Questo manoscritto riporta un protocollo dettagliato per l'allevamento, su base regolare, di una popolazione di Drosophila melanogaster utilizzando una gabbia per la popolazione di mosche.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Grandi quantità di DNA, RNA, proteine e altri componenti cellulari sono spesso necessarie per esperimenti di biochimica e biologia molecolare. Il breve ciclo di vita della Drosophila consente di raccogliere grandi quantità di materiale da embrioni, larve, pupe e mosche adulte, in modo sincronizzato, ad un basso costo economico. Una delle principali strategie per la propagazione di un gran numero di mosche è l'uso di una gabbia per la popolazione di mosche. Questo strumento utile e comune nella comunità di Drososphila è un modo efficiente per produrre regolarmente da milligrammi a decine di grammi di embrioni, a seconda dell'uniformità dello stadio di sviluppo desiderato. Mentre l'installazione di una gabbia per la popolazione può richiedere molto tempo, la manutenzione di una gabbia per mesi richiede molto meno tempo e consente una rapida raccolta di materiale biologico in un breve periodo. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e flessibile per il mantenimento di una gabbia di popolazione di Drosophila melanogaster, a partire da 1,5 g di materiale raccolto dal ciclo precedente.
Introduzione
La capacità di combinare approcci genetici e biochimici ha fatto Drosophila un organismo particolarmente adatto per biochimica e biologia molecolare studi 1-3. Questi studi spesso richiedono grandi quantità di materiale biologico, non solo da mosche adulte, ma anche da larve 4, pupe 5 e gli embrioni 6-8. Per ottenere grandi quantità di materiale, i ricercatori hanno mosche coltivate utilizzando grandi contenitori noti come volare "gabbie di popolazione". Queste gabbie sono costituiti da un cilindro di plastica coperta da una rete su entrambi i lati per consentire l'introduzione del cibo all'interno della gabbia senza le mosche fuga. Queste gabbie possono essere fatti in casa 9-11 o acquistati da una società (vedi tabella di materiali specifici / apparecchiature).
Un importante vantaggio di utilizzare questo sistema per coltivare un gran numero di mosche è che il ciclo della mosca della frutta 12 può essere controllato in modo che tutte le mosche sviluppano in un relatively sincronizzato maniera. Questa sincronizzazione si ottiene semina nuovi embrioni, alimentando larve / mosche e sacrificare le mosche adulte, a volte precisi. Utilizzando una popolazione mosca sincronizzato è particolarmente utile per studi di sviluppo 13.
L'inizio di una nuova gabbia popolazione da pochi mosche è un processo che richiede tempo molti cicli di amplificazione 9-11. Anche utilizzando contenitori più grandi, come le bottiglie di coltura mosca o minicages, l'intero processo può durare per mesi. Per evitare questo passaggio che richiede tempo, molti laboratori di Drosophila mantengono regolarmente tali gabbie. È più conveniente per iniziare una nuova gabbia a partire da una raccolta di embrioni da una gabbia popolazione già stabilito. In generale, la maggior parte dei laboratori mantengono gabbie popolazione di tipo selvatico, come Oregon R o Canton S. Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per mantenere la mosca gabbie di popolazione.
Protocollo
1. Iniziare il ciclo: seminare gli embrioni
NOTA: Il ciclo inizia con 1,5 g di materiale raccolto (una miscela composta da embrioni e/o alcune larve di primo stadio) dal ciclo precedente. Questo materiale verrà posto in un contenitore di plastica (vedi tabella dei materiali/attrezzature specifiche) con una miscela di lievito attivo fino alla fase pupale. Il contenitore verrà chiuso dopo l'introduzione della miscela biologica di embrioni e larve con il coperchio per evitare la fuoriuscita delle larve. È necessario praticare dei fori nel coperchio per consentire la circolazione dell'aria. Per evitare che le larve fuoriescano dai fori, vengono utilizzati tappi di schiuma. Infine, Si consiglia di indossare guanti e camice da laboratorio, non solo in questa sezione ma anche nell'intero protocollo, per evitare di sporcarsi o macchiare i vestiti con la candeggina.
- Prepara il contenitore di plastica.
- Fai tre fori quadrati con una lama di rasoio nel coperchio del contenitore di plastica di circa 2,2 cm. Aggiungi del nastro adesivo (nastro adesivo da 3/4 di pollice) ai quattro angoli di ciascun foro per garantire una perfetta aderenza dei tappi di schiuma (50 x 55 mm, p x l), quindi posiziona un tappo di schiuma in ciascun foro.
