento e assicurare un contatto intimo con il tessuto circostante, fornendo adeguata trasmissione delle forze. Qui, descriviamo la preparazione e caratterizzazione di un ponteggio composto termicamente poli sensibili (N-isopropilacrilammide) solfato -graft-condroitina (PNIPAAM-g-CS) e microparticelle di alginato. Il copolimero PNIPAAm-g-CS forma una soluzione viscosa in acqua a temperatura ambiente, in cui alginate le particelle sono sospese per migliorare l'adesione. Sopra la temperatura della soluzione critica inferiore (LCST), circa 30 ° C, il copolimero forma un gel solido intorno alle microparticelle. Abbiamo adattato procedure biomateriali caratterizzazione tipo per tener conto della transizione di fase reversibile PNIPAAm-g-CS. I risultati indicano che l'incorporazione di particelle di alginato / ml 50 o 75 mg in 5% (w / v) soluzioni PNIPAAm-g-CS quadruplicare la forza adesiva alla trazione di PNIPAAm-gCS alone (p <0.05). L'incorporazione di microparticelle di alginato incrementa notevolmente la capacità di rigonfiamento PNIPAAm-g-CS (p <0,05), contribuendo a mantenere un gel che riempiono lo spazio all'interno difetti del tessuto. Infine, i risultati della vitro tossicologia kit in assay, 2,3-bis- (2-metossi-4-nitro-5-solfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxanilide (XTT) e test di vitalità Live / Morto indicano che il adesivo è in grado di supportare la sopravvivenza e la proliferazione di incapsulato rene embrionale umano (HEK) 293 cells oltre 5 giorni.

Introduzione

Biomateriali iniettabili sono quelli che possono essere presentate convenientemente nel corpo come un liquido e solidificare in situ. Tali materiali sono stati applicati estesamente nella medicina rigenerativa, dove sono utilizzati per fornire cellule incapsulate al sito interessato 1-4 e fungere da matrice extracellulare temporanea tridimensionale per le celle 5. Per il paziente, biomateriali iniettabili sono vantaggiosi in quanto le procedure chirurgiche per l'impianto sono minimamente invasiva e la fase solida può riempire di forma irregolare difetti del tessuto, eliminando la necessità per gli impianti di formato personalizzato.

Iniettabilità può essere realizzato attraverso una varietà di meccanismi. Fattori esterni, come pH, sono state studiate come innesco per la formazione di gel che incapsulano cellule e molecole bioattive 6-8. Tuttavia, pH non può essere la causa più comodo da usare in tutti gli ambienti fisiologici. Un altro alterna tradizionaletivo per realizzare iniettabilità utilizza in situ polimerizzazione chimica o reticolazione. Un gruppo ha sviluppato un sistema redox idrosolubile composta di persolfato di ammonio e N, N, N -tetramethylethylenediamine ', N' e utilizzato per reagire macromeri composti di glicole polietilene e poli (propilene) glicole 9,10. Zan et al. 11 reti sviluppate iniettabili chitosano polivinilalcool reticolati con glutaraldeide. In tali sistemi, la citotossicità dei componenti reattivi deve essere considerato, in particolare per applicazioni che prevedono l'incapsulamento delle cellule. Inoltre, polimerizzazione esotermica potrebbe produrre alte temperature sufficienti a compromettere il tessuto circostante, che è stato segnalato per l'osso polimerico cementi 12,13.

Ancora altri sistemi polimerici iniettabili sono stati sviluppati che presentano un cambiamento dal liquido allo stato solido con temperatura del grilletto. Conosciuto come sistemi thermogelling, questi sono aqueonoi soluzioni polimeriche che non richiedono chimici stimolo, monomeri o reticolanti per ottenere formazione in situ 14. Piuttosto, una transizione di fase solito si verificano a temperatura fisiologica induce la formazione di un reticolo tridimensionale fisicamente reticolato. Poloxamers quali Pluronic F127 sono tra i polimeri più ampiamente studiato per la somministrazione di farmaci thermogelling 15-17 e cellule incapsulamento 18,19. Tuttavia, è ben accettato che questi gel mancano stabilità alle condizioni fisiologiche. Gli studi hanno dimostrato una maggiore stabilità con estensori di catena 20 o reticolanti chimici 21,22. Tuttavia, l'uso di questi reagenti può limitare il potenziale dei materiali per incapsulamento della pila.

