Gradiente di deformazione Chip per comportamenti stimolanti cellulari in cella-carichi idrogel

Sommario

Questo articolo introduce un approccio semplice per fornire ceppi statici gradiente discontinuo su un idrogel di cella-carichi concentrici per regolare l'allineamento di cella per l'ingegneria tissutale.

Abstract

Guida artificiale per allineamento cellulare è un tema caldo nel campo dell'ingegneria tissutale. La maggior parte della ricerca precedente ha studiato singolo allineamento cellulare indotta da sforzo su un idrogel carichi di cella utilizzando processi sperimentali complessi e controllo impianti di massa, che sono associate solitamente con problemi di contaminazione. Così, in questo articolo, vi proponiamo un approccio semplice per creare un gradiente ceppo statico utilizzando un chip fluidico con una copertura di plastica PDMS e un substrato di vetro trasparente UV per la stimolazione del comportamento cellulare in un idrogel 3D. Sovraccarico prepolimero cella foto-derivativazione nella camera di fluidica può generare una membrana PDMS curva convessa sulla copertina. Dopo reticolazione UV, attraverso un micropattern circolare concentrico sotto la membrana PDMS curvilinea e tampone di lavaggio, un microambiente per inquirente cella comportamenti sotto una varietà di ceppi di gradiente è self-consolidata in un singolo chip fluidico, senza strumenti esterni. Le cellule NIH3T3 sono state dimostrate dopo aver osservato il cambiamento di tendenza allineamento cellulare sotto la Guida di geometria, in collaborazione con stimolazione del ceppo, che varia da 15-65% su idrogel. Dopo 3 giorni di incubazione, la geometria di idrogel dominato l'allineamento della cella sotto sforzo di compressione basso, dove le cellule allineati lungo la direzione di allungamento di idrogel sotto alta deformazione compressiva. Tra questi, le cellule hanno mostrato allineamento casuale a causa della dissipazione del Consiglio radicale di idrogel allungamento e la Guida di geometria dell'idrogel di fantasia.

Introduzione

Che serve come un blocco di materiale che imita un microambiente nativo, un idrogel contenenti matrice extracellulare (ECM) può ri-costruire impalcature tessuto biomimetici per supportare la crescita delle cellule. Per possedere le funzioni di un tessuto, cellula organizzata allineamento è un requisito essenziale. Vari 2D (cioè, cellule coltivate su una superficie) e 3D (ad esempio, le celle incapsulate in un idrogel) gli allineamenti delle cellule sono stati raggiunti da coltura o incapsulamento di cellule in o su substrati flessibili con micro- o nano-pattern¹. Allineamento della cella 3D in microarchitettura è più attraente, come il microambiente è più vicino al tessuto nativo costrutto^2,3,4. Un approccio comune per l'allineamento di cella 3D è il cue geometrico di idrogel forma^2,3. A causa dello spazio limitato per proliferazione delle cellule nella direzione dell'asse corto, celle obiettivo allineare lungo la direzione di assi lunghi in un idrogel di micro-fantasia. Un altro approccio consiste nell'applicare a trazione Allungamento a idrogel per raggiungere celle allineamento parallelo alla direzione stretch^4,5.

Stimolazione biofisica su idrogeli di ECM, come deformazione compressiva o un campo elettrico, può regolare le funzioni delle cellule per integrazione tissutale adeguata, proliferazione e differenziazione^1,2,3. Gran parte della ricerca è stato fatto per studiare il comportamento cellulare mediante l'applicazione di una condizione di sforzo alla volta utilizzando più controllo meccanico unità^4,6,7,8,9. Ad esempio, l'uso di motori passo-passo meccanico spremuto o allungato su un idrogel di collagene 3D incapsulato delle cellule è stato un approccio comune^7,10. Tuttavia, tale apparecchiatura di controllo richiede spazio aggiuntivo e affronta il problema della contaminazione nell'incubatore^7,9,11,12. Inoltre, lo strumento di grandi dimensioni non può dare un ambiente di controllo preciso di fornire elevata riproducibilit๳.

Considerando che carichi di cella idrogeli sono in genere impiegati su micro-scala per applicazioni biomediche, è vantaggioso per combinare le tecniche MEMS per generare una gamma di stimolazione di ceppo/tratto contemporaneamente studiare i comportamenti delle cellule in 3D biomimetici costrutti in vitro^{2,14,15,16,17,18}. Ad esempio, utilizzando la pressione del gas per deformare la membrana PDMS in chip microfluidici possa dar luogo a vari ceppi, guidando la differenziazione delle cellule a diversi lignaggi^9,16. Tuttavia, ci sono molte sfide tecniche, quali i processi di fabbricazione di complicati chip in una camera pulita e il software di integrazione di controllo dei motori, pompe, valvole e gas compressi.