- Coprire l'interno del contenitore di plastica con pellicola trasparente. Sopra questa pellicola, aggiungere uno strato di cotone per coprire il fondo del contenitore di plastica. Strappa il cotone con le dita.
- Prepara il cibo per mosche.
- Aggiungere 333 ml di acqua deionizzata in un becher da 500 ml. Agitando il becher con una barra magnetica, aggiungere 167 μl di acido propionico e 1,08 ml di acido fosforico, dalle soluzioni madre (99,96% e 85%, rispettivamente).
- Aggiungere lentamente 77,5 g di lievito secco attivo, evitando grossi grumi. Dopo aver sciolto il lievito secco, aggiungere 38,8 g di saccarosio.
NOTA: Il saccarosio dovrebbe essere l'ultimo ingrediente da aggiungere perché subito dopo aver aggiunto questo componente inizierà la fermentazione.
- Subito dopo aver sciolto il saccarosio, versare il cibo sul cotone e assicurarsi di coprire il cotone in modo uniforme. Chiudere il contenitore di plastica con il coperchio per evitare che le mosche fuoriuscite all'interno del laboratorio contaminino il cibo.
- Risospendere 1,5 g degli embrioni raccolti (non dechorionati) del ciclo precedente con 5 ml di etanolo al 70%. Tagliare a metà due carte da filtro e distribuire uniformemente la miscela biologica sui 4 pezzi utilizzando una spatola o una pipetta di trasferimento con punta larga (tagliare se necessario). Appoggiare la carta da filtro sopra il cotone imbevuto e chiudere il coperchio. Infine, incubare il contenitore di plastica a RT (24ºC) e umidità (35%) fino allo stadio di pupa.
NOTA: Il contenitore di plastica non deve essere collocato in una camera umida, altrimenti ciò incoraggerà la crescita di batteri.
2. Continuazione del ciclo: dagli embrioni alle mosche.
NOTA: Questa parte del ciclo va dagli embrioni posti nel contenitore di plastica il giorno 1 fino a 9 giorni dopo, quando le mosche adulte emergeranno dalle pupe. Durante questi 8 giorni non c'è nulla da fare se non monitorare che gli embrioni progrediscano correttamente verso le fasi successive del ciclo di vita della Drosophila fino all'eclocazione. Se le larve iniziano a morire e a diventare nere durante questo periodo, controllare che i tappi di schiuma non siano troppo stretti e che sia fornita un'adeguata ventilazione. Questo periodo è un buon momento per pulire la gabbia della popolazione di mosche del ciclo precedente.
- Osserva gli embrioni diventare larve di primo stadio circa 24 ore dopo che la femmina adulta li ha depositati nel cibo per mosche (vedi passaggio 3). Le larve risultanti si nutriranno dal cibo per mosche preparato nella fase 1 per 4 giorni, crescendo e mutando due volte in larve di 2° e 3° stadio.
- Pulisci la gabbia della popolazione di mosche.
- Posizionare la gabbia a 4 ºC per almeno 30 minuti per rallentare l'attività delle mosche. Rimuovi la rete che copre un lato della gabbia e, con un movimento veloce, chiudi il lato aperto con un grande sacchetto di plastica a rischio biologico. Versare il contenuto della gabbia nel sacchetto.
- Con il sacco per il rischio biologico che copre ancora un lato della gabbia, posiziona la gabbia verticalmente sopra un lavandino con il sacco per il rischio biologico rivolto verso il basso. Rimuovere con cautela il sacchetto di plastica per evitare la fuoriuscita delle mosche e gettarlo in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
- Apri con cura la rete superiore quanto basta per creare un piccolo foro, sciacqua l'interno della gabbia con acqua, che laverà le mosche nel lavandino. Aumentare lentamente le dimensioni del foro ed eliminare tutte le mosche all'interno della gabbia.
- Pulisci la gabbia ed entrambe le reti con acqua e sapone. Mentre le reti sono ancora bagnate, fissatele su entrambi i lati della gabbia asciutta e pulita, e infine mettetele all'interno di una carta da laboratorio, che eviterà che la pellicola di plastica preparata al punto 1.1.2 si attacchi alla gabbia. Ora la gabbia è pronta per il ciclo successivo.
