Questo protocollo descrive un test ad alto rendimento per testare le preferenze di deposizione delle uova di Drosophila melanogaster alla risoluzione di un singolo animale. Questo test fornisce una piattaforma semplice, efficiente e scalabile per identificare i geni e i componenti dei circuiti che controllano un semplice processo decisionale.
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Articolo metodologico
High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Recentemente, la preferenza deposizione delle uova di Drosophila è emersa come un modello geneticamente trattabili per studiare le basi neurali di semplici processi decisionali. Quando si seleziona siti per depositare le loro uova, mosche femmine sono in grado di rango l'attrattiva relativa delle loro opzioni e scegliere il "maggiore tra due beni." Tuttavia, la maggior parte dei test di preferenza deposizione delle uova non sono pratici se si vuole prendere un approccio sistematico screening genetico per la ricerca di base del circuito alla base di questo semplice processo decisionale, in quanto sono basati sulla popolazione e laborioso da configurare. Per aumentare il throughput di studiare delle preferenze ovaiole di singole donne, abbiamo sviluppato le camere personalizzate che ciascuno può allo stesso tempo saggio preferenze deposizione delle uova fino a trenta individuale vola così come un protocollo che garantisce ogni femmina ha un alto tasso di deposizione delle uova (in modo che la loro preferenza è facilmente distinguibile e più convincente). Il nostro approccio è semplice da eseguiree produce risultati molto consistenti. Inoltre, queste camere possono essere equipaggiate con diversi accessori per consentire la registrazione video gli animali deposizione delle uova e per fornire luce per gli studi optogenetics. Questo articolo fornisce i progetti per la realizzazione di queste camere e la procedura per preparare le mosche per essere analizzati in queste camere.
Introduzione
Drosophila melanogaster è un potente organismo modello genetico per studiare le basi neurali dei comportamenti. I rapidi sviluppi di strumenti genetici per manipolare i neuroni in modo mirato e l'emergere di sofisticati strumenti di analisi comportamentale hanno migliorato significativamente la nostra capacità di sezionare i meccanismi circuitali che sono alla base dei processi di trasformazione senso-motoria di diversi comportamenti innati e appresi1-3.
La deposizione delle uova di Drosophila è un modello adatto per studiare le basi neurali di semplici processi decisionali. In particolare, le femmine di Drosophila hanno dimostrato di possedere la capacità di confrontare e classificare le loro opzioni prima di "impegnarsi" a depositare un uovo su una data opzione4-8. Ad esempio, quando viene dato solo un substrato semplice (senza saccarosio) o solo un substrato contenente saccarosio, le femmine accettano prontamente entrambe le opzioni per la deposizione delle uova. Tuttavia, quando vengono presentate entrambe le opzioni, le femmine robuste rifiutano il substrato di saccarosio in alcuni contesti7,9,10. Tuttavia, si sa relativamente poco sui meccanismi neurali che consentono alle femmine di "scegliere il maggiore dei due beni". Uno dei principali ostacoli è stata la mancanza di un metodo efficiente per valutare le preferenze di deposizione delle uova in modo da poter utilizzare un approccio sistematico di screening genetico per studiare questo problema.
In questo rapporto, descriviamo il protocollo che abbiamo sviluppato che consente di analizzare le preferenze di deposizione delle uova delle femmine con risoluzione di un singolo animale e con una produttività e una coerenza sostanzialmente migliorate rispetto ai metodi precedenti. In particolare, forniamo i progetti per la costruzione delle camere che abbiamo progettato, il protocollo per preparare le femmine in modo che ognuna sia pronta a deporre molte uova e il protocollo per l'utilizzo delle camere.
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Protocollo
1. Preparazione mosche da dosare
- Cultura vola di melasso normali / media farina di mais in incubatore a 25 ° C e 65% di umidità. Fare attenzione a non affollare i flaconi. Per esempio, mettere 8 femmine e 6 maschi in una stretta fiala di cibo.
Nota: Il "flaconcino cibo stretta" qui utilizzato ha un diametro interno di 2,3 cm. Noi di solito dispensati circa 10 ml di cibo volare in ogni fiala. La ricetta cibo mosca che abbiamo usato è descritto qui: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 giorni dopo femmine eclosion, preparare fiale con pasta di lievito fresca come mostrato nella Figura 1E. Rendere pasta di lievito fresca miscelando 6 g di lievito attivo con 10 ml di acido proprionic 0,5%. Utilizzare una spatola per applicare la pasta di lievito sul fianco delle fiale alimentari. Raccogliere 30 - 35 femmine eclosed insieme a 20 - 25 maschi nelle fiale.
- In generale, raccogliere i maschi dalle stesse fiale in cui sono raccolti le femmine(In modo da risparmiare tempo e fatica). Tuttavia, se non vi è preoccupazione per la fertilità dei maschi, utilizzare i maschi WT. Inoltre, pasta di lievito è importante per stimolare la produzione di uova quindi prepararlo fresco ogni giorno.
- Mantenere la raccolta femmine / maschi a 25 ° C, 65% di umidità, a meno che le mosche sono sensibili alla temperatura.
