Articolo metodologico

Trascrittoma Profiling di In-Vivo Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

DOI:

10.3791/53754

⸱

30 gennaio 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry, 3Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Université Laval

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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La tecnologia Microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei trascritti su base genomica. Pertanto, questo protocollo fornisce una procedura tecnica ottimizzata in un array bovino a due colori su misura utilizzando embrioni bovini del giorno 7 per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di una bassa quantità di RNA totale.

Abstract

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La perdita embrionale precoce è un grande fattore che contribuisce all'infertilità nei bovini. Inoltre, il bovino diventa un modello interessante per studiare lo sviluppo dell'embrione preimpianto umano grazie al loro processo di sviluppo simile. Sebbene sia noto che i fattori genetici influenzano lo sviluppo embrionale precoce, la scoperta di tali fattori è stata una seria sfida. La tecnologia dei microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei livelli di trascrizione su base genomica. Una delle principali decisioni che devono essere prese quando si pianifica un esperimento di microarray è se utilizzare un approccio a uno o due colori. Il design a due colori aumenta la replicazione tecnica, riduce al minimo la variabilità, migliora la sensibilità e l'accuratezza, oltre a consentire di avere disegni di loop, definendo i campioni di riferimento comuni. Sebbene il microarray sia un potente strumento biologico, ci sono potenziali insidie che possono attenuarne la potenza. Pertanto, in questo documento tecnico dimostriamo un protocollo ottimizzato per l'estrazione, l'amplificazione, la marcatura, l'ibridazione dell'RNA amplificato marcato nell'array, la scansione dell'array e l'analisi dei dati utilizzando la strategia di analisi a due colori.

Introduzione

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All'inizio perdita embrionale nelle vacche ad alta produzione di latte è una delle principali sfide del settore lattiero-caseario 1, 2. Bovina è diventato un modello interessante per studiare lo sviluppo preimpianto dell'embrione umano a causa del loro processo di sviluppo simile a 3, 4. Tuttavia, più ricerca è necessaria per avere una migliore comprensione di geni coinvolti nello sviluppo embrionale precoce bovina.

Dopo venti anni dalla prima tecnologia microarray sviluppato nel 1995 5, lo sviluppo di più sofisticate tecnologie sonda fabbricazione errori di stampa ridotti e variabilità dei chip a matrice all'interno e tra le diverse piattaforme di microarray 6. La tecnologia microarray migliorata determinato un ampiamente l'applicazione di questa tecnologia nel campo della ricerca clinica 7 e, più recentemente, in embrione precoce qvalutazione ualità 8.

La grande quantità di materiale necessario per la tecnologia microarray è la ragione principale per cui la tecnologia microarray inizialmente non è riuscito a entrare in un certo numero di campi di ricerca come sviluppo embrionale precoce. Più di recente, i metodi di amplificazione di RNA sono stati migliorati per amplificare linearmente RNA fino al livello microgrammi da sub-nanogrammo materiale di partenza di RNA 9. Ci sono diversi kit RNA amplificazione commerciali disponibili sul mercato; tuttavia, il più popolare kit ben sviluppati sono legati alla Ribo-Single Primer isotermica di amplificazione 10 e T7 promotore guidato 11 metodi. Il più popolare di amplificazione RNA antisenso utilizza nella trascrizione vitro con un oligo dT fondo il collegamento a un promotore T7 a 5 '12. Questa tecnologia consente di mantenere più di trascritti rappresentativi anti-senso dopo amplificazione lineare fo array ibridazione 13. Questo metodo è stato adattato per amplificare il livello picogrammi di RNA totale estratto da embrioni bovini 8.

Universale Linkage System (ULS) è il metodo di etichettatura che incorpora direttamente il DNA o RNA amplificato con colorante fluorescente in platino-linked sia Cyanine 547 o 647 Cyanine, formando un legame coordinativo sulla posizione N7 della guanina 14. Questo metodo è stato adattato nella ricerca embrioni per generare più stabile amplificato ARNA senza modifiche rispetto al aminoallyl modificati su ARNA generata dal metodo enzimatico 15. metodi sia singolo colorante ed etichettatura due coloranti sono stati adattati utilizzando universale Linkage System nella microarray. Un ampio studio confronti microarray è che vi è una buona correlazione della qualità dei dati tra le piattaforme di array uno o due colori 6.

Recentemente, sia in auto promotore T7Metodi n amplificazione RNA antisenso ed etichettatura ULS sono stati sviluppati per fornire un protocollo più affidabile per generare una quantità sufficiente di alta qualità etichettati materiali ARNA per microarray ibridazione 8, 16. Pertanto, questo studio fornisce un protocollo per dimostrare alcune importanti passi da estrazione di RNA per l'analisi dei dati coinvolti in microarray due colori usando Giorno 7 embrioni bovini come esempio.