- Quattro giorni dopo l'impostazione iniziale, osserva le larve impuparsi. Le larve rimarranno in questa fase per altri 4 giorni.
NOTA: Durante questa fase le pupe copriranno tutta la superficie di cotone all'interno del contenitore di plastica. - Durante la fase pupale e prima che emergano le prime mosche, aprire il contenitore di plastica e posizionare la pellicola di plastica contenente il cotone con tutte le pupe sopra la carta da laboratorio all'interno della gabbia di popolazione pulita. Chiudere la rete con un doppio nodo e pulire il contenitore di plastica e il coperchio per il ciclo successivo.
NOTA: Le pupe attaccate al coperchio devono essere scartate e distrutte in autoclave o congelate prima dell'eclosione.
3. Mosche adulte.
NOTA: Dopo i 4 giorni dello stadio di pupa le prime mosche emergeranno dalle pupe. Entro 24 - 48 ore tutte le mosche dovrebbero essersi chiuse. In questa parte del ciclo, è importante fornire loro cibo con l'obiettivo di creare l'ambiente giusto per la riproduzione.
- Preparare i vassoi di melassa.
- Unire in un pallone da 1 litro 556,25 ml di H2O deionizzato, 90 ml di melassa e 22 g di agar. Sterilizzare in autoclave con ancoretta per 30 min, raffreddare e aggiungere 9,25 ml di Tegosept al 10% in EtOH al 95%.
- Versare il composto in una teglia per carne di 21 x 14,5 cm. Assicurarsi che il volume sia sufficiente per coprire 15 - 17 teglie. Attendere 10 - 20 minuti per solidificare e coprire ogni teglia con una pellicola di plastica per evitare che si secchi. È possibile preparare contemporaneamente più fiasche da 1 L. Conservare i vassoi di melassa a 4 ºC avvolti nella plastica fino al momento del bisogno.
- Aggiungere una vaschetta di melassa ricoperta di lievito umido all'interno della gabbia con le mosche adulte.
- Prima di aggiungere la piastra, posizionare la gabbia a 4 ºC nella cella frigorifera per 30 min.
- Aggiungere 200 ml di H2O deionizzato in un becher e versare lentamente il lievito secco mescolando con un cucchiaio. Smetti di aggiungere lievito secco quando la miscela diventa approssimativamente della consistenza del burro di arachidi per evitare che le mosche rimangano incastrate nel cibo.
NOTA: È importante non lasciare solidificare la soluzione alimentare, altrimenti sarà molto difficile coprire la vaschetta della melassa ed estrarre le uova durante il processo di raccolta (vedere paragrafo 4.3). - Togliete la pellicola da una vaschetta per melassa e copritela con uno strato di lievito umido fresco preparato usando un cucchiaio o una spatola. Assicurarsi che l'intera superficie sia coperta.
- Mentre la gabbia è ancora nella cella frigorifera, apri la rete e aggiungi con cura la vaschetta della melassa con il lievito umido nella gabbia. Chiudere la rete e posizionare la gabbia a RT.
NOTA: Può essere utile coprire la piastra con una vaschetta per carne vuota durante l'inserimento, ma fare attenzione a non ostruire l'accesso delle mosche alla vaschetta per melassa.
- Cambiare il piatto ogni 24 - 48 ore per evitare che il lievito si asciughi troppo. Le mosche adulte sono molto sensibili all'essiccazione.
4. Fine del ciclo: Raccolta degli embrioni
NOTA: La migliore fertilità della mosca è di 3 - 5 giorni dopo l'eclosione. Pertanto, il prelievo durante questo periodo otterrà la migliore resa embrionale. Una volta completate le raccolte desiderate, il ciclo è terminato. Le mosche devono essere sacrificate e la gabbia pulita come specificato nel passaggio 2.2.
- Tipicamente, 2 giorni dopo l'eclosione della mosca, introdurre nella gabbia una nuova vaschetta di melassa con cibo umido fresco, come spiegato nel paragrafo 3.2.5. Per aumentare la resa di deposizione delle uova, con l'aiuto delle dita, rendere la superficie del lievito umido il più irregolare possibile. Se nella gabbia è presente un vecchio vassoio per alimenti, prima di aggiungere il nuovo piatto, rimuoverlo con cura e gettarlo in un sacchetto a rischio biologico. Un altro consiglio per aumentare la resa è quello di rimuovere lo strato di cotone in modo che tutte le uova vengano deposte nel cibo. Mantenere la gabbia a RT.