Poli (N-isopropilacrilammide) è un polimero sintetico thermogelling che ha ricevuto notevole attenzione in ingegneria dei tessuti e Drug Delivery 14. Le soluzioni acquose di poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) presentano una temperatura più bassa soluzione critica (LCST), di solito si verificano intorno a 32 - 34 ° C 23,24. Sotto il LCST, acqua idrata catene PNIPAAm. Sopra la temperatura di transizione, il polimero diventa idrofoba, causando un drammatico separazione di fase 25-27 e formazione di un gel solido senza l'uso di monomeri tossici o reticolanti. Tuttavia, omopolimeri PNIPAAm mostrano scarse proprietà elastiche e tengono po 'd'acqua a temperatura fisiologica a causa di idrofobicità 28. In questo lavoro, abbiamo scelto di integrare condroitin solfato covalente nella rete PNIPAAm, che offre la possibilità di degradabilità enzimatica 29, attività anti-infiammatoria 30,31, e una maggiore acqua e l'assorbimento dei nutrienti 32. copolimeri PNIPAAm con CS sono stati preparati nel nostro laboratorio mediante la polimerizzazione del monomero NIPAAm in presenza di metacrilato-funzionalizzato CS per formare copolimero graffato (PNIPAAm-g-CS). because della bassa densità di reticolazione del copolimero, PNIPAAm-g-CS forma una soluzione viscosa in acqua a temperatura ambiente e un gel elastico a temperatura fisiologica causa della LCST 29. Le soluzioni polimeriche diventano fluido nuovo per raffreddamento sotto la LCST dovuta alla reversibilità della transizione.

Abbiamo dimostrato che PNIPAAm-g-CS ha il potenziale per funzionare come un impalcatura ingegneria dei tessuti, a causa delle proprietà meccaniche che possono essere adattati, degradabilità e citocompatibilità con reni embrionali umane (HEK) 293 cellule 29. Tuttavia, in alcune zone portanti, come il disco intervertebrale, tessuto scaffold ingegneria dovrebbero avere la capacità di formare una interfaccia sostanziale con tessuto discale circostante per eliminare il rischio di lussazione 33. Questa interfaccia è necessaria anche per un'adeguata trasmissione della forza attraverso l'interfaccia tra l'impianto e il tessuto 33. Nel nostro lavoro, abbiamo sospeso unmicroparticelle lginate in soluzioni acquose di PNIPAAm-g-CS e ha scoperto che la gelificazione localizza le microparticelle, che forniscono l'adesione con il tessuto circostante 34. In questo lavoro, si delineano i passaggi per la preparazione del thermogelling, polimero adesivo. tecniche standard per biomateriali caratterizzazione, imaging cellulare, e saggi di redditività sono stati adattati per tener conto della sensibilità alla temperatura del polimero e la reversibilità della transizione di fase. Il polimero iniettabile descritto in questo documento ha un ampio potenziale per le applicazioni di consegna della droga e ingegneria dei tessuti al di fuori di quelle descritte in questo documento. Inoltre, i metodi di caratterizzazione qui descritti possono essere applicabili ad altri sistemi thermogelling.

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Protocollo

1. Poli (N-isopropilacrilammide) -g-condroitin solfato Sintesi

  1. Prima della sintesi del idrogel bioadesivo, purificare N-isopropilacrilammide (NIPAAm) monomero e solfato di condroitina metacrilato (CS).
    1. Pesare almeno 10 g di NIPAAm e sciogliere il monomero in 400 ml di n-esano a 60 ° C. Mescolare il contenitore periodicamente fino a completa dissoluzione. Ricristallizzare la soluzione in un congelatore C -20 ° per 24 ore.
    2. Rimuovere il monomero cristallizzato dal filtro contenitore e sotto vuoto, la n-esano usando un imbuto Buchner. Posizionare il monomero in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente per 24 ore per eliminare qualsiasi traccia n-esano. Conservare il monomero in un congelatore C -20 ° per un uso successivo (vedi punto 1.2).
    3. Pesare e sciogliere 2,0 g di condroitin solfato in 8,0 ml di acqua deionizzata. riscaldare delicatamente la soluzione a 60 ° C.
    4. Regolare il pH della soluzione a 10 utilizzando circa 10 a 40 ml di 50% (w / w) NaOH.
    5. Aggiungere 0,298 ml di anidride metacrilica (MA). Riflusso per 24 ore, sotto agitazione a 60 ° C.
    6. Versare 400 ml di soluzione di acetone in un vaso e freddo O / N in un congelatore C -20 °.
    7. Dopo 24 ore sono trascorsi, versare lentamente l'intera soluzione metacrilato CS (MCS) in 400 ml di acetone freddo, mescolando con un bastoncino magnetico.
    8. Rimuovere la Mcs dal acetone e mettere il precipitato in una stufa a vuoto. Eseguire questo passaggio rapidamente per mantenere uno stato integro e coerente per MCS. Consentire l'acetone residuo di evaporare sotto vuoto per almeno 24 ore.
  2. Co-sciogliere 10 g di purificato NIPAAm e 2.209 g di MCS in 232 ml di acqua deionizzata.
  3. Eliminare la soluzione di ossigeno utilizzando gas inerte di azoto. Mantenere una portata di gas ancora bassa vigorosa per impedire la soluzione dal traboccante per 15 min.
  4. Continuare spurgo la soluzione con azoto e aggiungere 0,976 ml di tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Successivamente, iniziare la reazione di polimerizzazione mescolando 97,6 mg di ammonio persolfato (APS).
  6. Miscelare la soluzione per circa 20 sec e sigillare rapidamente la soluzione per evitare qualsiasi ingresso di aria nel recipiente. Lasciare che la soluzione per polimerizzare sotto la luce fluorescente per 24 ore.
  7. Dopo 24 ore, collocare il recipiente di reazione in un forno a 37 ° C. Consentire l'idrogel passaggio da un liquido ad uno stato simile a gel. Immergere l'idrogel polimerizzato in 1X tampone fosfato salino (PBS) per un totale di 7 giorni per consentire la diffusione del monomero non reagito dalla idrogel.
  8. Utilizzando un paio di forbici, tagliare l'idrogel in tanti piccoli pezzi, non più di 5 cm di diametro. Per evitare che l'idrogel da transizione da uno stato simile a gel ad un liquido, dadini il polimero all'interno della soluzione 37 ° C PBS. Trasferire le porzioni in 50 ml provette coniche.
  9. Preparare i campioni per liofilizzazione avvolgendo le cime dii tubi con Kimwipes e elastici. Bloccare le provette a -70 ° C per 1 a 2 ore.
  10. Posizionare i tubi conici sulla liofilizzatore per rimuovere tutta l'acqua dalla idrogel. Prima dell'uso, il liofilizzatore deve raggiungere una temperatura e pressione di circa -40 ° C e 0,04 mbar rispettivamente. è richiesto un minimo di 7 giorni per la completa asciugatura.
  11. Macinare il liofilizzato di polimero in una polvere fine e conservare in frigorifero a 4 ° C per un uso successivo (vedi punto 3.1).