- Dopo ~ 4 - 5 giorni, controllare le fiale per vedere se le femmine sono pronti per esperimenti di deposizione delle uova. Sono pronti quando la superficie del mezzo cibo è bagnato dalla larve scavando attivamente il cibo (vedi Figura 1E - F).
Nota: Le femmine di solito trattengono uova, che una volta che la superficie del cibo diventa bagnata e brulicante di larve. Questo passaggio garantisce che le femmine sarebbero pronti a deporre molte uova quando incontrano substrati con consistenza desiderata (ad es., ~ 1% agarosio).
2. Camera di costruzione, di montaggio, di installazione Assay
- Avere un negozio di macchina costruire camere di deposizione delle uova in acrilico (Fifigura 1A - D). Il disegno di ingegneria di diversi pezzi sono stati mostrati in figura supplementare 1 -. 3 immagini ad alta risoluzione si possono trovare anche qui (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Inserire fogli di plastica in carico (alto) pezzo della camera, come mostrato nella Figura 1C. Questo serve come la superficie inferiore durante il caricamento vola in singole arene deposizione delle uova.
- Anestetizzare le femmine su un rilievo di CO 2 e caricarli singolarmente in ogni arena deposizione delle uova. Consentire ~ 30 min per le mosche di recuperare dal CO 2 e per acclimatarsi al nuovo ambiente.
- Preparare i substrati agarosio.
- Per comodità, tenere una bottiglia premade del fuso 1% agarosio a bagnomaria C 55 °.
- Aggiungere la quantità desiderata di soluzione madre di saccarosio (2 M) in una provetta conica da 50 ml e mescolandolo con quantità appropriata di agarosio. Ad esempio, per preparare il substrato 150 mM saccarosio, place 750 ml di 2 M soluzione di saccarosio nel tubo e quindi riempire il tubo con agarosio al segno 10 ml.
- Preparare il substrato pianura nello stesso modo ma aggiungere acqua distillata al posto della soluzione di saccarosio.
Nota: La concentrazione finale di agarosio in questo protocollo è leggermente inferiore a 1%. Nella nostra esperienza, l'esatta concentrazione di agarosio non importa fintanto che viene controllato per essere all'interno di ~ 0,9 - 1,1% e che i due substrati sono della stessa concentrazione di agarosio.
- Prendere il pezzo della camera e pipetta 1000 ml di substrato agarosio substrato (in basso) in ciascun canale, come mostrato nella Figura 1D.
- Lasciare agarosio solidificare per ~ 30 min.
- Una volta che i substrati di agarosio e mosche sono pronti, assemblare tutti i tre pezzi della camera di deposizione delle uova e poi prendere i fogli di plastica.
- Mettere le camere in incubatrici mosca.
Nota: Lunghezza di esperimenti di deposizione delle uova può variare a seconda espeesigenze rimental. Noi di solito Simula O / N (14 - 16 ore). Inoltre, è stato osservato alcun impatto significativo dei tempi circadiano sulle preferenze di deposizione delle uova. - Anestetizzare le femmine iniettando CO 2 nella camera. Smontare la camera, scartare le mosche anestetizzati in volo all'obitorio (es., Un caffè vuota può riempito con alcuni olio di mais). Prendere le immagini dei risultati per registri (vedi figura 2).
- Contare il numero di uova manualmente e calcolare gli indici di preferenza per l'analisi. Calcolare l'indice preferenza come (N a - N b) / (N + N un b) dove N e N un B rappresentano il numero di uova in loco un sito vs. b, rispettivamente.
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Risultati
Le camere di deposizione delle uova sono composti da diversi pezzi: un pezzo di substrato (in basso), un pezzo di divisione (al centro), un pezzo di carico (in alto), e 2 porte scorrevoli (Figura 1A - D). Questi pezzi sono utilizzati per indipendentemente mosche di impostazione e substrati prima degli esperimenti di deposizione delle uova. La figura 1F mostra come flaconcini devono guardare quando le mosche di sesso femminile sono pronte per la deposizio...
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Discussione
Le camere e protocolli descritti qui sono diversi miglioramenti rispetto ai precedenti test di deposizione delle uova. Innanzitutto, aumentano la velocità di saggiare preferenze dei singoli animali significativamente. Ogni camera può saggiare 30 singole femmine e richiede meno di un'ora di set up. In secondo luogo, aumentano la consistenza delle preferenze di deposizione delle uova rispetto ai metodi precedenti. La standardizzazione delle dimensioni dell'arena, le dimensioni dei substrati deposizione delle uova,...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Duke Physics Shop, in particolare Phil Lewis, per averci aiutato a costruire l'apparato comportamentale e gli allegati e a creare il disegno. Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health con il numero di premio R01GM100027.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio UltraPuro | Invitrogen | 16500-500 | |
| Saccarosio | Sigma | S0389 | |
| Bagnomaria | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| LED rossi | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Camere per la deposizione delle uova Supporti | su misura | ||
| Supporti per LED | |||
| Fiale per mosche su misura (strette) | Genesee | 32-116 a.C |
Riferimenti
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
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