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Articolo metodologico

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode

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⸱

DOI:

10.3791/53712

⸱

28 marzo 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

In questo articolo

Sommario

Qui dettagliamo i protocolli specificamente progettati per monitorare i difetti morfogenici che si verificano durante le fasi precoci e tardive dell'allungamento embrionale del nematode Caenorhabditis elegans. In definitiva, questi protocolli sono progettati per identificare i geni che regolano queste fasi e per caratterizzare i loro requisiti differenziali lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione.

Abstract

L'analisi delle vie di segnalazione che controllano l'alterazione dei processi morfogenici durante lo sviluppo embrionale richiede metriche robuste e sensibili. L'allungamento embrionale del nematode Caenorhabditis elegans è uno stadio di sviluppo tardivo che consiste nell'allungamento dell'embrione lungo il suo asse longitudinale. Questa fase di sviluppo è controllata dalla comunicazione intercellulare tra le cellule ipodermiche e i muscoli sottostanti della parete corporea. Questi meccanismi di segnalazione controllano la morfologia delle cellule ipodermiche rimodellando il citoscheletro e le giunzioni cellula-cellula. La misurazione della letalità embrionale e dell'arresto dello sviluppo negli stadi larvali, nonché l'alterazione del citoscheletro e delle strutture di adesione cellula-cellula nelle cellule ipodermiche e muscolari, sono fenotipi classici che sono stati utilizzati per più di 25 anni per sezionare queste vie di segnalazione. Studi recenti hanno richiesto lo sviluppo di nuove metriche mirate specificamente all'allungamento precoce o tardivo e alla caratterizzazione dei difetti morfogenici lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione. Qui forniamo protocolli dettagliati che consentono di misurare con precisione la lunghezza e la larghezza degli embrioni allungati, nonché la lunghezza delle larve sincronizzate. Questi metodi costituiscono strumenti utili per identificare i geni che controllano l'allungamento, per valutare se questi geni controllano sia le fasi iniziali che quelle tardive di questa fase e sono necessari in modo uniforme lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione.

Introduzione

Per quasi 50 anni nematode Caenorhabditis elegans si è affermata come un potente modello per studiare le questioni importanti in fase di sviluppo, neurobiologia, l'evoluzione, interazioni ospite-patogeno, ecc 1 Il punto di forza di questo modello per lo studio dello sviluppo risiede nella: suo ciclo di vita breve di 3 giorni; la facilità con cui questi animali possono essere geneticamente modificate; la trasparenza che permette l'osservazione di spostamento e la morfologia cellulare in animali viventi e il suo sviluppo che è prevalentemente extra-uterina. Le fasi di sviluppo del nematode coinvolgono embriogenesi e quattro stadi larvali (da L1 a L4), seguito da adulta. Durante lo sviluppo embrionale, epidermica morfogenesi attirato considerevole attenzione per la sua capacità di consentire una migliore comprensione di come epiteliali cellule migrano come gruppo, come si riorganizzano loro giunzioni e modificare la loro morfologia individuale così come il posizionamento corrispondenti entro un epitelio funzionale.Epidermal morfogenesi è diviso in quattro fasi: intercalazione dorsale che consiste nella riorganizzazione delle cellule epidermiche dorsale, indicato come l'ipoderma; recinzione ventrale, che consiste nella migrazione delle cellule ipodermici ventrale verso la linea mediana ventrale incassa quindi l'embrione in un monostrato di cellule epiteliali; all'inizio e alla fine l'allungamento trasformare l'embrione a forma di fagiolo in larve vermiforme. A seguito di morfogenesi, portello di embrione e L1 larve iniziano a nutrire utilizzando batteri disponibili nel loro ambiente immediato.