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Protocollo

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La parte animale di questo studio è stato condotto presso l'Unità di Ricerca metabolica della University of Alberta, Edmonton, Canada, con tutte le procedure sperimentali su animali approvato (protocollo # AUP00000131) per l'Università di Alberta cura degli animali e del Comitato uso, e gli animali curati secondo al Consiglio canadese delle linee guida per la cura degli animali (1993).

1. di produzione di embrioni, Isolamento di RNA totale e trattamento DNasi

  1. Per i protocolli sperimentali animali e di raccolta degli embrioni riferimento nelle nostre precedenti pubblicazioni 17, 18.
  2. Piscina e scatto congelare simili embrioni palco da ogni mucca in azoto liquido e poi continuare a -80 ° C fino a quando l'estrazione di RNA.
  3. Estrarre RNA totale tramite un kit di estrazione di RNA colonna-based che consente di estrarre l'RNA da campioni pico-scala (informazioni kit è disponibile in Lista dei Materiali).
    NOTA: consigliato kit contiene: condizionata Buffer, estrazione Buffer, il 70% di etanolo, il tampone di lavaggio 1, il tampone di lavaggio 2, tampone di eluizione, colonne di purificazione RNA con tubi di raccolta e tubi microcentrifuga.
  4. Aggiungere 10 ml Extraction Buffer al tubo contenente gli embrioni e incubare per 30 minuti a 42 ° C. provetta da centrifuga a 800 xg per 2 minuti per raccogliere estratto cellulare nella provetta.
  5. Pipettare 250 microlitri condizionata tampone sulla membrana del filtro colonna di purificazione. Incubare la colonna di purificazione dell'RNA con condizionata tampone per 5 min a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna di purificazione nel tubo di raccolta in 16.000 xg per 1 min.
  6. Pipettare 10 ml di etanolo al 70% nella miscela di RNA Extraction Buffer ed embrioni. Mescolare bene pipettando su e giù. miscela Pipettare nella colonna di purificazione precondizionato.
  7. Per legare RNA, centrifugare la colonna di purificazione per 2 min a 100 xg e seguire immediatamente da una centrifugazione a 16.000 xg per 30 s per rimuovere flusso attraverso.
  8. Dispensare 10081; L di tampone di lavaggio 1 nella colonna di purificazione e centrifugare per 1 min a 8000 x g.
    NOTA: DNase trattamento è consigliato se si esegue la trascrizione inversa o di amplificazione dopo l'isolamento di RNA.
  9. Digest DNA genomico dopo passo 1.8.
    NOTA: consigliato kit DNasi è disponibile in Lista dei Materiali. Kit consigliato contiene: soluzione di riserva DNasi I e Buffer.
  10. Preparare miscela di incubazione DNase mescolando 5 soluzione madre microlitri DNasi I con 35 microlitri di buffer. Mescolare capovolgendo delicatamente.
  11. Pipettare il microlitri DNasi miscela 40 di incubazione direttamente nella membrana colonna di purificazione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  12. Pipettare 40 microlitri tampone di lavaggio 1 nella membrana colonna di purificazione e quindi si centrifuga a 8000 xg per 15 s.
  13. Pipettare 100 microlitri tampone di lavaggio 2 nella colonna di purificazione e centrifugare per 1 min a 8000 x g.
  14. Pipetta altri 100 microlitri tampone di lavaggio 2 nella colonna di purificazione e centrifugareper 2 minuti a 16.000 x g.
  15. Trasferire la colonna di purificazione di un nuovo 0.5 mL provetta. Pipettare 11 ml di tampone di eluizione direttamente sulla membrana della colonna di purificazione. Per garantire il massimo assorbimento di Elution Buffer nella membrana, toccare delicatamente la punta della pipetta alla superficie della membrana, mentre l'erogazione del tampone di eluizione.
  16. Incubare la colonna per 1 min a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna per 1 min a 1000 xg per distribuire Elution Buffer nella colonna, e poi girare per 1 min a 16.000 xg per eluire RNA.
  17. Utilizzare strumento bioanalizzatore secondo le istruzioni del produttore per valutare la qualità e la quantità di RNA 19.
  18. Conservare il campione di RNA a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. RNA di amplificazione e di etichettatura per l'analisi di microarray

NOTA: Per l'utente prima volta a lavorare con le procedure di amplificazione di RNA e di etichettatura, utilizzare cinque ng di spike-in RNA along con i campioni reali ARNA per monitorare la misura di controllo della qualità dell'amplificazione RNA e ibridazione. Il picco-in mix RNA contiene dieci in vitro di sintesi, trascrizioni poliadenilato in rapporti prestabiliti. Quando la procedura eseguita correttamente, le trascrizioni etichettati specificamente ibridano solo per sonde di controllo complementari matrici ei dati possono essere acquisiti per monitorare la garanzia di controllo della qualità con sé il minimo o cross-ibridazione. Maggiori dettagli descrizione per quanto riguarda la procedura di spillo-in intensità di controllo e di normalizzazione dopo la scansione l'array e analisi dei dati è fare riferimento a precedenti pubblicazioni 20, 21. La procedura seguente viene data agli utenti di microarray di routine.

