Qui ci avvaliamo di una metodologia per monitorare FISH LINE-1 retrotrasposizione a livello di nuclei singolo degli spread dei cromosomi di linee cellulari HepG2 esprimono stabilmente sintetica LINE-1.
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Articolo metodologico
Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elemento nucleare lungo intervallato-1 (Linea-1 o L1) rappresenta circa il 17% del DNA presente nel genoma umano. Mentre la maggior parte degli L1sono inattivi a causa di troncamenti 5', ~80-100 di questi elementi rimangono competenti per la retrotrasposizione e si propagano in diverse posizioni in tutto il genoma tramite intermedi di RNA. Mentre si ritiene che gli L1 più vecchi abbiano come bersaglio le regioni ricche di AT del genoma, i bersagli cromosomici degli L1 più recenti e più attivi rimangono scarsamente definiti. Qui descriviamo la metodologia di ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) che può essere utilizzata per tracciare i modelli di inserzione di L1 e i tassi di incorporazione ectopica di L1 a livello di singolo nucleo. In questi esperimenti, sono state impiegate sonde di neomicina marcate con fluoresceina isotiocianato/cianine-3 (FITC/CY3) per tracciare la retrotrasposizione di L1 in vitro in cellule HepG2 che esprimono stabilmente L1 ectopico. Questa metodologia previene gli errori nella stima dei tassi di retrotrasposizione posti dalla tossicità e tiene conto del verificarsi di inserzioni multiple in un singolo nucleo.
Introduzione
Umana Lungo intersperse nucleare Element-1 (Linea-1 o L1) è un elemento mobili ed autonome che si propaga all'interno del genoma attraverso un "copia e incolla" meccanismo di retrotrasposizione. Un tipico L1 umano è lunga ~ 6 kb e consiste di un 5'UTR (Regione Untranslated) che serve come un promotore, due telai di lettura aperti (ORF): L1 -ORF1 e L1 -ORF2, e un 3'UTR con polyA . coda L1 proteina -ORF1 ha tre ambiti distinti: un dominio della bobina a bobina, RNA riconoscimento Motif e dominio C-terminale, mentre la proteina L1 -ORF2 ha endonucleasi, trascrittasi inversa e cisteina domini ricc....
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Protocollo
NOTA: Tutte le fasi deve essere effettuata a temperatura ambiente a meno che diversamente specificato. Si prega di fare riferimento alla sezione Reagenti per i dettagli su come preparare i singoli reagenti.
1. Etichettatura L1 Sonde
NOTA: Le sonde possono essere etichettati, mediante l'etichettatura chimica o PCR.
- etichettatura chimica
- Rendere 0,7-1% gel di agarosio in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE), il calore in un forno a microonde fino a fuso, permettono il gel raffreddare, quindi aggiungere etidio bromuro (0,5 mg / ml). Versare in vassoio gel, aggiungere p....
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Risultati
Un diagramma schematico del vettore retrotrasposizione L1 è presentato in Figura 1. Il vettore costituito da un gene neomicina in orientamento antisenso per L1 ORF che è interrotta da un introne globina in orientamento senso e intramezzato da SD e siti SA. Quando stabilmente integrato in un cromosoma, L1 mRNA è trascritto dal combinato CMV e promotore L1-5'UTR (Figura 1). Durante l'elaborazione RNA, l'introne globin.......
