Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Summary

Le tecniche di microscopia ottica abbinate a saggi biochimici chiariscono il coinvolgimento dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni netrina-dipendente. Questa combinazione di tecniche consente l'identificazione dei meccanismi molecolari che controllano la ramificazione degli assoni e il cambiamento della forma cellulare.

Abstract

Durante lo sviluppo neurale, gli assoni in crescita si estendono a più partner sinaptici elaborando rami assonali. La ramificazione degli assoni è promossa da segnali di guida extracellulari come la netrina-1 e si traduce in un drammatico aumento della superficie della membrana plasmatica assonale. La ramificazione dell'assone netrina-1-dipendente probabilmente comporta il controllo temporale e spaziale dell'espansione della membrana plasmatica, i cui componenti sono forniti attraverso la fusione delle vescicole esocitiche. Questi eventi di fusione sono preceduti dalla formazione di complessi SNARE, comprendenti un v-SNARE, come VAMP2 (proteina di membrana associata alla vescicola 2), e t-SNARE di membrana plasmatica, sintassina-1 e SNAP25 (proteina 25 associata al sinaptosomio). Di seguito è descritto un approccio su più fronti utilizzato per esaminare il ruolo dell'esocitosi mediata da SNARE nella ramificazione degli assoni. Il punto di forza dell'approccio combinato è l'acquisizione di dati a una gamma di risoluzioni spaziali e temporali, che vanno dalla dinamica degli eventi di fusione di singole vescicole in singoli neuroni alla formazione del complesso SNARE e alla ramificazione degli assoni in popolazioni di neuroni in coltura. Questo protocollo si avvale di approcci biochimici consolidati per analizzare i livelli dei complessi endogeni SNARE e della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) di neuroni corticali che esprimono VAMP2 marcati con una GFP sensibile al pH (VAMP2-pHlourin) per identificare i cambiamenti dipendenti dalla netrina-1 nell'attività esocitaria nei singoli neuroni. Per chiarire la tempistica della ramificazione dipendente dalla netrina-1, viene utilizzata la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) time-lapse di singoli neuroni nell'ordine di ore. L'immunofluorescenza cellulare fissa abbinata a neurotossine botuliniche che scindono il meccanismo SNARE e bloccano l'esocitosi dimostra che la ramificazione dell'assone dipendente dalla netrina-1 richiede un'attività esocitica mediata da SNARE.

Introduction

Stime recenti suggeriscono che il cervello umano contiene 10¹¹ neuroni con 10¹⁴ connessioni sinaptiche¹, evidenziando l'importanza della ramificazione degli assoni in vivo. I segnali di guida degli assoni extracellulari come la netrina-1 guidano gli assoni verso i partner sinaptici appropriati e stimolano la ramificazione assonale, aumentando così la capacità sinaptica^2-5. L'arborizzazione assonale netrin-1-dipendente comporta una sostanziale espansione della membrana plasmatica⁶, che abbiamo ipotizzato richieda la consegna di ulteriori componenti di membrana tramite la fusione delle vescicole esocitiche ....

Protocol

Dichiarazione di etica della ricerca: Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali descritti nel presente documento sono soggetti alle norme e ai regolamenti del Comitato UNC sulla cura degli animali e agli standard NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione e placcatura di dissociato neuroni corticali

1. Euthanize femmine tempestivi incinta di CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale. Rimuovere cervelli interi dai teschi dei embrionali giorno 15,5 (E15.5) topi e microdissect cortecce da ciascun emisfero. Per le istruzioni dettagliate per quanto riguarda la microdis....

Results

Utilizzando tecniche biochimiche in vitro per saggiare la quantità di SDS-resistenti complessi SNARE in una popolazione di neuroni. La figura 1 mostra la conseguente Western Blot a seguito del completamento del SDS-resistente SNARE saggio complesso sondato per SNAP-25, syntaxin1A e VAMP2.