  1. Preparare alta qualità (valore numerico RNA Integrity (RIN) almeno> 7.0) 100 pg campione di RNA in un volume totale di 10 - 11 microlitri.
  2. Amplificare i campioni di RNA con un kit di amplificazione in grado dilavorare con i campioni pico-scala (non più di 100 pg).
    NOTA: Consigliato informazioni kit di amplificazione è disponibile in Lista dei Materiali e segue le istruzioni del produttore, senza alcuna modifica.
  3. Utilizzare una quantificazione basato sulla fluorescenza per valutare il profilo della gamma di dimensioni del ARNA amplificato.
  4. Utilizzare lo strumento spettrofotometro (basato sul assorbanza a 260 e 280 nm) per misurare la concentrazione della ARNA amplificato.
  5. Conservare il ARNA amplificato a -80 ° C fino al momento per l'etichettatura.
  6. Utilizzare 2 mg di RNA amplificato per l'etichettatura fluorescente secondo le ULS ARNA manuale d'uso Kit di etichettatura.
    NOTA: Poiché Cyanine 547 e 647 Cyanine colorante sono sensibili a foto-degradazione e Cyanine 647 colorante è facilmente degradato dall'ozono, la procedura di etichettatura avviene in una quantità minima di luce e sotto un ambiente privo di ozono.
  7. Attiva la casella di ozono (Figura 1A) finché il livello di ozono è 0,001 ppm.
  8. eseguire la configurazione reazione all'interno della scatola di ozono (Figura 1B) con l'aggiunta di 2 ml di Cyanine 547 o Cyanine 647, 2 ml di tampone di etichettatura, e quindi regolare ad un volume finale di 20 ml con acqua RNase-free sotto la luce di sicurezza. Aggiungi filtro camera oscura alla sorgente luminosa.
  9. Miscelare delicatamente e incubare le provette in un termociclatore a 85 ° C per 15 min. I campioni in ghiaccio per almeno 1 min. Spin down per raccogliere il contenuto dei tubi prima di procedere con il kit di estrazione di RNA, salvo passaggi relativi al trattamento DNasi (1,9-1,11), per ripulire l'RNA amplificato Cy-dye-etichettati.
  10. Utilizzare lo strumento spettrofotometro per misurare e determinare la concentrazione di RNA amplificato marcato e mantenere il ARNA etichettati a -80 ° C al massimo per 3 giorni prima dell'uso.

3. microarray ibridazione e di lavaggio

NOTA: Le seguenti passi importanti sono adattate in base a due colori per microarray a base di analisi di espressione genica Protocol (versione6.5, maggio 2010).

  1. Aggiungere la stessa quantità di 825 ng da ciascuna Cyanine 547- e 647 Cyanine marcati ARNA e mescolare con 25x e 10x frammentazione buffer di blocco.
  2. Riscaldare il miscuglio a 60 ° C per 15 minuti e raffreddare in ghiaccio per 1 min.
  3. Aggiungere la stessa quantità di tampone di ibridazione 2x e mescolare bene.
  4. Centrifugare a 13.000 rpm, quindi la miscela è pronta per l'ibridazione.
  5. Carica 100 microlitri dalla miscela sul vetrino matrice e sigillare la slitta all'interno della camera di ibridazione.
  6. Caricare la camera montata nel forno di ibridazione per 17 ore a 65 ° C rotante a 10 rpm in forno.
  7. Lavare le matrici secondo protocollo con trattamento protettivo di ozono mediante immersione in stabilizzazione ed essiccazione soluzione per 30 s.
  8. Rimuovere le matrici dalla soluzione e assicurarsi che la superficie array è asciutta, senza particelle di polvere

4. La scansione microarray diapositive

  1. Mantenere gli array in luogo buio e accendere scanner finché è pronto per l'uso (15 min tempo di attesa).
  2. Caricare il codice a barre serie a sinistra, nello scanner e avviare la scansione. Fare l'analisi loco secondo il manuale d'uso del software e salvare i dati come (GPR) formato di file.