allungamento embrionale è quindi una fase tardiva dello sviluppo embrionale. Consiste dell'estensione dell'embrione lungo il suo asse longitudinale ed una riduzione del suo diametro trasversale. Ciò comporta una modificazione drammatica della forma delle cellule ipodermici. Allungamento è diviso in una prima e una fase tardiva. La prima fase inizia nella fase virgola e si conclude quando i muscoli del corpo a parete iniziano a contrarre in fase di 1,75 volte in wILD-type (WT) embrioni - corrispondente a embrioni che sono 1,75 volte di lunghezza rispetto agli embrioni non allungata. Processi morfogenetici che si verificano in quella fase sono trainate principalmente dalla contrazione dei fasci filamentosi di actina (FB) situati al polo apicale delle cellule ipodermici che guidano il loro allungamento lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione 2. Contrazione di FB è il controllo da fosforilazione delle catene della miosina-luce da tre chinasi LET-502 / rock, MRCK-1 e PAK-1 5. La fase tardiva del allungamento, inizia quando i muscoli del corpo a parete diventano funzionali e iniziare amministrazione. Si tratta di segnalazione meccanotrasduzione dai muscoli del corpo a parete alle cellule dorsali e ventrali ipodermici e termina quando gli animali si schiudono 3.

difetti di allungamento sono generalmente caratterizzati dalla percentuale di animali che muoiono come embrioni (letalità embrionale, Emb) e quelli arrestare il loro sviluppo come larve L1 (larvale fenotipo arresto; Lva) e di essere significativamente più breve di peso. L'identificazione della fase di arresto dello sviluppo richiede osservazione al microscopio di embrioni morti e arrestato larve 3-6.

E 'stato recentemente dimostrato che diversi geni, come ad esempio il / regolatore di Cdc42 Rac e effettori pix-1 e pak-1, il controllo dei processi morfogenetici sia in fase precoce e tardiva di allungamento 3,7. Abbiamo anche recentemente dimostrato che i processi morfogenetici differiscono lungo l'asse antero-posteriore degli embrioni durante la prima allungamento 3 7. Questi risultati motivato lo sviluppo di nuove metriche rivolte specificamente alle fasi di allungamento presto o tardi e altri parametri che consentono la caratterizzazione della morfologia degli embrioni lungo il loro asse antero-posteriore durante l'allungamento presto.

Questi nuovi metodi consistono nel misurare la lunghezza di embrioni all'inizio e alla fine dell'allungamento precoce e la larghezza della loro luiannunci e le code. 7 due protocolli sono stati sviluppati anche per misurare la lunghezza delle larve appena schiusi, sincronizzati in fase L1 7.

I gusci di uova di embrioni li proteggono trattamento ipoclorito alcalino mentre larve, adulti e batteri presenti nei mezzi di coltura vengono sciolti dal trattamento. Questo trattamento viene poi utilizzato per purificare embrioni da una popolazione non sincronizzato contenente una maggioranza degli adulti ben nutriti 8. restrizione alimentare viene utilizzato per sincronizzare le larve neonate. Misurare la lunghezza di queste larve viene quindi utilizzato per rilevare difetti di allungamento. Questa misurazione è preferibile rispetto alla misura di larve catturato su piastre di coltura a causa larve che si schiudono da non interamente embrioni allungati può recuperare a "lunghezza normale" durante l'alimentazione ma mantenere la loro ridotta dimensione quando arrestato in assenza di cibo.

Qui, presentiamo protocolli dettagliati che consentono la misurazione del length di allungamento embrioni così come la larghezza della loro testa e la coda utilizzando time-lapse DIC microscopia e analisi di immagine (protocollo 1). Forniamo anche protocolli dettagliati per misurare la lunghezza delle larve sincronizzata utilizzando l'analisi dell'immagine (protocollo 2) e citometria a flusso (protocollo 3).

