Articolo metodologico

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

DOI:

10.3791/53708

⸱

15 febbraio 2016

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro dimostra in situ caratterizzazione di biomolecole di proteine ​​nella soluzione acquosa utilizzando il sistema per l'analisi al Interface Vacuum Liquid (SALVI) e tempo di volo spettrometria di massa di ioni secondari (TOF-SIMS). Il film proteine ​​fibronectina è stato immobilizzato sulla membrana di nitruro di silicio (SiN) che forma l'area di rilevamento SALVI. Durante l'analisi ToF-SIMS, sono stati condotti tre modalità di analisi compreso alta spettrometria di massa spaziale risoluzione, immagini bidimensionali (2D), e profili di profondità. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in entrambe le modalità positivi e negativi. acqua deionizzata è stato anche analizzato come un campione di riferimento. I nostri risultati mostrano che il film fibronectina in acqua ha più distinti e più forti picchi di cluster di acqua rispetto alla sola acqua. picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi sono anche osservabili nella proteina idratata ToF-SIMS spettri. Questi risultati dimostrano che molecola proteica adsorbimento su una superficie può essere studiato Dynamically usando Salvi e ToF-SIMS nell'ambiente liquido per la prima volta.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'idratazione è cruciale per la struttura, 1 conformazione, 2 e 3 attività biologica delle proteine. Le proteine ​​senza molecole d'acqua che li circondano non avrebbero attività biologiche vitali. In particolare, le molecole d'acqua interagiscono con la superficie e la struttura interna delle proteine, e diversi stati di idratazione di proteine ​​rendono tali interazioni distinte. 4 L'interazione delle proteine ​​con le superfici solide è un fenomeno fondamentale, con implicazioni nel campo delle nanotecnologie, biomateriali e processi di ingegneria tissutale. Studi hanno a lungo indicato che i cambiamenti ....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pulizia e sterilizzazione della Microchannel SALVI

  1. Sterilizzazione della Microchannel in SALVI
    1. Disegnare 2 ml di soluzione acquosa al 70% di etanolo in una siringa, collegare la siringa con l'estremità di entrata della SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa al termine dell'iniezione. Quindi, collegare l'ingresso e l'uscita di SALVI utilizzando un polietereterchetone (PEEK) unione. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa per condurre la stessa procedura. Ad esempio, impostare la velocità di flusso a 100 microlitri / min.
    2. Mantenere la microcanali SALVI riempito con soluzione....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un paio di risultati rappresentativi sono presentati per dimostrare i vantaggi del protocollo proposto. Utilizzando l'interfaccia microfluidica SALVI, il fascio di ioni primario (Bi 3 +) può bombardare direttamente sul film fibronectina idratato in acqua deionizzata. Così la mappatura chimica molecolare della superficie del liquido può essere acquisito correttamente.

Figura 1a e

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SALVI è un'interfaccia microfluidico che consente superficie del liquido dinamico e analisi interfaccia liquido-solido da strumenti vuoto based, come ToF-SIMS e microscopia elettronica a scansione (SEM). A causa l'utilizzo di piccole aperture per esporre il liquido direttamente nel vuoto, SALVI è adatto per molte spettroscopia e di imaging tecniche finemente focalizzato, senza alcuna modifica; 22 la portabilità e la versatilità di microfluidica ne fanno una vera e propria piattaforma di imaging multim.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati al fondo LDRD del Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) e Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD. L'accesso strumentale è stato fornito attraverso una proposta a tema scientifico del W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL è una struttura scientifica nazionale sponsorizzata dall'Office of Biological and Environmental Research (BER) del PNNL. Gli autori ringraziano il signor Xiao Sui, il signor Yuanzhao Ding e la signora Juan Yao per aver corretto le bozze del manoscritto e per aver fornito un uti....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ToF-SIMSIONTOFTOF. Risoluzione SIMS 5: >10.000 m/Δ m per la risoluzione di massa; >4.000 m/Δ m per alta risoluzione spaziale 
Sistema per l'analisi presso l'interfaccia del vuoto liquido (SALVI)Northwest National LaboratoryN/ASALVI è uno strumento analitico unico, autonomo e portatile che, per la prima volta, consente a strumenti scientifici basati sul vuoto come la spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo (ToF-SIMS) di analizzare le superfici liquide nel loro stato naturale a livello molecolare.
PEEK UnionValcoZU1TPKper il collegamento dell'ingresso e dell'uscita del
SALVI 5 assi Sample StageIONTOFN/AStage è autocostruito per il montaggio di SALVI in ToF-SIMS
Barnstead Nanopure Water Purification SystemThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Modulo di filtrazione ad osmosi inversa (D2716)
SiringaBD3096591 ml
PipettaThermo Fisher Scientific21-377-821Intervallo: da 100 a 1.000 ml
Puntale per pipetteNeptune2112.96.BS1.000 &; l
Provetta da centrifugaCorning43079115 ml
FibronectinaSigma-AldrichF11411 mg/ml
EtanoloThermo Fisher ScientificS25310A95% denaturato
Gibco PBSThermo Fisher Scientific10010-023pH 7.4
Pacific

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
  2. Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
  3. Chaplin, M.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Film di fibronectinainterfaccia liquido vuotospettrometria di massa a ioni secondari tempo di volospettrometria di massa a risoluzione spazialeimaging bidimensionaleanalisi del profilo di profondit

Articoli correlati