2. Calcio-alginato reticolato microparticelle di sintesi

  1. Preparare un 2% (w / v) soluzione di alginato sciogliendo 400 mg in 20 ml di acqua deionizzata. Riscaldare la soluzione a circa 60 ° C per facilitare la dissoluzione.
  2. Preparare un 2% (w / v) di cloruro di calcio con l'aggiunta di 400 mg di 20 ml di acqua deionizzata.
  3. Creare un olio in miscela acqua combinando 100 ml di olio di canola, 1,0 ml di Tween 20 e 20 mldel 2% (w / v) alginato. Emulsionare la miscela per 10 minuti con un omogeneizzatore a 15.000 rpm. Inoltre, mescolare con un ancoretta magnetica a 200 giri al minuto o 2.000 rpm per creare grandi o piccole microparticelle, rispettivamente.
  4. Aspirare il 2% (w / v) di cloruro di calcio usando una siringa con una G punta 18 dell'ago. Aggiungere lentamente il cloruro di calcio goccia a goccia in emulsione.
  5. Una volta che i 20 ml di cloruro di calcio sono state esaurite, permettere alle microparticelle all'interno dell'emulsione di reticolare per 10 min.
  6. Distribuire uniformemente il lotto di microparticelle in capped 50 ml provette coniche e centrifugare a una forza di 1.400 xg per 2 minuti per rimuovere il primo strato di olio di canola.
  7. Consecutivamente lavaggio, vortex e centrifugare le microparticelle con isopropanolo un totale di tre volte a 1,400 g per 2 minuti per rimuovere l'olio di canola residuo. Eliminare il surnatante isopropanolo dopo ogni fase di centrifugazione e lavare con isopropanolo fresca.
  8. Una volta che il oil è stato rimosso, ripetere la procedura di lavaggio altre tre volte con acqua deionizzata per rimuovere eventuali residui isopropanolo. Eliminare il surnatante acqua deionizzata dopo ogni fase di centrifugazione e lavare con acqua fresca deionizzata. Rimuovere circa 100 mg di microparticelle bagnate e conservare in un flaconcino. Le microparticelle bagnate saranno utilizzati per misurare il diametro medio della partita mediante microscopia ottica.
    1. Utilizzando microscopio ottico, disperdere un piccolo campione di microparticelle bagnato in acqua deionizzata su un vetrino da microscopio. A seconda delle dimensioni delle microparticelle, utilizzare un obiettivo 10X o 20X, e regolare l'apertura numerica fino a quando le particelle vengono messi a fuoco. Assicurarsi che il microscopio è calibrato per l'obiettivo corretta e regolare la luminosità della sorgente luminosa come necessario. Utilizzare uno strumento linea per misurare il diametro più lungo di 50 microparticelle alginato casuale e ottenere una dimensione media per il lotto.
  9. Preparare le microparticelle di liofilizzazione By avvolgendoli con Kimwipes e fissandoli con elastici. Bloccare le microparticelle a -70 ° C per 1 ora.
  10. Posizionare le microparticelle sulla liofilizzatore e consentire il campione asciugare per almeno 24 ore. Macinare il congelamento microparticelle secchi in una polvere fine con un mortaio e pestello e conservare in frigorifero a 4 ° C per un uso successivo (vedi punto 3.3).

3. Preparazione degli adesivi

  1. Usando il polimero in polvere liofilizzata, creare un 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS sciogliendo 50 mg di polvere di idrogel in 1 ml di PBS 1x.
  2. Mescolare la soluzione con un vortex e raffreddare in frigorifero a 4 ° C per 24 ore.
  3. Una volta che le forme soluzione viscosa, creare un composito omogeneo aggiungendo 25 o 50 mg di liofilizzati microparticelle di alginato alla soluzione idrogel e vortex. Conservare il composto in frigorifero a 4 ° C per un uso successivo (vedere i passi 4.3 e 4.8).

