Transarteriosa somministrazione di oncolitici virus per locoregionale Terapia delle ortotopico HCC in Rats

Sommario

Le viroterapie oncolitiche sono in fase di sviluppo come nuove terapie per il trattamento del carcinoma epatocellulare (HCC). Qui descriviamo un metodo per la terapia locoregionale dell'HCC tramite somministrazione arteriosa epatica del virus oncolitico.

Abstract

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è una malattia con opzioni terapeutiche limitate e prognosi infausta. Negli ultimi anni, le viroterapie oncolitiche si sono dimostrate strumenti potenzialmente potenti per combattere i tumori maligni. Grazie all'esclusivo doppio apporto di sangue nel fegato, è possibile applicare le terapie localmente ai tumori ortotopici del fegato, che sono prevalentemente alimentati dal flusso sanguigno arterioso. Abbiamo precedentemente dimostrato che la somministrazione arteriosa epatica di virus oncolitici determina un'efficienza di trasduzione sicura ed efficiente delle lesioni multifocali dell'HCC, con conseguente significativo prolungamento della sopravvivenza nei ratti immunocompetenti. Questa procedura imita da vicino l'applicazione dell'embolizzazione transarteriosa nei pazienti, che è la cura palliativa standard fornita a molti pazienti con HCC. La capacità di somministrare terapie tumorali attraverso l'arteria epatica nei ratti consente un modello preclinico altamente sofisticato per la valutazione di nuovi vettori virali in fase di sviluppo. Qui descriviamo il protocollo dettagliato per la microdissezione dell'arteria epatica per l'infusione di vettori virali oncolitici per il trattamento dell'HCC ortotopico.

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il quinto tumore più diffuso in tutto il mondo, e la terza causa di morte per cancro, che lo rende un problema significativo di salute ^1,2. Per i pazienti che non sono ammissibili per la resezione del tumore, o di quelli in attesa di trapianto di fegato, terapia locoregionale coinvolgendo embolizzazione transarteriosa (TAE) o transarteriosa chemioembolizzazione (TACE) sono applicati come standard cure palliative ^3,4. Queste terapie sfruttano la caratteristica unica di doppia alimentazione di sangue nel fegato per cui i tumori sono alimentati quasi esclusivamente da epatica flusso di sangue arterioso, mentre il fegato circostante riceve la maggior parte del suo apporto di sangue dalla vena porta ^5,6.

A causa delle efficacies estremamente limitate di terapie stabilite per HCC, i virus oncolitici sono emersi come terapie alternative promettenti. JX-594, recentemente rinominato Pexa-Vec, è una timidina chinasi-cancellato vaccino vettore, armato di granulociti-macrophage fattore stimolante le colonie (GM-CSF), che ha completato la fase II della sperimentazione clinica per il carcinoma epatocellulare ^7. Più di recente, un vescicolare vettore ricombinante virus della stomatite (VSV) che esprime l'interferone-beta umano è entrato in una fase I di sperimentazione clinica per il carcinoma epatocellulare sorafenib-refrattario (NCT01628640). Come i virus oncolitici si avvicinano a ottenere l'approvazione per l'applicazione clinica per il carcinoma epatocellulare nei pazienti, la necessità di una efficace via di somministrazione di indirizzare la malattia multifocale è evidente. Mentre la consegna sistemica è in gran parte inefficace a causa di trasduzione del tumore inefficiente, applicazioni intratumorale potrebbe limitare l'efficacia della terapia per il tumore iniettato, lasciando lesioni microscopiche uninjectable sensibili alla progressione della malattia.

Abbiamo stabilito un metodo per isolare l'arteria epatica nei ratti di somministrare la terapia virus oncolitici in maniera locoregionale per indirizzare HCC ortotopico. Abbiamo dimostrato che questa rotta amministrazione si traduce in sicurezza e effective trasduzione del multifocali noduli di HCC, con conseguente significativo prolungamento della sopravvivenza in topi immuno competenti ^8-10. Qui, descriviamo il metodo di accesso, dissezione, e l'iniezione nell'arteria epatica nei ratti. Uno schema del procedimento è mostrato in Figura 1 (precedentemente pubblicato ⁹⁾

Protocollo

Nota: sono state eseguite le seguenti operazioni in conformità con le linee guida della nostra istituzione e il governo locale di Baviera, in Germania. Tutti i tentativi di riprodurre questo protocollo devono essere effettuati in aderenza con le linee guida locali per il trattamento umano degli animali, come dettato dalla cura degli animali locale e comitato uso. Ad esempio, molti istituti richiedono che guanti sterili sono indossati durante l'intervento roditore. Inoltre, il lavoro con i virus deve essere effettuata secondo le normative locali, facendo attenzione per la sicurezza personale ed ambientale. Si deve prestare attenzione al corretto smaltimento dei rifiuti contaminati e per pulire gli strumenti e spazio di lavoro (ad esempio, in autoclave e la pulizia con un disinfettante antivirale appropriata in base alle istruzioni del produttore).