TIRF Microscopia a livello della membrana delle cellule basali fornisce immagini ad alta risoluzione di singoli ev.......

Discussion

La ramificazione degli assoni è un processo fondamentale dello sviluppo neurologico ed è alla base della vasta neuroconnettività del sistema nervoso dei mammiferi. La comprensione dei meccanismi coinvolti nell'espansione localizzata della membrana plasmatica è parte integrante della nostra comprensione del neurosviluppo sia normale che patologico. L'uso di un approccio su più fronti che incorpora sia le metodologie a livello di popolazione che a livello di singola cellula migliora la riproducibilità e aumenta la risoluzi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre trattate per colture tissutali a 6 pozzetti	Olympus Plastics	25-105
vetrini coprioggetti	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; devono essere trattati con acido nitrico per 24 ore, risciacquati in acqua deionizzata 2 volte e asciugati prima dell'uso. Deve essere rivestito con 1 mg/ml di poli-d-lisina e risciacquato prima della placcatura delle cellule.
Soluzione di nucleofeczione Amaxa	Lonza	VPG-1001	100 ml/trasfezione
Amaxa Nucleofector/elettroporatore	Programma Lonza		O-005
35 mm Piastre per l'imaging di cellule vive con fondo in vetro	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	deve essere rivestito con 1 mg/ml di poli-d-lisina e risciacquato prima di placcare le celle
Microscopio invertito Olympus IX81-ZDC2 Olympus
Lambda LS lampada allo xeno	Sutter Instruments Company
Incubatore ambientale Stage top	Tokai Hit
100x 1.49 NA Obiettivo TIRF	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Sistema di imaging a infrarossi	LI-COR	Odyssey CL-X	Utilizzato per la scansione di macchie
Studio di immagini suite software	LI-COR		Utilizzato per la scansione sul sistema a infrarossi Odyssey; Image Studio lite utilizzato per l'analisi offline dei blot
Metamorph per Olympus	Molecular devices, LLC	versione 7.7.6.0	Software utilizzato per tutte le immagini e l'analisi del timelapse DIC
Software di controllo TIRF CELL	Software Olympus		utilizzato per controllare i laser per l'imaging TIRF
Fiji (Immagine J)	NIH	ImageJ Versione 1.49t
60x Piano Apocromatico 1.4 NA	Obiettivo Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat	Olympus
	GIBCO	21103-049	Soluzione base per terreni di estinzione privi di siero e tripsina
Integratore B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Terreni privi di siero e terreni di tempra della tripsina
L-Glutammina		35050-061	1 ml/50 ml Terreni privi di siero
Albumina sierica bovina	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	soluzione al 10% in 1x PBS per il blocco dei vetrini; soluzione al 5% in TBS-T per il blocco delle membrane nitrocellulosiche.
10x  tripsina	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Siero fetale bovino	Corning/CELLGRO	35-010-CV
salina bilanciata di Hank (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glicerolo Grado fotometrico	Acros Organics	18469-5000
Glicerolo (grado non ottico)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoetonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Acqua distillata	GIBCO	152340-147
Poli-D-lisina	Sigma	p-7886	Disciolto in acqua sterile a 1 mg/ml
Tossina botulinica A BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit policlonale anti umano VAMP2	Segnalazione cellulare	11829
Monoclonale di topo anti ratto Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Capra policlonale anti umano SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Topo monoclonale anti umano & beta; III-tubulina	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 e Alexa Fluor 488 falloidina, o Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye anticorpi secondari	LI-COR	P/N 925-32212, P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 asino anti-topo, 680 asino anti coniglio, 680 asino anti capra
0.2 μ m dimensione dei pori membrana nitrocellulosica	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Metanolo	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Saccarosio	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldeide	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrilimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
>Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Sinaptobrevina monoclonale di topo 2 (VAMP2)	Sistemi sinaptici	104-211
sinaptici	monoclonali di topo SNAP25	111-011