In questo lavoro, dimostriamo un approccio semplice per ottenere un chip di gradiente statico-ceppo microfluidici autosufficiente con l'ausilio di un modello di idrogel circolari concentrici e una membrana flessibile di PDMS. Diversamente dalla maggior parte degli approcci esistenti, la nostra piattaforma è un dispositivo portatile e USA e getta in miniatura che può essere fabbricato fuori una camera gialla e che possiede auto-generazione di gradienti ceppi su concentrici idrogeli incapsulato in cella, senza attrezzature meccaniche esterne durante l'incubazione. Comportamenti di cellulare dei fibroblasti 3T3 influenzata da una combinazione di forma idrogel e una varietà di segnali di orientamento elasticizzato trazione sono stati dimostrati durante l'osservazione di allineamento della cella all'interno di ambienti 3D ECM-mimetici nel chip gradiente di deformazione per 3 giorni.

Protocollo

1. Sintesi GelMA

1. Pesare 10 g di gelatina in polvere e aggiungerla a un pallone di vetro con 100 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Inserire un'ancoretta magnetica nel pallone e posizionare il pallone su una piastra riscaldante.
2. Coprire il pallone con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione dell'acqua. Impostare la temperatura della piastra riscaldante a 50-60 °C e l'agitatore a 100 giri/min per 1 ora per sciogliere bene la gelatina in polvere.
3. Dopo che la gelatina si è sciolta, aggiungere 8 mL di anidride metacrilico molto lentamente (una goccia al secondo) utilizzando una pipetta. Lasciare agire a 60 °C per 3 ore.
4. Aggiungere il DPBS preriscaldato (40 °C) al matraccio fino a un volume finale di 500 mL e lasciare bene la miscela per 15 minuti per arrestare la reazione.
5. Nel frattempo, tagliare una membrana per dialisi (14 kDa di peso molecolare tagliato) in diversi tubi lunghi 25 cm. Immergerli in acqua deionizzata (DI) per 15 minuti e fare un nodo per chiudere un'estremità dei tubi di dialisi.
6. Caricare la quantità appropriata (30 - 60 ml) di soluzione polimerica nelle provette per dialisi e chiudere l'altra estremità. Mettili in un bicchiere di plastica da 5 litri con acqua deionizzata per una settimana. Rinnovare l'acqua deionizzata due volte al giorno e mantenere la soluzione a 40 - 50 °C durante il processo di dialisi.
7. Raccogliere la soluzione dalla provetta in un flacone di vetro da 500 ml. Versare ~450 - 500 mL di soluzione in una coppa del filtro da 500 mL (dimensione dei pori di 0,22 μm) e applicare un vuoto alla tazza del filtro per forzare la soluzione a passare attraverso la membrana del filtro per la sterilizzazione.
8. Trasferire il polimero sterilizzato in diverse provette sterilizzate da 50 ml e conservarle in un congelatore a -80 °C per 3 - 5 giorni.
9. Liofilizzare il polimero a -80 °C per 1 settimana utilizzando un liofilizzatore per formare GelMA. Conservare il GelMA in congelatore a -80 °C.

2. Modifica del metacrilato di propile (TMSPMA) 3-(Trimetossisilil)Propile

1. Tagliare i vetrini commerciali in due piccoli pezzi (25 mm x 37,5 mm) e immergerli in una soluzione di NaOH 0,5 M per 4 ore. Lavare i vetrini con una grande quantità di acqua deionizzata.
2. Posizionare il vetrino su una griglia all'interno di un contenitore di vetro con etanolo al 95% e pulirlo con un ultrasuonatore a 43 kHz per 15 minuti. Asciugare il vetrino all'aria.
3. Immergere i vetrini in TMSPMA al 5% in etanolo al 99,5% per 1 ora.
4. Lavare i vetrini in etanolo al 95%, asciugarli all'aria e ricuocere il rivestimento TMSPMA in forno a 80 °C per 2 ore.