5. Analisi statistica

  1. Scaricare il software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Clicca su "dati grezzi di importazione" e caricare i file GPR in FlexArray.
  2. Eseguire la normalizzazione e l'analisi statistica, se necessario, seguendo le istruzioni. Nota: Calcolare la soglia per la selezione positiva posto in questo studio come è stato descritto in precedenza 22.
  3. Selezionare il menu a tendina dal visualizzatore trama del FlexArray per visualizzare tutti i punti ibridate e segnali di fondo. Nota: Un quadro analogo di spillo nei controlli dopo l'ibridazione di microarray può essere visto in precedente studio 8.
  4. Seleziona unnormalizzazione Loess all'interno dell'array seguito da un quantile tra processo di normalizzazione array dal FlexArray discesa manuale di conseguenza.
  5. Esportare tutti i dati normalizzati da FlexArray in un file Excel per un ulteriore utilizzo.

6. Analisi Bioinformatica

L'annotazione originale delle sequenze di scansione da trascrizioni specifici embrione bovino (BESTv1) microarray è stato descritto in precedenza 8. Nel presente studio, 20,403 Simboli Gene unici (GS) sono stati ottenuti ( Supplemento File1 ) attraverso il EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Un elenco di 6.765 geni unici ( Supplemento File2 ) è stato selezionato e corrispondeva ai segnali tutti positivi dopo il processo di normalizzazione microarray (punto 5.5) Bovine 7 ° giorno gene embrioni profilo di espressione. Soglia di segnale positivo è stato calcolato sulla base di pubblicazione pervio 16 dalla intensità di un valore di un segnale.

  1. Per eseguire l'analisi funzionale con PANTHER (Protein analisi tramite evolutivi Relationships) Sistema di Classificazione 23, 24, aprire il seguente link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
  2. Carica un elenco di 6.765 GS-specific di embrioni per identificare specifici processi biologici durante lo sviluppo embrionale utilizzando il test sovrarappresentazione statistiche e di utilizzare l'impostazione predefinita di Bos taurus (tutti i geni nel database) come elenco di riferimento 25.
    NOTA: Questo permette l'identificazione dei processi di sviluppo legati dai termini GO che sono statisticamente sovra o sotto-espressi utilizzando un test binomiale.
  3. Set soglia P-value <0.05 di default del software. I dati possono essere scaricati e expoari in file di Excel per ulteriore selezione 16.

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Risultati

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Un risultato rappresentativo di RNA totale e amplificato aRNA dal Giorno 7 embrioni di bovini è mostrato in figura 3 e riassunti nella Tabella 1.

integrità dell'RNA e profilo possono essere valutate dopo l'estrazione di RNA. Valutazione della qualità di RNA potrebbe essere fatto per strumento Bioanalyzer (figura 3A) e solo i campioni con un valore superiore a 7,0 RIN sono qual...

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Discussione

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Il primo problema di effettuare analisi di microarray usando Giorno 7 embrioni di bovini non è sempre una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per lo studio dell'espressione genica. estrazione di RNA fenolo Tradizionale / cloroformio e metodo di precipitazione in etanolo non è raccomandato per Giorno 7 embrioni, con conseguente bassa resa e la possibile fenolo avanzi di inibire la reazione di amplificazione di RNA. Invece, un metodo basato su colonne standard è preferibile isolare l'RNA totale e quindi el...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ricerca supportata da Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, e Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di isolamento dell'RNA PicoPureApplied BiosystemsKIT0204
Set di DNasi senza RNasi (50)Qiagen79254
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Kit Arcturus RiboAmp HS PLUSApplied BiosystemsKIT0505
2100 Strumenti per bioanalizzatoriAgilent TechnologiesG2940CA
Nastro per schermo a RNAAgilent Technologies5067-5576
Kit di etichettatura fluorescente ULSKreatech DiagnosticsEA-021
Microarray di espressione genica personalizzatiAgilent TechnologiesG2514F
Tampone di lavaggio per l'espressione genica AgilentAgilent TechnologiesPart #5188-5325
Tampone di lavaggio per espressione genica Agilent 2Agilent TechnologiesParte #5188-5326
2x Hi-RPM Hybridization BufferAgilent Technologies  Parte #5190-0403
25x Fragment BufferAgilent TechnologiesPart #5185-5974
10x GE Blocking AgentAgilent TechnologiesPart #5188-5281
Soluzione di stabilizzazione ed essiccazioneAgilent Technologies  Parte #5185-5979
Vetrini per guarnizioni abilitati dalla tecnologia Agilent SureHybAgilent TechnologiesG2524-60012Confezione da 20 vetrini per guarnizione, 4 microarray/vetrino
Kit Spike-In RNA a due coloriAgilent Technologies  Cat# 5188-5279
Scanner array GenePix 4000BDispositivi molecolariGENEPIX 4000B-U
Scatola senza ozonoBioTrayOFB_100x200
file GALAgilent Technologies-
1

Riferimenti

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Embbrioni boviniEstrazione di RNAProfilazione dell espressione genicaKit di amplificazioneMarcatura fluorescenteIbridazione su arrayNormalizzazione dei datiAnalisi statisticaPerdita embrionaria

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