- Osserva gli embrioni come piccoli punti bianchi.
NOTA: Le uova sono pronte per essere raccolte. Per la manutenzione ordinaria della gabbia per mosche, il ritiro consigliato è di 2 giorni. Questa collezione conterrà principalmente embrioni e poche larve di 1° stadio. Visualizza i risultati rappresentativi per le rese tipiche degli embrioni raccolti per vari punti temporali di raccolta. - Raccogli gli embrioni
- Posizionare la gabbia nella cella frigorifera per circa 30 minuti. Nel frattempo preparare il contenitore di plastica e il cibo per mosche per il ciclo successivo come spiegato nella sezione 1.
- In una vaschetta per autoclave da 8 L aggiungere acqua a 1/4 della capacità totale e quindi aggiungere 1 ml di Triton X-100 al 10%. Mentre la gabbia è nella cella frigorifera, rimuovere con cura la piastra di melassa e metterla all'interno di un sacchetto a rischio biologico.
- Estrarre la vaschetta dal sacchetto e immergerla rapidamente (per evitare la fuoriuscita di mosche) nella soluzione detergente nella vaschetta dell'autoclave. Chiudere il sacchetto per il rischio biologico e metterlo in un contenitore per il rischio biologico. Le mosche non annegheranno in acqua che non contiene detersivo.
- Usa un pennello grande e una pistola ad acqua distillata per lavare via gli embrioni e il lievito dalla melassa. Gettare le piastre e la melassa nella scatola a rischio biologico.
- Versare accuratamente la soluzione attraverso un set di tre setacci (setaccio più grossolano 30 in alto, 40 al centro e 100 in basso). Lavare i grumi sul livello superiore con una pistola ad acqua distillata fino a quando non rimangono grumi.
NOTA: Le mosche adulte e le larve di 3° stadio saranno trattenute nel setaccio 30.- Sciacquare la vaschetta dell'autoclave con acqua distillata e versare l'acqua di risciacquo attraverso i setacci. Rimuovere il setaccio superiore e ripetere il processo se rimangono grumi di lievito. La maggior parte delle larve del 1° e del 2° stadio rimarranno nel setaccio 40.
- Rimuovere il secondo setaccio. Il materiale giallastro nel terzo setaccio (inferiore) è la miscela di embrioni e piccole larve di 1° stadio. Usa una pistola ad acqua distillata per spostare tutte le uova su un lato del setaccio. Raccoglietele con una spatola e pesatele.
- Durante questi cicli la resa di raccolta di embrioni/larve varia tra 7 e 13 g. Utilizzare solo 1,5 g di questo materiale per iniziare un nuovo ciclo (sezione 1). Utilizzare il resto degli embrioni per un'ulteriore lavorazione o possono essere scartati.
5. Ulteriore elaborazione
NOTA: Gli embrioni non utilizzati per la continuazione della popolazione possono essere utilizzati immediatamente per esperimenti o in alternativa possono essere congelati a -80 ºC. Per entrambe le opzioni, potrebbe essere necessario prima decorionare.
- Per la decoriazione, lavare gli embrioni per 2 minuti in una soluzione di candeggina al 50% e sciacquare abbondantemente con acqua distillata.
- Per congelare gli embrioni, prima asciugarli premendo con decisione con un tovagliolo di carta, quindi pesarli e metterli, con l'aiuto di una spatola, in un tubo conico da 15 o 50 ml. Infine immergere il tubo conico nel liquido N2 per alcuni secondi.
Risultati
Il mantenimento di una popolazione in un allevamento di moscerini si basa sul ciclo vitale della mosca. Pertanto, dopo aver posizionato la miscela biologica iniziale di embrioni e larve nel contenitore di plastica (Figura 1A), le uova fecondate diventeranno larve in non più di 2 giorni e le larve cresceranno per 4 giorni, progredendo in modo relativamente sincronizzato attraverso le diverse fasi larvali degli stadi di instar (vedi Figura 1B).