3. Fabbricazione di chip

1. Prendi una lastra di polimetilmetacrilato (PMMA) da 2 mm e una da 0,3 mm di spessore, applica del nastro biadesivo su un lato della superficie in PMMA e rilascia il rivestimento su un lato. Lasciare due lastre di PMMA di 2 mm di spessore e una lastra di 1 mm di spessore senza nastro biadesivo.
2. Tagliare al laser una lastra in PMMA di 2 mm di spessore senza nastro biadesivo a 42 mm x 30 mm per realizzare la piastra inferiore. Tagliare una lastra di PMMA di 2 mm di spessore con nastro biadesivo per realizzare il telaio perimetrale, con dimensioni esterne di 42 mm x 30 mm e dimensioni interne di 37,5 mm x 25 mm.
3. Tagliare al laser la lastra di PMMA di 0,3 mm di spessore con nastro biadesivo in un cerchio centrale di 12 mm con due canali di flusso larghi 2 mm e lunghi 8 mm sui lati opposti del cerchio (Figura 1a).
4. Per preparare lo stampo in PMMA per la colata del coperchio PDMS, assemblare i tre pezzi di componenti in PMMA dai passaggi 3.2-3.3 (Figura 1b) utilizzando del nastro biadesivo.
5. Taglia al laser una lastra di PMMA di 2 mm di spessore con nastro biadesivo in un pezzo di 5 cm x 5 cm con una matrice 3 x 3 di rettangoli cavi di 8,5 mm x 8,5 mm. Tagliare un altro pezzo di 5 cm x 5 cm con una matrice 3 x 3 di cerchi cavi da 4 mm. Taglia al laser una lastra in PMMA di 1 mm di spessore senza nastro biadesivo in una lastra inferiore in PMMA di 5 cm x 5 cm.
6. Preparare lo stampo in PMMA per la fusione del tappo PDMS assemblando i tre pezzi di componenti in PMMA dal passaggio 3.5 (Figura 1c) utilizzando nastro biadesivo.
7. Preparare il coperchio e il tappo PDMS mescolando correttamente 30 g di elastomero PDMS e 3 g di agente indurente PDMS; degassare la miscela in una camera a vuoto per 1 ora.
8. Versare 1,8-2,0 g di miscela nello stampo in PMMA per il coperchio PDMS e utilizzare la quantità appropriata per riempire ogni cavità dello stampo in PMMA per il tappo PDMS. Versare 10 g di miscela PDMS non polimerizzata in una piastra di plastica vuota da 10 cm. Mettere questi stampini in una camera a vuoto a degassare per 30 min.
9. Polimerizzare il PDMS per 2 ore a 80 °C. Dopo aver raffreddato il PDMS polimerizzato sullo stampo, staccare i coperchi del PDMS e i tappi PDMS dagli stampi in PMMA.
10. Praticare due fori con diametro di circa 3 mm alle estremità dei canali di flusso dei coperchi PDMS.
11. Tagliare il foglio PDMS stampato dalla lastra di plastica da 10 cm in tanti cubetti di 1 cm x 1 cm e praticare un foro di 3 mm in ogni cubo PDMS. Incollare due cubi PDMS non polimerizzati di 1 cm x 1 cm sulle aperture del coperchio PDMS (per fungere da serbatoi di terreno e per facilitare il processo di polimerizzazione dei modelli circolari di idrogel a gradiente) e polimerizzare per 1 ora a 80 °C.
12. Incollare i coperchi PDMS con i due serbatoi PDMS su un vetrino rivestito in TMSPMA pretrattando il lato di incollaggio del coperchio PDMS e il vetrino rivestito in TMSPMA sotto una macchina al plasma a ossigeno (30 W di potenza RF (modalità alta) e aria compressa 600 mTorr) o un generatore corona elettronico ad alta frequenza (115 V, 50/60 Hz, 0,35 A) per 90 s di trattamento al plasma O₂.
13. Entrare in contatto con la superficie trattata al plasma dei coperchi PDMS e del vetrino TMSPMA e premerli strettamente per ottenere un legame permanente attraverso la formazione di un legame Si-O-Si.
    NOTA: Mettere il truciolo in un forno a 80 °C per 1 ora può migliorare ulteriormente la forza di adesione.
14. Dopo il raffreddamento, immergere le patatine in etanolo al 95% per 15 minuti e asciugarle all'aria. Quindi, sterilizzare i chip sotto irradiazione UV per 1 ora e conservarli in una scatola avvolta in un foglio di alluminio nella cappa laminare.