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Protocollo

1. Caratterizzazione dei primi difetti allungamento in WT e mutanti Animali

  1. Embrioni di montaggio per Normarski DIC Microscopia
    1. Preparare i seguenti terreni di coltura e materiale:
      1. M9 Buffer, sciogliere 12,8 g / l Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L di NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O in acqua distillata e autoclave per sterilizzare.
      2. Piastre NGM, sciolgono 3 g / L di NaCl, 16 g / L di agar, 2,5 g / L bactopeptone in DDH 2 O. Autoclave e aggiungere 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl 2, 1 mM tampone fosfato e colesterolo 5 ug / ml. Versare 6 ml di NGM a 60 mm piatti. Lasciar solidificare per 24 ore a temperatura ambiente. Aggiungere poche gocce di una cultura satura di E. batteri OP50 coli coltivate in brodo Luria (LB). Lasciate che i batteri crescono per 48 ore e conservare le piastre a 4 ° C.
      3. Per generare il pi vermeck, montare un filo di platino "di diametro 0,01 su un breve pipetta Pasteur. Fissare il filo di platino all'estremità della pipetta di vetro riscaldando questa estremità con un bruciatore benzene. Appiattire l'estremità del filo per generare una sorta di pala.
    2. Far crescere la tensione verme su 60 mm piastre NGM con OP50 a 20 ° C.
      NOTA: alleli termosensibili possono richiedere crescere gli animali a temperature non permissive fino a 25,5 ° C. Le piastre devono contenere molti giovani adulti e ancora un sacco di cibo al fine di perseguire i protocolli.
    3. Collocare un vetrino da microscopio tra due slitte distanziatori coperti da due strati di nastro adesivo (Figura 1A).
    4. Preparare una soluzione di agarosio al 3% (peso / volume) in tampone M9 sciogliendo 0,6 g di polvere di agarosio in 20 ml M9 buffer riscaldamento nel forno durante 30 sec. Lasciare che la soluzione per raffreddare per 5 min.
      NOTA: La soluzione di agarosio può essere utilizzato per alcuni giorni dopo la fusione in un forno a microonde. essopossono anche essere aliquotati e conservati a 4 ° C per settimane.
    5. Mettere una goccia di soluzione di agarosio al 3% caldo sul vetrino situato tra i due distanziatori scivoli. Evitare la formazione di bolle.
    6. Rapidamente coprire l'agarosio con un'altra diapositiva come illustrato nella figura 1B e premere leggermente. La slitta superiore appiattire la caduta di agarosio e generare un tampone con lo spessore di due strati di nastro adesivo.
    7. Consentire l'agarosio solidificare per almeno 1 min a temperatura ambiente o fino gli embrioni sono pronti per essere trasferiti al pad.
    8. Utilizzando un pick verme, il trasferimento da 20 a 30 giovani adulti ben nutriti dalla NGM-piatto in un tubo micro-centrifuga contenente 400 ml di tampone M9.
    9. Lasciare i vermi a sedimentare per gravità per circa 5 minuti e rimuovere il surnatante con una micropipetta. Questa fase intende eliminare il massimo di batteri raccolti ai nematodi.
    10. Aggiungere 200 ml di tampone M9 a ciascuna provetta.
    11. Utilizzando un pip Pasteurette, trasferire il contenuto del tubo (buffer e nematodi) per un vetro da orologio.
    12. Utilizzare uno o due 25G 5/8 "aghi di tagliare gli animali presso la sezione medio-corpo (tra il spermateca e la vulva).
      NOTA: Una lama bisturi può essere utilizzato anche come alternativa a spillo (s). Effettuare questa operazione su nematodi nuoto e può richiedere una certa pratica. L'idea è quella di utilizzare aghi forbici o un coltello a seconda di come vengono usati molti aghi. Una volta che gli animali sono tagliati aperto, ermafroditi rilasciano i loro embrioni nel buffer.
    13. Concentrare embrioni al centro del vetro d'orologio attraverso la generazione di un vortice circolare all'interno del liquido.
    14. Rimuovere la maggior parte della M9 dal vetro dell'orologio usando una micropipetta. Lasciare circa 30 ml di M9 con gli embrioni.
    15. Rimuovere il vetrino che copre il pad agarosio (Figura 1B) sfilandolo il pad.
    16. Tagliare il pad con una lametta per essere in grado di coprire completamente con un coprioggetto (Figura 1C).
    17. Usando una pipetta Pasteur, trasferire tutti gli embrioni (e detriti verme) sul pad agarosio.
    18. Gruppo gli embrioni al centro del pad usando un ciglio incollato all'estremità di una punta utilizzata per 200 micropipette microlitri.
    19. Lentamente mettere un vetrino sulla rampa di evitare la formazione di bolle e sigillarla.
      NOTA: Diversi sigillanti possono essere usati. Usiamo disegno gomma si trova nei negozi di arte e artigianato (di solito usato come mascheratura gomma per la pittura acquarello). Questa gomma è usato perché è idrofila e solidifica ragionevolmente veloce e non è tossico per i vermi. Le diapositive possono anche essere sigillato con smalto o VALAP (miscela fatta di vaselina, lanolina e cera di paraffina).
    20. Lasciare che il disegno asciutto gomma per circa 15 min.
  2. Registrazione precoce Allungamento utilizzando quattro dimensioni Normarski DIC Microscopia