Dopo che le larve hanno completato lo stadio larvale del 3° stadio, si impupano e ricoprono la superficie del cotone all'interno del contenitore di plastica, con alcune anche sulla superficie interna del coperchio (Figura 1C). Questo periodo di impupamento durerà circa 4 giorni, fino al termine del processo di metamorfosi. Durante questo periodo si raccomanda vivamente di trasferire le mosche nella gabbia. Le prime mosche adulte inizieranno a schiudersi al giorno 9-10 dall'inizio del ciclo (Figura 1D) e entro il giorno 11 tutte si saranno schiuse dalle pupe.
Il rendimento migliore nella raccolta degli embrioni si ottiene da 3 a 5 giorni dopo l'eclosione (giorno 13-15) e alla fine diminuisce al giorno 17 (7 giorni dopo l'eclosione). Pertanto, si raccomanda di aggiungere l'ultimo vassoio di cibo fresco al giorno 13 e raccogliere le uova al giorno 15 (Figura 1E e F). Questo permetterà di raccogliere il numero massimo di embrioni. Aggiungere un ulteriore giorno prima della raccolta potrebbe far diventare il cibo troppo secco e di conseguenza ridurre il rendimento degli embrioni raccolti. Tabella 1 mostra il rendimento di 6 raccolte consecutive in ciclo, con un materiale iniziale di 1,5 g per ogni ciclo, e Figura 2 rappresenta il programma raccomandato per un'intera raccolta in ciclo.
Il materiale raccolto in periodi di 2 giorni è composto principalmente da embrioni. Tuttavia, è presente anche un piccolo numero di larve. Ai fini della manutenzione delle gabbie, queste larve non rappresentano un problema, poiché ci si aspetta un certo grado di asincronia. Tuttavia, per alcuni esperimenti di biochimica, la purezza di questi embrioni è molto importante, ma allo stesso tempo è necessario raccogliere grandi quantità di uova per eseguire tali esperimenti. Per questo motivo sono state effettuate diverse raccolte consecutive brevi di 1 ora e 3 ore, aggiungendo rapidamente a temperatura ambiente una nuova piastra con cibo, al fine di stimare la resa e la purezza ottenibili con questo metodo (Tabella 2 e Figura 3). Le raccolte consecutive di 1 ora hanno avuto inizio con una resa molto bassa (14,5 mg), ma successivamente le quantità di embrioni sono aumentate ad ogni raccolta, tranne nell'ultima. La bassa resa iniziale potrebbe essere dovuta allo stress delle mosche durante il cambio del cibo, seguito da un successivo adattamento. D'altro canto, nessuna larva è stata osservata nelle cinque raccolte sequenziali (Figura 3A), dimostrando che raccolte più brevi garantiscono una purezza maggiore. Se il cotone non viene rimosso dalla gabbia, aumenta la probabilità che larve provenienti da punti temporali precedenti rimangano e raggiungano la piastra fresca. Anche quando il cotone viene rimosso, talvolta le larve si spostano lungo i lati della gabbia ed entrano nel cibo durante una raccolta.
Per le raccolte consecutive di 3 ore, il rendimento è variato da 840 a 1250 mg, circa 10 volte superiore rispetto ai rendimenti ottenuti nelle raccolte di 1 ora. La purezza di questi embrioni era vicina al 100% (Figura 3B). Sono state osservate occasionalmente larve. Alcuni studi sullo sviluppo richiedono una sincronizzazione molto rigorosa degli embrioni raccolti. Per aumentare la purezza della sincronizzazione, si raccomanda di scartare la prima piastra di raccolta, poiché in condizioni non ottimali le femmine possono trattenere uova più mature e deporle quando le condizioni migliorano, ad esempio con l'introduzione di una piastra fresca. È inoltre importante sapere che moscerini adulti più anziani (>6 giorni) producono embrioni meno sincronizzati. Per verificare con alta precisione il grado di sincronizzazione, si raccomanda una colorazione con DAPI degli embrioni raccolti.