4. bio-adesivi MechTest di trazione bina

  1. Prima di eseguire prove di trazione, estrarre substrato cartilagine da un orecchio di maiale.
    1. Sbrinare un orecchio di maiale in un ambiente caldo dello 0,9% (w / v) di NaCl; questo aiuterà ad allentare il tessuto.
    2. Usando un bisturi, isolare e sezionare una TV, un'area rettangolare tagliando verticalmente se lo strato epidermico, tessuto sottocutaneo, e la cartilagine. Evitare di tagliare le creste curve dell'orecchio suina.
    3. Separare lo strato epidermico della pelle dalla cartilagine tagliando parallelo attraverso il tessuto sottocutaneo. La cartilagine è un tessuto duro, bianco trovato sotto la pelle suina.
    4. raschiare delicatamente il tessuto sottocutaneo che è collegato alla cartilagine con il lato del bisturi. Evitare di tagliare nel tessuto cartilagineo con il bisturi.
    5. Assicurarsi che solo un lato della cartilagine è esposto e piatta durante la prova di trazione. Se necessario, appiattire la cartilagine tagliando la pelle non uniforme sul lato inferiore.
    6. Tagliare il tessuto cartilagineo in diversi pezzi con dimensioni di 1 cm x 1 cm. Conservare il tessuto cartilagineo in provette coniche riempiti con 0,9% (w / v) di NaCl in un -20 ° C freezer.
  2. Preparare 2,0 L di 0,9% (w / v) di NaCl. Pre-riscaldare la soluzione salina a 37 ° C. La temperatura di questa soluzione dovrà essere mantenuto per tutto il test.
  3. Scongelare la cartilagine congelato. Mantenere sia la cartilagine suina ei campioni idrogel in un contenitore di polistirolo con impacchi di ghiaccio.
  4. Attaccare il dinamometro al braccio del banco di prova. Posizionare una piastra sulla parte superiore del basamento forza e impostare la temperatura a 50 ° C.
  5. Applicare da 1 cm x 1 cm di cartilagine pezzo al blocco di acciaio inox con colla di cianoacrilato e un paio di pinzette. Colla un pezzo aggiuntivo di cartilagine al cilindro Delrin e fissare il cilindro al dinamometro. È molto importante che entrambe le superfici di cartilagine di fronte all'altro e contatta l'idrogel.
  6. Postobagnomaria plexiglas sulla parte superiore della piastra calda e inserire il blocco di acciaio inossidabile con il substrato cartilagine all'interno della vasca.
  7. Abbassare il braccio del banco prova e allineare substrati cartilagine tra loro. Sollevare il braccio e lasciare spazio sufficiente per applicare l'idrogel.
  8. Con una pipetta a spostamento positivo, dispensare 200 microlitri della idrogel bioadesivo al pezzo inferiore della cartilagine.
  9. Abbassare il braccio del supporto forza a 1 mm / min finché i contatti idrogel il pezzo superiore della cartilagine e esercita una forza di precarico di 0,001 N.
  10. Versare la soluzione salina C 37 ° nel bagno fino a quando il volume raggiunge il livello dell'acqua designato. Controllare la temperatura della soluzione con una termocoppia.
  11. Consentire l'idrogel da impostare per un totale di 5 minuti. Una volta che il gel è solidificato, sollevare il braccio ad una velocità di 2 mm / min. Il test è terminato quando il bioadesivo stacca dal substrato cartilagine o quando si verifica un calo significativo in vigore,segnalazione guasti.
  12. Raccogliere i dati registrati e sollevare il braccio del banco di prova. Rimuovere il cilindro Delrin dal dinamometro. Versare la soluzione salina nel contenitore precedente e riscaldare a 37 ° C.
  13. Calcolare sollecitazioni sottraendo la forza esercitata dal polimero dalla spinta di Archimede un "vuoto", l'allegato Delrin senza cartilagine o adesivo, sollevata alla stessa velocità, e dividendo per la zona legame.

5. Gonfiore Studio di PNIPAAm-g-CS con alginato microparticelle

  1. Preparare fiale di vetro puliti ed etichettarli in modo appropriato con un punto di tempo, tipo di campione, e il numero del campione. possono anche essere creati i collanti, come precedentemente descritto. Preparare un totale di cinque campioni (n = 5) per ciascun tipo di campione per punto temporale.
  2. Pre-pesare tutte le fiale di vetro e registrare la loro massa iniziale a temperatura ambiente.
  3. Utilizzando una siringa, erogare circa 0,4 ml del campione adesivo preparato in ciascuno dei cinque fiale.Ripetere questo passaggio per ogni tipo di campione in tutti i punti di tempo testati.
  4. Pesare e registrare la massa di ciascun flacone con il tipo di campione di adesivo a temperatura ambiente.
  5. Pre-riscaldare un incubatore orbitale e 1 L di soluzione 1x PBS a 37 ° C.
  6. Organizzare tutti i flaconi su una griglia e inserire il rack nell'incubatore. Lasciare gli adesivi a transizione da liquido a gel per circa 5 a 10 min.
  7. Aggiungere 5,0 ml di PBS 1x per ogni flacone. Assicurarsi di aggiungere la soluzione con attenzione PBS lungo il lato del flaconcino per evitare che il disco idrogel da spezzarsi.
  8. Cap ciascuna fiala per evitare l'evaporazione della soluzione PBS e mantenere la temperatura interna del incubatore a 37 ° C. Ogni serie di dischi di idrogel dovrà rimanere immersa in PBS per un periodo di tempo stabilito.
  9. Una volta che un punto di tempo sette giorni è stato raggiunto, stappare l'insieme delle fiale e rimuovere la soluzione PBS da ogni flaconcino. Pesare ogni flacone con il campione di adesivo di nuovo a temperatura ambiente.