    NOTA: L'obiettivo di questa fase è quello di registrare l'allungamento presto da virgola all'inizio del tardo allungamento- Definito come il momento in cui i muscoli del corpo parete iniziano contrattazione. Abbiamo anche lo scopo di registrare più di un embrione al momento. Otto ore di registrazione è solitamente richiesto di registrare allungamento presto per un gruppo di embrioni non sincronizzati.
    1. Posizionare il montaggio a slitta sul palco di un microscopio. Assicurarsi che il microscopio è dotato di 10X e 60X obiettivi così come le lenti DIC, Prisma, fotocamera e software di acquisizione che permettono time-lapse microscopia e la generazione di Z-stack (automatizzato Z-piattaforma).
      NOTA: assicurarsi che la temperatura sia costante fra 20 e 23 ° C in camera microscopia. Una camera di riscaldamento-raffreddamento può essere richiesto sul palco microscopio, specialmente quando si usano i mutanti termosensibili.
    2. Identificare un gruppo di embrioni a stadi pre-morfogenesi utilizzando l'obiettivo 10X.
    3. Una volta individuato, sfilare l'obiettivo 10X e aggiungere una goccia di olio da immersione sul vetrino.
    4. Utilizzando l'obiettivo 60X, identificare la parte superiore e la parte inferiore di embryos per impostare i parametri di imaging Z-Stack.
      NOTA: Non esitate a impostare la Z-stack più grande rispetto allo spessore degli embrioni. Impostare la distanza tra due piani contigui come 0,8 micron. Ciò consentirà di coprire la profondità totale degli embrioni in 35 a 50 Z-piani.
      NOTA: Se il microscopio contiene una piattaforma automatizzata xy, embrioni situati in diverse località del pad possono essere registrati simultaneamente. Per fare ciò, record di coordinate XY di ogni posizione sul pad si desidera analizzare nel corso dell'esperimento. Assicurarsi di selezionare xy quando si imposta il parametro di registrazione e seguire il resto del protocollo, come indicato. Thin Z-sezionamento dell'embrione durante la registrazione non è necessariamente richiesto per le misure dettagliate in questo protocollo. Registrazione sviluppo embrionale degli animali wt e mutanti con la risoluzione massima è comunque una buona pratica al fine di costruire una libreria di registrazioni in grado di sostenere ulteriori analisi.
    5. Impostatoil time-lapse con 2 min intervalli tra due acquisizioni della durata di 8 ore.
      NOTA: Il tempo di esposizione dipende dal livello di luce impostato per il microscopio. il movimento delle cellule durante l'allungamento precoce è molto lento; tempo di esposizione potrebbe essere di circa un frame per secondo o meno. Se gli embrioni sono nelle fasi iniziali morfogenesi (dorsale di intercalazione, Box ventrale), l'allungamento presto sarebbe stato registrato entro 1 ora. Assicurarsi otturatore luce rimane chiusa tra ogni acquisizione.
    6. Eseguire l'acquisizione e salvarlo.
  3. Misurazione dei difetti primi Allungamento utilizzando l'analisi dell'immagine
    1. Aprire il software Fiji-ImageJ ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. Nel menu selezionare Analizza / Set Misure, selezionare perimetrale. Per ogni embrione, regolare la barra Z scala a concentrarsi sulla faringe dell'embrione come mostrato nella Figura 2A. Questo farà sì che si concentrano sul centro dell'embrione.
    3. Per misurare la lunghezza dell'embrione, regolare la barra scala temporale per avere l'embrione di interesse all'inizio del primo allungamento (fase virgola; Figura 2A). Si noti il ​​tempo ( "Time-inizio").
    4. Scegliere lo strumento linea segmentata. Tracciare una linea segmentato dalla punta della bocca dell'embrione fino alla punta della coda seguendo la linea mediana dell'embrione (Figura 2A). Utilizzando la scheda menu Analizza / Misura, ottenere la lunghezza della linea tracciata ( "Lunghezza inizio").
    5. Ripetere questa misurazione per lo stesso embrione alla fine dell'allungamento precoce (momento muscoli cominciano contraente). Notare il tempo ( "Time-end") e misurare la lunghezza dell'embrione ( "Length-end") come descritto sopra (Figura 2B).
    6. Calcolare la durata (D) dell'allungamento precoce e l'aumento di lunghezza (L) in questa fase come segue:
      D = "Time-end" - "Time-inizio"
      & #160; L = "Lunghezza-end" - "Lunghezza-inizio"
    7. Per misurare la larghezza della testa, regolare la barra scala temporale per avere un embrione allo stadio di interesse (stadio 1,2 volte o fine allungamento presto). Scegliere lo strumento in linea retta. Disegnare trasversale (asse dorso-ventrale) linea mediana della testa. Questa sezione è la parte più spessa dell'embrione (Figura 2C). Utilizzando il menu Analizza / Misura, ottenere la lunghezza della linea corrispondente alla larghezza testa.
    8. Allo stesso tempo punto, ripetere questo passo disegnando la linea mediana trasversale della coda (Mid-linea tra la valvola intestinale e la punta della coda; Figura 2C) e misurare avere la larghezza della coda.
      NOTA: utilizzare questa misurazione per confrontare gli embrioni nella stessa fase in diversi fenotipi. Per garantire la riproducibilità della misurazione, assicurarsi di trovare una posizione situata attorno alla mezzeria della coda dell'animale che può essere facilmente riconosciuto da un animale unnother.
    9. Per calcolare la testa al rapporto di larghezza coda, dividere la larghezza di testa per la larghezza della coda.