1. Preparativi prima dell'intervento chirurgico Beginning

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (vale a dire, in autoclave).
2. Diluire il virus al approprconcentrazione iate, che variano a seconda della tossicità del virus specifico utilizzato e la suscettibilità del ceppo di ratto.
   Nota: Per esempio, quando si utilizzano virus della stomatite vescicolare nei ratti maschi Buffalo, di solito Iniettare 10 ⁷ PFU in un volume 1 ml, che è la dose massima tollerata in quel modello.
   1. Precompilare il virus (utilizzando una tecnica asettica) in 1 ml siringhe, aghi e allegare 30 G, avendo cura di eliminare l'aria dalla siringa e l'ago.
3. Preparare lo spazio chirurgico con tutti i materiali e le attrezzature necessarie, e spruzzare la zona con etanolo per disinfettare. Riempire un piccolo recipiente con soluzione salina sterile (0,9% NaCl) per inumidire i tamponi di garza e applicatori con punta in cotone.

2. Preparazione del Rat

1. Somministrare un analgesico (come specificato dalla commissione cura degli animali e uso locale), al appropriata dose di 30 min prima di iniziare la procedura chirurgica. Per esempio,somministrare una dose elevata di metamizolo (100-200 mg / kg).
2. Anestetizzare il topo mediante inalazione (isoflurano) o iniettabili (cioè, una miscela di medetomidina (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), e fentanil (0,005 mg / kg), noto anche come MMF) anestesia. Amministrare isolflurane attraverso un vaporizzatore al 1-3% e regolare come necessario per mantenere la respirazione normale e la frequenza cardiaca.
   1. Prima di procedere, assicurarsi che il ratto è completamente sedato e in grado di sentire dolore pizzicando il rilievo del piede e osservando una reazione.
   2. Applicare una pomata occhio veterinaria per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
3. Radere la zona addominale dallo sterno verso il basso per appena sopra i genitali con un piccolo tagliatore di capelli veterinaria. Fare attenzione per ottenere una rasatura senza ferire la pelle.
4. Fissare il ratto al letto chirurgico con del nastro sulla zampe anteriori e posteriori, e, se si utilizza l'anestesia per inalazione, mettere il muso in un cono di dimensioni adeguate. Posizionare una piastra elettricasotto il topo per mantenere la temperatura corporea. Disinfettare la zona addominale utilizzando un disinfettante grado chirurgico, seguito da un risciacquo di alcol e l'applicazione di una vernice antisettica.

3. laparotomia

1. Usando un piccolo bisturi curvo, ad esempio # 15, fare una piccola incisione verticale nello strato pelle direttamente lungo la linea mediana. Estendere l'incisione fino al processo xifoideo. Avanti, incidere lo strato muscolare delicatamente sollevando con un paio di pinze Adson per fare un'incisione bisturi, e quindi estendere l'incisione fino al processo xifoideo con le forbici chirurgiche. Fare attenzione a non forare organi della cavità addominale o danneggiare i piccoli vasi su entrambi i lati del processo xifoideo.
2. Posizionare un divaricatore attraverso l'addome per diffondere il muscolo e pelle ed esporre l'intera zona addominale.
3. Inumidire due 7,5 x 7,5 cm ² tamponi di garza con soluzione fisiologica sterile e diffondere uno nella parte superiore della chirurgicaapertura ed una parte inferiore, come mostrato nella Figura 2A.

