La tecnologia Microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei trascritti su base genomica. Pertanto, questo protocollo fornisce una procedura tecnica ottimizzata in un array bovino a due colori su misura utilizzando embrioni bovini del giorno 7 per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di una bassa quantità di RNA totale.
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Articolo metodologico
Trascrittoma Profiling di In-Vivo Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La perdita embrionale precoce è un grande fattore che contribuisce all'infertilità nei bovini. Inoltre, il bovino diventa un modello interessante per studiare lo sviluppo dell'embrione preimpianto umano grazie al loro processo di sviluppo simile. Sebbene sia noto che i fattori genetici influenzano lo sviluppo embrionale precoce, la scoperta di tali fattori è stata una seria sfida. La tecnologia dei microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei livelli di trascrizione su base genomica. Una delle principali decisioni che devono essere prese quando si pianifica un esperimento di microarray è se utilizzare un approccio a uno o due colori. Il design a due colori aumenta la replicazione tecnica, riduce al minimo la variabilità, migliora la sensibilità e l'accuratezza, oltre a consentire di avere disegni di loop, definendo i campioni di riferimento comuni. Sebbene il microarray sia un potente strumento biologico, ci sono potenziali insidie che possono attenuarne la potenza. Pertanto, in questo documento tecnico dimostriamo un protocollo ottimizzato per l'estrazione, l'amplificazione, la marcatura, l'ibridazione dell'RNA amplificato marcato nell'array, la scansione dell'array e l'analisi dei dati utilizzando la strategia di analisi a due colori.
Introduzione
All'inizio perdita embrionale nelle vacche ad alta produzione di latte è una delle principali sfide del settore lattiero-caseario 1, 2. Bovina è diventato un modello interessante per studiare lo sviluppo preimpianto dell'embrione umano a causa del loro processo di sviluppo simile a 3, 4. Tuttavia, più ricerca è necessaria per avere una migliore comprensione di geni coinvolti nello sviluppo embrionale precoce bovina.
Dopo venti anni dalla prima tecnologia microarray sviluppato nel 1995 5, lo ....
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Protocollo
La parte animale di questo studio è stato condotto presso l'Unità di Ricerca metabolica della University of Alberta, Edmonton, Canada, con tutte le procedure sperimentali su animali approvato (protocollo # AUP00000131) per l'Università di Alberta cura degli animali e del Comitato uso, e gli animali curati secondo al Consiglio canadese delle linee guida per la cura degli animali (1993).
1. di produzione di embrioni, Isolamento di RNA totale e trattamento DNasi
- Per i protocolli sperimentali animali e di raccolta degli embrioni riferimento nelle nostre precedenti pubblicazioni 17, 18. ....
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Risultati
Un risultato rappresentativo di RNA totale e amplificato aRNA dal Giorno 7 embrioni di bovini è mostrato in figura 3 e riassunti nella Tabella 1.
integrità dell'RNA e profilo possono essere valutate dopo l'estrazione di RNA. Valutazione della qualità di RNA potrebbe essere fatto per strumento Bioanalyzer (figura 3A) e solo i campioni con un valore superiore a 7,0 RIN sono qual.......
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Discussione
Il primo problema di effettuare analisi di microarray usando Giorno 7 embrioni di bovini non è sempre una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per lo studio dell'espressione genica. estrazione di RNA fenolo Tradizionale / cloroformio e metodo di precipitazione in etanolo non è raccomandato per Giorno 7 embrioni, con conseguente bassa resa e la possibile fenolo avanzi di inibire la reazione di amplificazione di RNA. Invece, un metodo basato su colonne standard è preferibile isolare l'RNA totale e quindi el.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ricerca supportata da Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, e Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di isolamento dell'RNA PicoPure | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| Set di DNasi senza RNasi (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Kit Arcturus RiboAmp HS PLUS | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Strumenti per bioanalizzatori | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Nastro per schermo a RNA | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| Kit di etichettatura fluorescente ULS | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Microarray di espressione genica personalizzati | Agilent Technologies | G2514F | |
| Tampone di lavaggio per l'espressione genica Agilent | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Tampone di lavaggio per espressione genica Agilent 2 | Agilent Technologies | Parte #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization Buffer | Agilent Technologies | Parte #5190-0403 | |
| 25x Fragment Buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Soluzione di stabilizzazione ed essiccazione | Agilent Technologies | Parte #5185-5979 | |
| Vetrini per guarnizioni abilitati dalla tecnologia Agilent SureHyb | Agilent Technologies | G2524-60012 | Confezione da 20 vetrini per guarnizione, 4 microarray/vetrino |
| Kit Spike-In RNA a due colori | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| Scanner array GenePix 4000B | Dispositivi molecolari | GENEPIX 4000B-U | |
| Scatola senza ozono | BioTray | OFB_100x200 | |
| file GAL | Agilent Technologies | - |
Riferimenti
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006). ....
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Ristampe e permessi