2. Caratterizzazione dei difetti tardo Allungamento utilizzando l'analisi dell'immagine

  1. La sincronizzazione delle larve L1 utilizzando alcalina Trattamento ipoclorito
    1. Da una piastra mm non-morti di fame 60 contenente molti adulti gravido, raccogliere tutti i vermi in un tubo di micro-centrifuga lavando i nematodi la piastra con 1 ml di tampone M9 con una pipetta Pasteur.
    2. nematodi sedimenti a 3.500 xg per 3 min a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante utilizzando una micropipetta senza disturbare il pellet verme.
    3. Aggiungere 1 ml di soluzione di ipoclorito di ciascun tubo (0,4 M ipoclorito, 0,5 M NaOH) e agitare per 3 min.
      NOTA: soluzione di ipoclorito alcalina deve essere preparata e gli embrioni in questa soluzione deve essere agitata delicatamente ma continuamente per ottimizzare la dissoluzione degli adulti e l'ossigenazione del ricamo scyo. Dopo 3 minuti di agitazione, la maggior parte degli adulti dovrebbero rilasciare le loro uova nella soluzione.
    4. Spin a 3.500 xg per 3 min a temperatura ambiente e rapidamente rimuovere il supernatante utilizzando una micropipetta senza disturbare il pellet.
    5. Lavare quattro volte con 1 ml di tampone M9 seguita da centrifugazione a 3.500 xg per 3 min.
    6. Dopo il quarto lavaggio, togliere le uova surnatante e risospendere in 700 ml di tampone M9 senza pipettando su le uova (come le uova avrebbero aderire alla plastica della punta).
    7. Nastro il tubo in un agitatore orbitale a 3 mm posto in un incubatore alla temperatura di crescita appropriata e agitare a 600 rpm durante la notte.
  2. Lunghezza Misura di Synchronized larve
    1. Centrifugare arrestato L1 larve a 3.500 xg per 3 min a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Risospendere le larve in 100 ml di buffer di M9 e trasferirli su un pad agarosio con una pipetta Pasteur (pad agarosio dovrebbero essere preparanod come descritto al punto 1.1.2 a 1.1.8). Mettere un vetrino sul pad.
      NOTA: Il tampone non deve essere sigillato con gomma per questo esperimento che coinvolge acquisizione breve.
    2. Utilizzare un obiettivo e contrasto di fase illuminazione 10X per misurare la lunghezza delle larve se si usa una telecamera ad alta risoluzione. Aumentare l'intensità della luce per essere in grado di catturare immagini in pochi millisecondi e quindi ottenere un quadro chiaro delle larve (Figura 2D).
      NOTA: Durante le trashes di nuoto di larve sono ridotti dal pad agarosio, essi sono ancora in movimento. Pertanto, la registrazione veloce è essenziale per ottenere un'immagine più nitida.
    3. Aprire Fiji-ImageJ e ripetere il punto 1.3.1. Per misurare la lunghezza delle larve, scegliere lo strumento linea segmentata. Tracciare una linea segmentato dalla punta della testa fino alla punta della coda che segue la linea mediana delle larve (Figura 2D, pannello di destra).
    4. Utilizzando il menu Analizza / Misura, ottenere la lunghezza dellinea tracciata corrispondente alla lunghezza delle larve in micrometri.