6. La vitalità delle cellule qualitativa usando un test dal vivo / morto

  1. Prima di eseguire il test Live / Morto con PNIPAAm-g-CS, crescere renali embrionali umane cellule 293 (HEK-293) a 80% di confluenza.
    1. Quick-scongelare ghiacciato sospensione cellulare HEK-293 posizionando il esageratamente in un bagno d'acqua a 37 ° C, quindi centrifugare le cellule a 400 xg a 4 ° C per 5 minuti in un tubo da 15 ml.
    2. Per mezzo di crescita cellulare primo passaggio, combinare in alto glucosio (4,5 g / L) Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con calore siero fetale bovino inattivato (FBS) ad una concentrazione finale del 20% e la soluzione di penicillina-streptomicina 100x ( pen-strep) ad una concentrazione finale di 100 UI / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina. Per tutti gli altri passaggi, passare alla DMEM con 10% FBS e 1x pen-streptococco.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di mezzo di crescita e trasferire la sospensione in un piatto 100 millimetri di diametro petri. uniformemente distribute le cellule inclinando leggermente il frontale piatto a quella posteriore e da sinistra a destra un paio di volte ogni direzione.
    4. Cultura le cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2. Se necessario, cambiare il medium ogni due giorni.
    5. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, replicare la cultura in più piatti. Rimuovere il mezzo dalla piastra.
    6. Aggiungere 1 ml di 0,5% tripsina alla piastra. Lasciare le piastre di incubare a 37 ° C per 10 min. Verificare se le cellule si staccano dalla superficie rimestando delicatamente la piastra.
    7. Per spaccare la cultura 1:10 aggiungere 9 ml di regolare terreno di coltura (DMEM con 10% FBS) alle cellule trypsinized e mescolare delicatamente inclinando il piatto.
    8. Dispensare 1 ml di sospensione cellulare diluita in ogni nuovo piatto e aggiungere 9 ml di terreno di coltura. Mescolare delicatamente inclinando il piatto.
    9. Cultura le cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2. Se necessario, cambiare il medium maiy due giorni fino cellule raggiungere l'80% di confluenza.
  2. Togliere la carta dal due piatti della cultura cresciute al 80% di confluenza.
  3. Aggiungere 1 ml di 0,5% tripsina per ciascuna piastra. Lasciare le piastre di incubare a 37 ° C per 10 min. Verificare se le cellule si staccano dalla superficie rimestando delicatamente la piastra.
  4. Lavare le cellule HEK-293 sulla piastra con 3 ml di mezzo di crescita due volte e aggiungere entrambe le sospensioni al tubo conico stessi 15 ml.
  5. Centrifugare il tubo da 15 ml per 10 min a 400 xg a 4 ° C.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di terreno pipettando su e giù.
  7. Pipettare 10 ml di sospensione cellulare in un emocitometro e eseguire un numero di cellule per determinare la densità cellulare. Aumentare il volume di sospensione del mezzo se la concentrazione cellulare iniziale è troppo alto, e viceversa diminuire il volume se la concentrazione è troppo bassa, per preservare un concent destinazionerazione di 1 x 10 6 cellule / ml. Centrifugare le cellule HEK-293 a 400 xg e risospendere il pellet cellulare in volume corretto dei media conseguenza.
  8. Agitare delicatamente la sospensione cellulare e distribuire uniformemente la miscela di cellule in quattro tubi da 15 ml coniche separate per le seguenti condizioni di prova: monostrato controllo positivo, controllo ucciso negativo in PNIPAAm-g-CS con il 70% (v / v) metanolo, HEK-293 cellule incapsulate in PNIPAAm-g-CS, e HEK-293 cellule incapsulate in PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato.
  9. Creare monostrati di controllo positivo pipettando più di 300 volumi microlitri della miscela di cellule in un 24-pozzetti per generare 4-6 campioni replicati.