4. Deformazione statica a gradiente sull'idrogel carico di cellule

1. Stampa e taglia un pezzo di fotomaschera, di dimensioni 25 mm x 37,5 mm, stampando il layout in Figura 2b su una pellicola trasparente. Regola la dimensione stampata di Figura 2b in modo che corrisponda alla dimensione in Figura 2a.
2. Preparare 100 mL di terreno DMEM con il 10% di FBS, l'1% di Pen-Strep e 250 mL di DPBS in un bagno d'acqua a 37 °C da utilizzare come terreno di coltura cellulare.
3. Pesare 25 mg di GelMA liofilizzato in 0,3 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato (37 °C) in una provetta da microcentrifuga nera da 1,5 mL. Mettere la provetta per microcentrifuga su un agitatore da laboratorio/piastra riscaldante fino a quando il GelMA non si dissolve nel terreno.
4. Pesare 50 mg di fotoiniziatore in 1 ml di DPBS in una provetta da microcentrifuga e metterlo in un forno a 80 °C per 15 minuti o fino a quando il fotoiniziatore non si è sciolto.
5. Prelevare 25 μl del fotoiniziatore al 10% del passaggio 4.4 e aggiungerlo alla provetta per microcentrifuga del passaggio 4.3. Pipettare più volte per mescolare bene.
6. Contare 3 x 10^{celle da 6} NIH 3T3 utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Centrifugare la sospensione a 200 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 175 μl di terreno di coltura cellulare.
7. Aggiungere la soluzione cellulare del passaggio 4.6 alla provetta per microcentrifuga del passaggio 4.5 per ottenere una soluzione di cella prepolimerica di GelMA al 5%, fotoiniziatore allo 0,5% e ~6 x 10⁶ celle 3T3/mL. Dopo la miscelazione, caricare 100 μl di prepolimero cellulare in una micro siringa da 100 μl.
8. Allineare manualmente (vedere Figura 3a) un pezzo della fotomaschera sul vetrino inferiore del chip di deformazione a gradiente sterilizzato e fissare semplicemente la posizione utilizzando una piccola goccia di acqua deionizzata in mezzo. Collegare la microsiringa da 100 μl caricata con soluzione di cellule prepolimeriche all'ingresso del chip.
9. Posizionare (vedere Figura 3b) 50 μL di soluzione di cellule prepolimeriche nel canale di flusso utilizzando la micro-siringa e quindi tappare l'uscita utilizzando un tappo PDMS. Iniettare altri 40 μl di soluzione per creare un rigonfiamento convesso nella membrana circolare PDMS.
10. Spostare il chip con la fotomaschera (in basso), la micro-siringa (ingresso) e la spina PDMS (uscita) dal passaggio 4.9 sotto una lampada UV (365 nm, 9 mW/cm²) ed esporlo per 30 - 45 s per reticolare l'idrogel circolare concentrico nella camera fluidica.
11. Rimuovere il tappo PDMS e la micro-siringa per rilasciare la pressione del liquido (vedere Figura 3c). Utilizzare una siringa da 1 ml caricata con DPBS preriscaldato per lavare le resine non reticolate 3 volte sciacquando dall'ingresso all'uscita.
12. Riempire il canale di flusso con circa 100 μL di terreno di coltura cellulare.
13. Mettere il chip in un piatto di coltura sterilizzato e fermentare in un'atmosfera di CO₂ al 5% a 37 °C per una settimana. Rinfresca il mezzo ogni giorno.
14. Scattare immagini di tre chip il giorno 0 dopo 4 ore di incubazione, come gruppo di controllo, e tre chip il giorno 3, come set sperimentale, utilizzando un microscopio con un obiettivo 20X. Misurare la larghezza della linea di ciascun idrogel dalla linea 1 alla linea 12 utilizzando il software (ad es. ImageJ) per calcolare le deformazioni di compressione ( Figura 4).
    NOTA: La percentuale di allungamento viene calcolata dividendo il valore della differenza di larghezza della linea tra 40 μL e 0 μL per la larghezza della linea a 40 μL.