3. Caratterizzazione dei difetti tardo Allungamento citometria a flusso

  1. sincronizzare larve
    1. Purificare embrioni utilizzando il trattamento ipoclorito alcalino come descritto nella sezione 2.1 di piatti pieni da 100 mm di ben nutriti i giovani adulti e lasciare il portello embrione e l'arresto L1 nel tampone M9 per 16 a 24 ore a 20 o 25,5 ° C a seconda del ceppo analizzato.
      NOTA: Un piatto pieno di adulti ben nutriti per ceppo è sufficiente per l'analisi descritta di seguito.
  2. La calibrazione del Sorter Worm
    NOTA: Il citofluorimetro utilizzato ecco un flusso di particelle di grandi dimensioni citofluorimetro (qui di seguito denominata la selezionatrice verme). Il sorter verme comprende nm diodo laser rosso 670, che si trova davanti ad un rilevatore di estinzione. Il selezionatore worm contiene anche un laser ad argon multi-linea per l'eccitazione fluorescente. i sstrumenti tandard hanno tre tubi fotomoltiplicatori rivelatori (PMT) fluorescenza utilizzati per rilevare le emissioni di fluorescenza nelle regioni verde, giallo e rosso dello spettro. Nel protocollo qui descritto, verrà utilizzato TOF per misurare le dimensioni delle larve, il canale rosso viene utilizzato per identificare vermi morti che saranno colorate con ioduro di propidio (PI). GP (General Purpose) ad alta fluorescenza controllo particelle usato per calibrare lo strumento e come controllo interno nel nostro esperimento display ad alta fluorescenza verde, giallo e rosso. Saranno gli unici oggetti del campione analizzato con elevata emissione rilevata nel canale verde e saranno successivamente identificati sulla base di questa caratteristica.
    NOTA: Superficie animali sono identificati in base assenza di fluorescenza nel canale verde e rosso, nonché sul TOF. emissione autofluorescenti dall'intestino delle larve non è rilevabile in L1 fase.
    1. Accendere blocco laser, il computer, il compressored lo strumento verme selezionatrice. Premere il tasto START sul software selezionatrice verme aperto come indicato nel manuale di istruzioni dello strumento.
    2. Osservare la finestra pop-up di controllo laser ad argon. Selezionare la modalità RUN e attendere che le potenze laser raggiungono 10 ± 1 mW. Selezionare Fine sulla finestra di controllo laser.
    3. Impostare la guaina e le pressioni del campione a 5.10 ± 0.02 e 5.51 ± 0.01, rispettivamente. Lasciare che la pressione si stabilizzi per almeno 15 minuti e fare clic sulla casella di controllo OK PRESSIONE.
      NOTA: La portata dipende dalla guaina e le pressioni del campione.
    4. Assicurati di eliminare tutte le bolle presenti nei tubuli canale di flusso tra la coppa del campione e la camera di analisi. Per fare ciò, clicca ACQUIRE e flick delicatamente il tubulo fino a quando non bolle vengono acquisite (come si vede nella finestra di acquisizione).
    5. Impostazione di tutti i parametri di misura e rilevamento come segue fluorescenti e TOF:
      1. Impostare le scale per TOF, Ext, verde, giallo e rosso per256. Imposta guadagno come descritto nella tabella 1. Impostare PMT controllo al 700 per verde e giallo e di 900 per Red.
        NOTA: Due filtri di eccitazione sono disponibili (488 nm e 514 nm) e può essere utilizzato per eccitare o proteina verde fluorescente (GFP) o proteina fluorescente gialla (YFP) o qualsiasi fluorocromi eccitati a queste lunghezze d'onda con il laser ad argon multilinea. filtri appropriati devono essere inserite nella camera filtrante dell'apparecchiatura. Abbiamo utilizzato il filtro 488 nm per il seguente esperimento.
    6. Per calibrare il sorter verme, selezionare "particelle di controllo Esegui" nel menu strumenti. Mettere 20 ml di 1x GP (General Purpose) ad alta fluorescenza particelle di controllo nella tazza (queste particelle sono particelle fluorescenti di dimensione precisa, venduti dal produttore citometria per calibrare il loro strumento).