  10. Rimuovere il supporto dai tubi conici relative al controllo ucciso, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato.
    1. Centrifugare le provette coniche per 5 minuti a 400 xg ed eliminare il surnatante.
    2. Mantenere la stessa concentrazione cellulare risospendendo il cell nello stesso volume di PNIPAAm-g-CS come supporto rimosso. Pipettare il mix delle cellule polimero su e giù con una pipetta sierologica fino omogeneo.
      1. Se semina con microparticelle di alginato, trasferire la sospensione PNIPAAm-g-CS-cell (ottenuto come descritto per 6.10.2) in un piatto di coltura a 35 mm e introdurre le particelle nella miscela. Pipettare il mix cellulare su e giù con una pipetta sierologica fino omogeneo.
    3. Utilizzando la pipetta sierologica, dispensare multipli 300 microlitri della miscela polimerica cellule in ciascun pozzetto di controllo ucciso, PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato di generare 4 - 6 campioni replicati.
  11. Incubare la piastra a 37 ° C per 10 a 15 minuti e consentire il PNIPAAm-g-CS passaggio da liquido a gel (il polimero forma una opaca, disco bianco).
  12. Posizionare un vetrino più caldo nel cappuccio e impostare la temperatura a 37 ° C. Utilizzare il vetrino più caldo per mantenere pozzettila temperatura e pipetta 600 ml di supporti pre-riscaldato in ciascun pozzetto. Per evitare ulteriormente la transizione del polimero allo stato liquido, posizionare una lampada con una lampadina fluorescente sopra il piatto per riscaldare l'aria sopra di esso.
  13. Incubare le cellule per 5 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2.
  14. Dopo cinque giorni sono trascorsi, preparare la miscela Morto Live / tintura utilizzando omodimero etidio (EthD-1) e calceina AM. Entrambe le sostanze sono sensibili alla luce e preparate il giorno di utilizzo.
    1. Scongelare la AM calceina e EthD-1 dal kit a temperatura ambiente.
    2. Aggiungere 5 ml di sterile 1x PBS a un tubo conico e avvolgerlo in un foglio di alluminio.
    3. Aggiungere 6,67 ml di 2 mM EthD-1 alla provetta conica. Agitare bene la miscela soluzione.
    4. Successivamente, aggiungere 2,5 ml di 4 mm calceina AM al tubo conico. Agitare bene la miscela.
  15. Rimuovere la carta dai pozzi del monostrato (controllo positivo), PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS ingegnomicroparticelle h alginato. Lavare tutti i pozzetti a fondo, ma delicatamente, con PBS e rimuovere il PBS.
  16. Lasciare i dischi di idrogel che contengono microparticelle di alginato per liquefare a temperatura ambiente e aggiungere 2 ml di citrato di sodio 50 mm a ciascuno dei pozzetti.
  17. Rimuovere il supporto dai pozzi di cellule uccise (controllo negativo). Lasciare i dischi idrogel per liquefare a temperatura ambiente e aggiungere 300 ml di 70% (v / v) di metanolo in ciascun pozzetto.
  18. Incubare la piastra per 45 min a 37 ° C.
  19. Rimuovere il citrato di sodio e soluzioni metanolo dai pozzetti e pipettare ciascuna delle sospensioni idrogel in provette da microcentrifuga individuali. Centrifugare le provette a 2.000 xg per 10 minuti per separare le cellule dalla sospensione idrogel.
  20. Rimuovere accuratamente la sospensione pipettando la soluzione dal tubo conico e lasciando il pellet di cellule. Risospendere il pellet in 300 ml di PBS e trasferire alla piastra pozzo originale.
  21. Aggiungere 300 ml di tegli LIVE / mix colorante Morto a ciascuno dei pozzi. Avvolgere la piastra bene in un foglio di alluminio e incubare per 45 minuti su una sedia a dondolo a temperatura ambiente.
  22. Immagine tutti i campioni in un microscopio invertito a fluorescenza con un obiettivo 10X. Le cellule viventi e cellule uccise mostreranno una fluorescenza verde e rosso, rispettivamente.