Figura 1. Il ciclo vitale di Drosophila melanogaster in una gabbia per popolazioni di moscerini. (A) Avvio del ciclo con la semina di 1,5 g di embrioni nel contenitore di plastica. A scopo di riferimento, nel pannello inferiore, la lunghezza della carta da filtro è di 8,5 cm. (B) Larve in crescita relativamente sincronizzate a 5 giorni dall'avvio del ciclo. (C) All'ottavo giorno, la maggior parte dei moscerini si trova nello stadio di pupa. I pannelli inferiori in B (B') e C (C') sono ingrandimenti delle aree indicate nei pannelli superiori. (D) Moscerini adulti emersi dalle pupe a 10 giorni dall'avvio del ciclo. (E) Moscerini adulti all'interno della gabbia per popolazioni prima dell'inizio della raccolta degli embrioni, al quindicesimo giorno. Il materiale giallastro sul cibo per moscerini corrisponde alle uova fecondate. (F) Embrioni (e alcuni pochi larvi) raccolti sul fondo del setaccio più grosso da 100, al termine di un intero ciclo della gabbia. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Piano di Raccolta per l'Intero Ciclo. La Figura 2 mostra il programma consigliato per una raccolta completa nel ciclo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Purezza delle raccolte consecutive di 1 ora e 3 ore. Immagine rappresentativa di embrioni raccolti a 1 ora (A) e 3 ore (B) dopo l'aggiunta di un nuovo vassoio di cibo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Numero del ciclo | Rendimento (g) |
| 1 | 10.3 |
| 2 | 9.5 |
| 3 | 10.3 |
| 4 | 12.7 |
| 5 | 10 |
| 6 | 7.1 |
Tabella 1. Rendimento di diverse raccolte cicliche. La Tabella 1 mostra il rendimento di 6 raccolte cicliche consecutive, con un materiale di partenza di 1,5 g. In ogni ciclo, l'ultimo vassoio di alimento è stato aggiunto al giorno 13 e la raccolta è stata effettuata al giorno 15.
| Numero di raccolta | Durata della raccolta (hr) | Resa (mg) |
| 1 | 1 | 14.5 |
| 2 | 1 | 21.6 |
| 3 | 1 | 56.1 |
| 4 | 1 | 160.1 |
| 5 | 1 | 106.1 |
| 1 | 3 | 960 |
| 2 | 3 | 840 |
| 3 | 3 | 1250 |
Tabella 2. Resa delle raccolte consecutive di 1 ora e 3 ore. La Tabella 2 mostra la resa di 5 raccolte consecutive effettuate 1 ora dopo l'aggiunta di nuovo cibo e di 3 raccolte consecutive effettuate 3 ore dopo aver posizionato una nuova piastra di melassa.
Discussione
Partendo da 1,5 g di materiale si può ottenere una resa di embrioni raccolti tra i 7 e i 13 g per ciclo. Per ottenere una tale quantità di materiale è fondamentale mantenere le giuste condizioni di coltura per tutte le fasi del ciclo della mosca.
I parametri più importanti sono la temperatura e l'umidità, che dovrebbero essere rispettivamente di 24 ºC e 35%. Se questi due parametri non possono essere mantenuti costanti nell'ambiente normale del laboratorio, una possibilità potrebbe essere quella di posizionare la gabbia per mosche in un'incubatrice o in una camera ambientale. Altri protocolli raccomandano un'umidità del 70% e anche un ciclo luce-buio costante di 24 ore per aumentare la resa delle uova prodotte9,10. Tuttavia, mantenere l'umidità intorno al 35% evita la contaminazione batterica e, poiché lo scopo di questo protocollo è solo il mantenimento di una gabbia di popolazione, le mosche vengono mantenute nel normale ambiente di luce del laboratorio.
Un altro punto importante è quello di mantenere il disturbo alle mosche adulte il più basso possibile. Potrebbe essere consigliabile tenere la gabbia in un luogo separato dalla sala mosche per evitare la contaminazione incrociata da altre mosche.
L'allevamento di grandi popolazioni di mosche transgeniche e mutanti non è raccomandato, poiché è molto difficile mantenere la loro purezza e possono mostrare un comportamento di accoppiamento anomalo pronunciato in gabbie di grandi popolazioni14.
Un possibile problema durante l'allevamento di Drosophila in grandi quantità è la presenza di altri organismi come acari e/o muffe, che competeranno per il cibo e quindi ridurranno la resa delle uova prodotte. Per evitare ciò, è molto importante mantenere pulite tutte le attrezzature, lavando la gabbia, le reti e le scatole antimosche con acqua e sapone e gettando il materiale monouso (tappi in schiuma) dopo ogni ciclo. Per ridurre la formazione di muffe, l'acido propionico e fosforico vengono aggiunti al lievito umido durante la preparazione del cibo per mosche nel passaggio 1.2 e Tegosept quando si prepara il vassoio per melassa nel passaggio 3.1. A volte è utile posizionare materiali come la scatola di plastica o i setacci a -20 °C quando il tempo è breve e i materiali non possono essere puliti immediatamente.