    7. Fare clic sul pulsante acquisire per iniziare la guaina e il flusso del campione.
      NOTA: Aspettatevi un mezzo relativo alla distribuzione di controllo delle particelle di 21 ± 6 e ACoefficient di variazione intorno a quella media (CV) ≤11. Se il CV è> 11 e la media è> 27 provare a pulire i tubuli cliccando più volte sul tasto pulita o muovendo il canale di flusso.
  3. Acquisizione di TOF Animal
    NOTA: diffonde la luce quando un oggetto passa nella cella di flusso tra la sorgente laser e il rilevatore di estinzione. Il tempo necessario per la luce sia diffusa dalla oggetto volante (tempo di volo, TOF) viene utilizzato per misurare la lunghezza assiale dell'oggetto. L'entità della luce mascherato dall'oggetto (estinzione, EXT) è usato come misura della sua opacità di densità / ottica.
    1. Mettere 10 ml di sincronizzato wild-type (WT) L1 in un vetro da orologio e stimare la percentuale di morti-uova utilizzando un microscopio da dissezione.
      NOTA: sincronizzato L1 visualizzazione alta Emb (superiore al 20%) in peso non deve essere utilizzato per ulteriori analisi.
    2. Trasferimento sincronizzato L1 dal microcentrifuga (unapproximately 700 ml di M9 contenente L1) in un tubo da 15 ml. Aggiungere ioduro di propidio (PI) ad una concentrazione finale di 10 pg / ml (diluizione 1/100 da un / ml di soluzione 1 mg) e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
      NOTA: le uova e le larve morti saranno colorate usando PI e rilevati come oggetti altamente fluorescenti che utilizzano il canale rosso.
    3. Aggiungere 10 ml di tampone M9 per diluire le popolazioni macchiati. Prendere 5 ml delle popolazioni diluiti e diluire loro quattro volte aggiungendo 15 ml di M9. Mettere questa diluizione in coppa campioni.
    4. Eseguire il flusso del campione facendo clic ACQUIRE ed osservare la portata.
      NOTA: Per avere una misurazione accurata, la portata deve rimanere tra 15 e 25 oggetti / sec.
    5. Se necessario, regolare la quantità di animali nella tazza per raggiungere la portata desiderata.
      NOTA: La volontà portata dipende dalle pressioni (guaina e campione) che sono costanti come indicato in 3.2.3 e sulla concentrazione di larve in la coppa. Se la portata è superiore a 25 oggetti / sec aggiungere qualche tampone nella tazza. Se è inferiore a 15 oggetti / sec Inserisci L1 concentrato (dal punto 3.3.3) nella tazza.
    6. Una volta che la concentrazione appropriata scopo viene raggiunto, valutare il volume nella tazza e aggiungere 1/4 th di questo volume in soluzione alta fluorescente GP controllo Particelle 4x.
    7. Regolare il parametro gating e smistamento. Per fare ciò, clicca su 'gating' nel menu e selezionare 'TOF contro' e 'verde'. Clicca su 'Ordinamento' nel menu e selezionare 'TOF contro' e 'Red'. Gating e grafica smistamento appariranno come mostrato nella Figura 3A.
      NOTA: Questo permetterà la visualizzazione delle particelle di controllo (emissione in verde e rosso), animali morti macchiate di PI e bollicine (emissione in rosso e non verde) e gli animali che vivono (senza emissione nei canali né verde né rosso) (Figura 3A ).
    8. Simula cliccando ACQUire.
      NOTA: per identificare le differenze di piccole dimensioni tra larve, analizzare circa 10.000 oggetti, quindi circa 8.000 animali. Interrompere l'esperimento ed esportare i dati come formato .txt cliccando su STORE.
  4. Misura della dimensione relativa di animali vivi in sincronizzati Popolazioni
    1. Aprire il file .txt utilizzando un software in grado di gestire grandi tabelle di dati.