7. vitalità cellulare quantitativa utilizzando un test XTT

  1. Crescere cellule HEK-293 al 80% di confluenza. Rimuovere i mezzi di crescita da due piatti della cultura.
  2. Aggiungere 1 ml di 0,5% tripsina per ciascuna piastra. Lasciare le piastre di incubare a 37 ° C per 10 min. Verificare se le cellule si staccano dalla superficie rimestando delicatamente la piastra.
  3. Lavare le cellule HEK-293 sulla piastra con 3 ml di media due volte e aggiungere entrambe le sospensioni al tubo conico stessi 15 ml.
  4. Centrifugare il tubo da 15 ml per 10 min a 400 xg a 4 ° C.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di mediapipettando su e giù.
  6. Pipettare 10 ml di sospensione cellulare in un emocitometro e eseguire un numero di cellule per determinare la densità cellulare. Come precedentemente descritto, mantenere una concentrazione target di 1 x 10 6 cellule / ml. Centrifugare le cellule HEK-293 a 400 xg e risospendere il pellet cellulare in volume corretto dei media conseguenza.
  7. Agitare delicatamente la sospensione cellulare e distribuire uniformemente la miscela di cellule in quattro tubi da 15 ml coniche separate per le seguenti condizioni di prova: monostrato controllo positivo, controllo ucciso negativo in PNIPAAm-g-CS con il 70% (v / v) metanolo, HEK-293 cellule incapsulate in PNIPAAm-g-CS, e HEK-293 cellule incapsulate in PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato.
  8. Creare monostrati di controllo positivo pipettando 300 microlitri della miscela di cellule in un 24-pozzetti per generare 4 - 6 campioni replicati.
  9. Rimuovere il supporto dai tubi conici relative al controllo ucciso, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato.
    1. Centrifugare le provette coniche per 5 min a 400 xg ed eliminare il surnatante.
    2. Mantenere la stessa concentrazione cellulare risospendendo le cellule nello stesso volume di PNIPAAm-g-CS come supporto rimosso. Pipettare il mix cellulare su e giù con una pipetta sierologica fino omogeneo.
      1. Se semina con microparticelle di alginato, trasferire la sospensione PNIPAAm-g-CS-cellule in una capsula di Petri 35 millimetri e di introdurre le particelle nel mix. Pipettare il mix cellulare su e giù con una pipetta sierologica fino omogeneo.
    3. Utilizzando la pipetta sierologica, dispensare 300 microlitri della miscela polimerica cellule in ciascun pozzetto di controllo ucciso, PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato di generare 4 - 6 campioni replicati.
  10. Una volta che tutti i campioni di cellule contenenti sono stati aggiunti alla piastra 24 pozzetti, dispensare più di 300 volumi microlitri di PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato senza celle in pozzetti adiacenti per generare 4 - 6 campioni replicati.
  11. Incubare la piastra 24 pozzetti a 37 ° C per 10 a 15 minuti e consentire il PNIPAAm-g-CS passaggio da liquido a gel (il polimero forma una opaca, disco bianco).
  12. Posizionare un vetrino più caldo nel cappuccio e impostare la temperatura a 37 ° C. Utilizzare il vetrino più caldo per mantenere e temperatura della piastra e pipetta 600 ml di DMEM chiaro preriscaldata in ogni pozzetto. Per evitare ulteriormente la transizione del polimero allo stato liquido, posizionare una lampada con una lampadina fluorescente sopra il piatto per riscaldare l'aria sopra di esso.
  13. Incubare le cellule per 5 giorni a 37 ° C in 5% CO 2.
  14. Dopo cinque giorni sono trascorsi, preparare il 2,3-bis- (2-metossi-4-nitro-5-solfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxanilide reagente (XTT) dal produttore. Il reagente XTT è sensibile alla luce e preparato il giorno di utilizzo.
    1. Rimuovere il flacone color ambra contienezione la polvere XTT dal frigorifero. Usando una siringa sterile e ago, iniettare 5 ml di DMEM chiaro (senza rosso fenolo) attraverso il setto di gomma nella bottiglia ambrata.
    2. Riscaldare il reagente a 56 ° C a bagnomaria per 10 minuti o fino a dissoluzione.
    3. Diluire ulteriormente il reagente XTT al 20% (v / v) in un tubo da 15 ml avvolti in carta stagnola. Aliquota l'eccesso di reagente XTT in provette da microcentrifuga e metterli nel congelatore a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
  15. Rimuovere il supporto dai pozzi di cellule uccise (controllo negativo) e aggiungere 300 ml di 70% (v / v) metanolo in ogni pozzetto. Incubare per 45 minuti a 37 ° C e rimuovere il metanolo dai pozzetti.
  16. Rimuovere il supporto dai restanti pozzetti del monostrato (controllo positivo), PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS con microparticelle di alginato. Lavare tutti i pozzetti a fondo, ma delicatamente, con PBS e quindi rimuovere la PBS.
  17. Aggiungere 300 ml di 20% XTT reagente per ogni pozzetto. Avvolgere il 24-pozzetti in un foglio di alluminio e incubare per 24 ore su una sedia a dondolo a temperatura ambiente.
  18. Dopo 24 ore, aggiungere 200 ml di citrato di sodio 50 mM a tutti i pozzetti e incubare sul bilanciere per una ora aggiuntiva.
  19. Trasferire tutte le sospensioni polimeriche per provette da microcentrifuga e centrifugare a 2000 xg per 10 min a RT.
  20. Trasferire 200 ml di surnatante da ciascuna provetta ad una piastra a 96 pozzetti. Utilizzo di un lettore di micropiastre, ottenere letture di assorbanza specifici a 450 letture di assorbanza nm e non specifici a 690 nm.

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Risultati

Un termosensibile innestato copolimero è stato sintetizzato con successo e caratterizzato per la sua forza bioadesivo, gonfiore proprietà, e in citocompatibilità vitro. Abbiamo scelto di indagare alginato grazie alle sue proprietà mucoadesive consolidate. microparticelle alginato, con un diametro medio di 59,7 ± 14,9 micron, sono stati miscelati con 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS a concentrazioni di 25, 50, e 75 mg / ml. Queste concentrazioni sono basate su una metà, pari a, e...