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Discussione
Metodologie come il sequenziamento dell'intero genoma, inversa PCR e Southern blotting sono stati impiegati per studiare L1 retrotrasposizione. Sebbene queste metodologie sono estremamente utili nel localizzare dove si verificano inserimenti L1 all'interno di genomi, una sfida confusione per tutti loro è la necessità per la programmazione in-silico per riassemblare sequenze. La metodologia FISH descritta qui è concepito per integrare questi metodi, soprattutto nel caso di studi che ric.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza potenziali interessi in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte da sovvenzioni del National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 e ES017274) e di AstraZeneca a KSR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Labelling Probes | |||
| Go Tag DNA polimerasi | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x tampone incolore | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Regola la concentrazione di dATP, dGTP, dCTP a 2 mM e dTTP a 1,5 mM in acqua priva di nucleasi. |
| dUTP-16-Biotina (0,5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0,5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0,5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR | Qiagen | 1410/0030 | Qualsiasi reagente per la pulizia della PCR può essere utilizzato al posto del kit |
| Qualsiasi macchina per termociclatore può essere utilizzata per amplificare il prodotto dell'etichetta. | |||
| Agarosio | Sigma | A9539 | |
| Preparazione delle creme cromosomiche | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Aggiungere Colcemid direttamente al terreno di coltura fino a una concentrazione finale di 0,4 µ g/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Diluire 1 Soluzione M KCl a 75 Soluzione mM per preparare la soluzione ipotonica |
| Soluzione fissativa | Mescolare 3 volumi di metanolo e 1 volume di acido acetico per ottenere la soluzione fissativa Carnoy. Prepara Fresh ogni volta. | ||
| Metanolo | Sigma | 322415 | |
| Acido acetico | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Sciogliere Hoechst-33342 in PBS alla concentrazione finale di 1 mg/ml. |
| Marcatore a punta di diamante | Thermo Scientific | 750 | |
| vetrini smerigliati | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| tripsina-EDTA (0,25%) | Life Technologies | R001100 | Per detecare le cellule, incubare la cellula in tripsina per 5 minuti e inattiva con lo stesso volume di terreno completo. |
| Vetrini di copertura | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Blocco | Qualsiasi blocco termico può essere utilizzato per questo scopo, anche se si consigliano blocchi montati per vetrini riscaldanti. | ||
| Bicchiere (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Riempire il becher con acqua, scaldare fino a ebollizione, utilizzare il vapore caldo per far scoppiare i cromosomi. |
| Microscopio Nikon | Nikon | 125690 | Qualsiasi microscopio può essere utilizzato per osservare la qualità della diffusione. |
| Reagenti e materiali per FISH | |||
| Citrato trisodico | Sigma | S1804 | |
| Croride di sodio | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Solfato | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Sperma di salmone DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Alcool etilico | Sigma | 459844 | |
| Metanolo | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsina | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolvere Hoechst-33342 in PBS alla concentrazione finale di 1 mg/ml. |
| Sigillante per cemento di gomma/citobond | 2020-00-1 | ||
| Sette barattoli Coplin | Thermo Scientific | 107 | |
| Camera umidificata scura | Sigma | CLS2551 | |
| Vetrini di copertura | VWR | 48366067 | |
| Blocco termico digitale a secco | VWR | 13259 | |
| fluorescenza | |||
| 20x citrato di sodio-soluzione salina (20x SSC) | Unire 175 g di NaCl e 88,2 g di citrato trisodico con 800 ml di H2O. Agitare regolando a pH 7. Una volta che tutti i sali si sono sciolti, regolare il volume a 1 L e filtrare con 0,22 µ m Carta da filtro. Conservare a 4 °C. | ||
| 1 mg/ml di Rnasi A | Diluire 20 volte il tampone SSC in 2 volte il tampone SSC. Sciogliere la RNasi A in 2 tamponi SSC a una concentrazione finale di 1 mg/ml. Prepara una soluzione fresca ogni volta. | ||
| Pepsina | Sciogliere la pepsina (P/V) in 10 mM di HCl fino a una concentrazione finale di soluzione all'1%. Prepara fresco ogni volta. | ||
| 4% Paraformaldeide (4% PFA) | Pesare 4,0 g di PFA nella cappa aspirante, aggiungere 50 ml di 1xPBS, riscaldare a 60 ° C mescolando e regolare il pH con gocce di NaOH fino a quando tutto il PFA si dissolve e la soluzione diventa limpida. Regola il volume a 100 ml, filtrare 0,22 µ m Carta da filtro e conservare 5 ml di aliquote a -20 C. Aliquotazione di disgelo di PFA a 37 gradi C per 10-15 min per gli utilizzi successivi. Regolare la dimensione del filtro in base alla quantità di paraformaldeide. | ||
| Combinare | 100 ml di formammide (20%) con 2,5 ml di 20x SSC, regolare a pH 7 con 1,0 M di HCl e portare il volume a 500 ml con H2O di grado molecolare. | ||
| Tampone | Combina il 50% di formammide, il 10% di destrano solfato, lo 0,1% di SDS e 300 ng/ml di DNA spermatico di salmone in 2 tamponi SSC. La quantità di formammide determina quanto sono focalizzati i cromatidi; Titolate la quantità. | ||
| Tampone | Diluire 20x il tampone SSC a 4x e aggiungere lo 0,2% di Tween-20 per creare un buffer di rilevamento. | ||
| Combina | 5% di albumina sierica bovina (BSA) con lo 0,2% di Tween-20 in 4 tamponi SSC. | ||
| disidratante | Prepara soluzioni di etanolo al 70%, 80% e 95%. |
Riferimenti
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease ....
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Ristampe e permessi