Un intero ciclo di raccolta avviene in 14-15 giorni, a partire dal momento in cui gli embrioni vengono seminati nella scatola delle mosche e termina con l'ultimo giorno di raccolta. Durante questo periodo di tempo, si consiglia di organizzare un programma in modo da ricordare tutti i passaggi necessari per il mantenimento di una gabbia per mosche di popolazione (Fig. 2), dettagliati nella sezione del protocollo. Dal giorno in cui le uova vengono seminate, fino a quando emergono le mosche adulte, è necessario solo ispezionare la scatola di plastica e, quando si verifica l'impupamento, posizionarle all'interno della gabbia. Dopodiché, le mosche devono essere nutrite ogni 2 - 3 giorni fino a quando gli embrioni non vengono seminati per un nuovo ciclo. In tutto il protocollo, il giorno più lungo è durante la raccolta e la semina degli embrioni per l'inizio di un nuovo ciclo. Come commentato nel protocollo, la migliore produzione di uova è 3-5 giorni dopo l'eclosione dell'adulto, e infine diminuisce 2 giorni dopo. Questo ci dà una certa flessibilità per scegliere il giorno in cui verrà eseguita la raccolta degli ovuli.
Se per qualsiasi motivo la resa degli embrioni raccolti è inferiore alla quantità iniziale desiderata (1,5 g), si può sempre aggiungere un nuovo vassoio di melassa e raccogliere più uova il giorno successivo. Per raccolte costanti, si consiglia di mantenere 2 gabbie in parallelo e, se sono necessarie quantità maggiori di embrioni, è anche possibile utilizzare gabbie più grandi. In caso di raccolte brevi, un modo per aumentare la resa è quello di sfruttare lo scoppio di deposizione delle uova al mattino.
Ci sono molti vantaggi nel raccogliere grandi quantità di varie fasi di sviluppo. Ad esempio, gli embrioni raccolti da gabbie di popolazione sono stati utilizzati con molto successo nei saggi di immunoprecipitazione 6-8, la raccolta di massa di tessuti larvali da larve dissociate ha dimostrato di essere un'ottima fonte per gli esperimenti 3C4 e i preparati di RNA15 e le teste dei moscerini adulti sono state utilizzate per gli esperimenti ChIP16. Inoltre, gli adulti sono spesso necessari per produrre estratti di mosche per la coltura dei tessuti17.
Una delle applicazioni più promettenti della gabbia è quella di fornire materiale per saggi ad alto rendimento che consentono l'analisi e lo screening di geni, trascritti, proteine e metaboliti in risposta all'esposizione di agenti patogeni, molecole biologiche, sostanze chimiche e radiazioni ionizzanti. In questi saggi su larga scala è richiesto un gran numero di individui, e la gabbia per la popolazione di mosche qui descritta può essere molto utile per ottenere grandi quantità di materiale durante le diverse fasi del ciclo di vita della Drosophila per la loro analisi e screening18.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Yixian Zheng (Carnegie Institution di Washington, Baltimora, MD) per il protocollo originale e l'assistenza nella configurazione iniziale e i membri del laboratorio Lei per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal Programma di Ricerca Intramurale dell'Istituto Nazionale del Diabete e delle Malattie Digestive e Renali.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity pratico rotolo di cotone | Kendall | 2287 | |
| Lievito secco | Affymetrix | 23540 | |
| Carta da filtro | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Tappi per tubi in schiuma | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diametro x 55 mm Lunghezza |
| Gabbia per mosche | Flystuff | 59-116 | 9″ Diametro x 14,4& Prime; Lunghezza. Include le reti per la gabbia. |
| Vassoio per carne | Genpak | 1002S (#2S) | 8,25 x 5,75 x 0,5 pollici |
| Melassa | Nonna&acuto; s | ||
| Contenitore in plastica | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Film plastico | Glad | ||
| Acido fosforico | Fisher Scientific | S 93326 | Tossico. Manico in Chimica Cappa |
| Acido Propionico | Fisher Scientific | A258-500 | Tossico. Manico in cappa chimica |
| Setaccio in acciaio inossidabile #100 | VWR | 57324-400 | |
| Setaccio in acciaio inossidabile #40 | VWR | 57324-272 | |
| Setaccio in acciaio inossidabile #30 | VWR | 57324-240 | |
| Saccarosio | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