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Discussione

Ci sono diversi passaggi critici nella sintesi composito idrogel-microparticelle e valutare la sua forza adesiva, gonfiore capacità, e biocompatibilità cellulare. polimerizzazione radicalica del PNIPAAm-g-CS richiede methacrylation successo di condroitin solfato, completa dissoluzione dei componenti monomerici, e le condizioni di reazione priva di ossigeno. Il rapporto tra NIPAAm monomero condroitin solfato metacrilato nella miscela di reazione è stato scelto perché è stato dimostrato, nel nostro lavoro precedente, per ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere con gratitudine l'aiuto del Dr. Jennifer Kadlowec nello sviluppo del protocollo di collante prove di trazione.

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of Arthritis e muscoloscheletrico e malattie della pelle e l'Istituto Nazionale di Biomedical Imaging e Bioingegneria del National Institutes of Health sotto Premio Numero 1R15 AR 063.920-01. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
N-isopropilacrilammide, 99%, puro, stabilizzatoAcros Organics2210-25-5Refrigerare e rimuovere lo stabilizzante con esano
Condroitina solfato A sale sodico (da trachea bovina)Sigma-Aldrich39455-18-0Refrigerare
HesanesFisher ScientificH302-4Conservare in un armadio infiammabile
50% (p/p) idrossido di sodioFisher ScientificSS254-1Anidride metacrilico di natura
causticaSigma-Aldrich276685Fumi forti; utilizzare in una cappa aspirante
AcetoneFisher ScientificA18-4Raffreddare in frigorifero prima dell'uso
Azoto gassosoPraxair7727-37-9Codice prodotto: NI 4.8, cilindro tipo T, azoto puro al 99,998% (l'argon può essere utilizzato come gas inerte alternativo)
Tetrametiletilendiammina, 99% extra puroAcros Organics110-18-9
Persolfato di ammonioSigma AldrichA3678Igroscopico e degradante in presenza di acqua
Compresse saline tamponate con fosfatoFisher ScientificBP2944Mantenere asciutto
Acido alginico, sale sodicoAcros Organics177775000Utilizzare il calore per favorire la dissoluzione
Cloruro di calcio diidratoFisher ScientificC79
Olio di colzaNegozio locale Ottenereda un negozio locale
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) IsopropoanoloFisher ScientificA416-4
Orecchie di maialeHaine's Pork ShopOttenere da un macellaio locale
Cloruro di sodioFisher ScientificS271-3
Rene embrionale umano 293 celluleATCC ATCCCRL-1573Conservare in azoto liquido per uso a lungo termine
DMEM: 1x, alto glucosio, senza piruvatoLife Technologies11965126Refrigerare
il siero fetale bovinoLife Technologies10082-147Refrigerare
Penn Strep: 10.000 U/mlLife Technologies15140-122Refrigerare
Tripsina-EDTA: 0,5%, 10xLife Technologies15400-054Refrigerare
MetanoloVWRAAA44571-K7
Kit di vitalità per cellule vive/morteLife TechnologiesL3224sensibili alla luce, mantenere congelate
Sigma AldrichTOX2-1KTSensibile alla luce, mantenere congelato
Trasparente DMEM: 1x, glicemia alta, senza fenoloLife Technologies21063-029Refrigerare
Dulbecco's PBS: 1xLife Technologies14190136Refrigerare
Citrato di sodioEMDSX0445-1
Pipetta a spostamento positivoBrandTech Scientific, INC2702904eroga 100 - 500 &; l e viene fornito con punte attaccabili
n. 3. Manico per bisturi in acciaio inossidabileSigmaAldrich S2896
Lame chirurgiche sterili MiltexFisher Scientific12-460-440
Omogeneizzatore per gemme PowerFisher Scientific08-451-660Modello # 125
Mortaio e pestello in porcellanaSigma AldrichZ247464Contiene 50 ml di
sistema di liofilizzazione da banco FreeZone 1 LLabconco7740020Congelare i campioni prima dell'uso
Pompa rotativa a palette a tenuta d'olioEdwardsA65301906Modello # RV5
Agitatore orbitale di incubazioneVWR12620-946Modello # 980153
Centrifuga refrigerata da bancoForma Scientific, INCModello # 5682
Forni riscaldatiVWRModello # 1235PC
2 N dinamometroShimpoFGV-0.5XYModello # FGV-0.5XY
Banco di prova E-forceShimpoFGS-200PVModello # FGS-200PV
Centrifuga a secchio oscillante per coltura tissutaleBeckman Coulter366830Modello #6S-6KR
Microcentrifuga per colture tissutaliEppendorfModello #5415C
Set di ematocitometriHausser Scientific3720Richiede un vetro di copertura di ricambio scivola
ScaldavetriniLab ScientificXH-2022Modello # XH-2002
Lampada riscaldante portatileUnderwriters LaboratoriesAiuta a mantenere la temperatura del polimero a 37 gradi C
Microscopio a fluorescenza invertitoZeissModello Axiovert 25 CFL
Bagno d'acqua riscaldatoVWRModello # 1235PC
Piattaforma a dondoloVWRSerie 100
Multiskan FC Lettore di piastre per microtitolazioneThermo ScientificTipo 357
Incubatore per colture cellulariVWRModello # 2350T
Purificatore cabina di sicurezza biologica classe IILabconcoDelta Series
Kit di vitalità per celle XTT Size 10

Riferimenti

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