5. Colorazione delle celle per l'analisi dell'allineamento

1. Utilizzare una siringa per iniettare il 4% di paraformaldeide (PFA) in DPBS a RT nel chip di flusso per 15 minuti per la fissazione dell'idrogel carico di cellule.
   NOTA: Attenzione. Il PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
2. Sostituire la soluzione con una soluzione permeante la membrana cellulare allo 0,5% in DPBS per 10 minuti per permeabilizzare la membrana cellulare a RT.
3. PBS lava i campioni 3 volte con un intervallo di 5-10 minuti tra i lavaggi (utilizzando una siringa carica, come al punto 5.1).
4. Caricare la soluzione BSA all'1% nel canale fluidico per 45-60 minuti a RT (utilizzando una siringa carica attraverso la porta di ingresso).
5. Aggiungere 1,5 mL di metanolo nella fiala con la falloidina Alexa Fluor 488 per ottenere una concentrazione finale di 6,6 μM di soluzione madre.
6. Prelevare 5 μL di falloidina Alexa Fluor 488 dal passaggio 5.5 e diluirla in 200 μL di DPBS con 0,1% BSA per formare una concentrazione finale di 0,165 μM di falloidina Alexa Fluor 488.
7. Aggiungere 200 μl della soluzione della miscela al canale fluidico utilizzando una micropipetta e incubare il chip a 37 °C per 45 - 60 minuti per la colorazione con actina. PBS lava (come sopra) i campioni 3 volte.
8. Preparare 1 μg/mL di DAPI in PBS, farlo passare attraverso il chip e colorare i nuclei cellulari a 37 °C per 5 minuti.
9. Pipettare il DPBS nel canale fluidico per lavare la soluzione colorante e riempire nuovamente la camera fluidica con la soluzione PBS per acquisire immagini con un microscopio a fluorescenza.
10. Acquisisci le immagini fluorescenti delle cellule 3T3 negli idrogel utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito con ingrandimento 40X con un rivelatore CCD e set di filtri ex/em a 488/520 nm e 358/461 nm per Alexa Fluor 488 falloidina (actina) e DAPI (nucleo), rispettivamente.

Risultati

Per confrontare le variazioni meccaniche tra ogni idrogel circolare nel chip stimolazione ceppo gradiente completato, abbiamo misurato la larghezza di riga di ogni idrogel circolare in due i chip stesso, con volumi di iniezione di 0 µ l (Figura 4a) e 40 µ l (Figura 4b), rispettivamente. Il percentuali allungamenti al ogni cerchio sono stati calcolati dividendo gli allungamenti nel chip 40 µ l-iniettato per la larghezza di riga ne...

Discussione

In questa carta, segnaliamo su un approccio semplice per confrontare il comportamento di allineamento delle cellule dopo idrogel forma di orientamento e di allungamento a trazione. Una membrana flessibile di PDMS crea una curvatura a forma di cupola per la generazione di diverse altezze di idrogeli circolari concentrici. Dopo aver rilasciato la pressione, la membrana PDMS applica automaticamente la forza per il micro-fantasia idrogeli per formare gradiente ceppo/allungamento, con un massimo al centro e un minimo al confi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta per microcentrifuga nera da 1,5 ml	Argos Technologies	03-391-161	Questo può essere sostituito con una provetta di colore neutro da 1,5 mL ricoperta con un foglio di alluminio
10x DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 falloidina	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
Sonda molecolare	calceina	C1430	per la marcatura di cellule vitali
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
Soluzione permeante la membrana cellulare	Sigma-Aldrich	X100	0,5% Triton X-100 per permeare la membrana cellulare
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	Colorazione del nucleo cellulare
Membrana per dialisi	Sigma-Aldrich	D9527	Cut-off del peso molecolare = 14.000
DMEM	Gibco	11995-065
Nastro biadesivo	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500	gel forza 300, tipo A, da pelle suina
Generatore di corona elettronico ad alta frequenza	Prodotti elettrotecnici	MODELLO BD-20
Anidride metacrilico	Sigma-Aldrich	276685
Micro siringa	Hamilton	80501	50 μ L
Microscopio	Olympus	IX71	Include due set di filtri: LF405/LP-B-000 e LF488/LP-C-000 di Semrock
Macchina al plasma di ossigeno	Harrick plasma	PDC-001
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Per il fissaggio della cella
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	Miscela per la fabbricazione di stampaggio a chip PDMS
Pen-Strep	Gibco	10378-016	penicillina/streptomicina
Fotoiniziatore	CIBA	Irgacure 2959
Ioduro di propidio	Sigma-Aldrich	P4170	Per l'etichettatura di cellule morte
Tazza di filtrazione sterile	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	Per l'immobilizzazione dell'idrogel
Ultrasuonatore	Delta	D150H	150W, luce UV 43kHz
	DAIHAN	WUV-L10
Liofilizzatore	FIRSTEK	150311025
NIH3T3 (fibroblast)Istituto	di ricerca e sviluppo dell'industria alimentare (FIRDI)	08C0011
MOXI Z Mini contatore di celle automatizzato	ORFLO	MXZ001