    2. Da oggetti analizzati estraggono i valori TOF associati con particelle di controllo che sono caratterizzate da emissioni nel canale verde superiore a 100 unità arbitrarie (questo valore dipende dai parametri impostati nella sezione 3.2.5). Creare una nuova colonna e chiamarlo 'particelle di controllo. Creare una colonna che contiene tutti gli altri oggetti, tranne le particelle di controllo denominato 'campione'. NOTA: l'emissione di fluorescenza di nuovi bisogni lotti delle particelle da verificare prima di iniziare le acquisizioni. Ciò impostare la soglia di fluorescenza che consenta di individuareparticelle di controllo oltre L1S.
    3. Per ogni ceppo analizzato identificare la porzione di esperimento in cui la portata è stato modificato (a causa della presenza di un tappo di uova per esempio). Fare così:
      1. Tracciare la TOF di 'particelle di controllo' per ogni campione come un fattore di tempo (Figura 3B).
      2. Disegnare la linea di tendenza lineare utilizzando lo strumento linea di tendenza e visualizzare l'equazione sul grafico.
        NOTA: Il TOF delle particelle di controllo deve essere costante nel tempo (linea orizzontale, Figura 3B). Considerando l'equazione della linea di tendenza lineare, disegnato sui dati y = ax + b, assicurarsi che la 'a' valore è inferiore che il 10 -4. Tutte le misurazioni effettuate entro sezioni temporali che mostrano una rottura nell'allineamento delle particelle di controllo devono essere rimossi dall'analisi.
    4. Rimuovere gli embrioni morti e bolle (emissione superiore 15 in rosso) e piccoli detriti e grandi spine uovo (TOF inferiore 10 e altaER di 70 rispettivamente), dalla misurazione 'campione'.
    5. Tracciare la distribuzione 'delle particelle di controllo' per ogni ceppo analizzato. Come si vede in Figura 3C queste distribuzioni dovrebbero sovrapporre quasi perfettamente. Questo assicura che le misurazioni TOF ottenute per diversi ceppi possono essere confrontati. NOTA: la normalizzazione di elementi campione TOF su particelle di controllo possono essere utilizzati se le distribuzioni delle particelle di controllo in un campione non si sovrappongono a quello di campioni di controllo. TOF normalizzato vengono calcolati come seguito:
      1. Normalizzare TOF per il genotipo G = (TOF campione per G) / ( 'il controllo delle particelle' TOF medio per G) x (media 'particella di controllo' TOF per peso) in cui peso è il campione di controllo.
    6. Tracciare la distribuzione larve TOF per ogni ceppo compreso campione di controllo, nel nostro caso WT animali (Figura 3D). Misurare la media e l'errore standard della media (SEM) per ciascuna popolazione ( Figure 5A e B).

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada e della Canada Foundation for Innovation. Grazie al dottor Paul Mains (Università di Calgary, Calgary, Canada) per il ceppo let-502 (sb118ts). Alcuni dei ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agar BioShopAGR001.500
AgarosioBioshopAGA001.500
CaCl2 (Cloruro di calcio)Bio Basic Inc.CT1330
ColesteroloSigma-aldrichC8667
Soluzione detergente unione Biometrica300-5072-000
Vetrini coprioggettiin vetro Fisherbrand12-542B
Vetrini Fisherbrand12-552-3
Unione di particelle di controllo ad alta fluorescenzaBiometrica310-5071-001
K2HPO4 (fosfato di potassio, bibasico)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (fosfato di potassio, monobasico)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (solfato di magnesio)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4(fosfato di sodio, bibasico)Bio Basic Inc.
NaCl (cloruro di sodio)Bio Basic Inc.DB0483
Pebeo Gomma da disegno 45  mlpé bé oPDG033000qualsiasi negozio d'arte/artigianato
PeptoneBioShopPEP403.500
Bocchettone tampone guainaBiometrica300-5070-100
COPAS Biosortunione Biometrica
SDB0487

Riferimenti

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