4. Isolamento dell'arteria epatica

1. Utilizzando due tamponi di cotone imbevuto applicatori inumiditi con soluzione fisiologica sterile, sollevare delicatamente l'intestino e cieco fuori della cavità addominale, e metterli sul tampone di garza inferiore. Piegare la garza sopra per mantenere gli organi umido e di tenerli fuori del modo.
2. Utilizzando due tamponi di cotone inumiditi applicatori, sollevare delicatamente il lobo epatico laterale sinistro, che sarà il lobo più predominante in considerazione in questa fase. Vibrazione lobo verso l'alto, e, utilizzando un piccolo paio di forbici primavera, tagliare la membrana fibrosa sul lato inferiore del lobo, permettendo il lobo di essere completamente capovolta verso l'alto e riposo sopra il tampone di garza precedentemente posizionato. Piegare il tampone di garza sopra il lobo per tenerlo in posizione.
3. Continuare con la prossima lobo (caudato anteriore), che è ora il lobo più anteriore in vista. con esimoe aiuto di un microscopio da dissezione e pinza sottile, sezionare la sottile membrana che circonda il lobo per rilasciarlo e farlo liberamente capovolto verso l'alto. Posizionare il lobo sotto il tampone di garza insieme con il lobo laterale sinistro.
4. Osservare il lobo posteriore caudato, che sarà ora visibile. Ripetere il passaggio 4.3 di sezionare completamente il caudato lobo posteriore e flip verso l'alto e dentro la garza con i lobi del fegato precedentemente posizionati.
5. Appena sotto la posizione originaria del lobo caudato, trovare l'arteria epatica comune, che sarà ora visibile e facilmente riconoscibile per la sua forte pulsazioni. Dopo l'arteria verso destra anatomica, osservare il materiale membranoso spessore oscurare le arterie epatiche gastroduodenali e propri da vista. Utilizzando una pinza sottile, sollevare questo materiale e delicatamente strappare, avendo cura di evitare eventuali piccoli vasi in questo settore. Usare tamponi di cotone applicatori per fermare qualsiasi emorragia che potrebbero verificarsi.
   1. Individuare l'unarami rterial, che sarà ben visibile con l'aiuto di un microscopio da dissezione quando le membrane siano correttamente sezionati.
6. Utilizzando due fini, pinze atraumatiche, sezionare con cura l'arteria epatica comune, l'arteria gastroduodenale, e l'arteria epatica adeguata in modo tale che essi sono liberati dalle membrane che circondano (Figura 2b).

5. Preparazione della Artery iniettabile

1. Passare un Prolene di sutura 7-0 sotto l'arteria gastroduodenale, e utilizzare un micro-ago-titolare di legare una legatura permanente alla fine distale, appena sopra la biforcazione (vedi Figura 1 per il corretto posizionamento). Attendere circa 2 pollici di materiale di sutura rimanenti sulle estremità, e bloccare con un supporto dell'ago per tirare l'arteria insegnato, come in Figura 2C.
2. Mettere un piccolo morsetto sulla arteria epatica comune per bloccare temporaneamente il flusso di sangue (Figura 2C).
   Nota: Questo è important evitare sanguinamento massivo volta l'ago viene rimosso dalla arteria. Inoltre, il blocco del flusso di sangue arterioso permette la somministrazione virus lento e migliore efficienza di trasduzione.
   1. Importante: Lavorare velocemente per limitare la quantità di tempo che il flusso di sangue viene arrestata - effettuare l'iniezione e la successiva legatura dell'arteria entro 5 minuti bloccaggio dell'arteria epatica comune.
3. Se possibile, aumentare l'ingrandimento del microscopio da dissezione, tale che l'arteria gastroduodenale è a fuoco e sembra abbastanza grande per inserire con precisione il ago G 30. Inserire l'ago della siringa nel lume dell'arteria gastroduodenale e lentamente spingere lo stantuffo.
   Nota: posizionamento corretto dell'ago comporterà la soluzione iniettata scorre direttamente attraverso il corretto arteria epatica e verso il fegato.
   1. Eseguire l'iniezione molto lentamente per massimizzare l'efficienza di trasduzione.
4. Una volta che l'intero volume di iniezione è stato somministrato, retrarre lentamente l'ago dalla arteria.
   Nota: Non ci dovrebbero essere sanguinamento dal sito di iniezione. Nel caso che il sanguinamento si verifica, indica che il morsetto non è correttamente posizionato e deve essere regolato rapidamente.

6. chiusura

1. Passare un secondo 7-0 Prolene sutura sotto l'arteria gastroduodenale, e legare una seconda legatura permanente al di sopra del sito di iniezione.
2. Rimuovere la fascetta dalla arteria epatica comune. Verificare che il flusso di sangue attraverso l'arteria epatica corretto verso il fegato è stata ripristinata.
   1. Tagliare le estremità delle legature.
3. Verificare che non vi è alcun sanguinamento, prima di tornare l'intestino e il fegato alla cavità addominale. Fare attenzione che l'appendice viene restituito il suo orientamento originale.
4. Suturare la muscolo e pelle in strati separati utilizzando 4-0 Vicryl materiale di sutura con un ago curvo. luogo fissa Sus suture di circa 1 mm l'uno dall'altro e tirare con forza.
   1. Durante la fase di sutura, somministrare un analgesico come buprenorfina (0,05 mg / kg).
5. Rimuovere ratto dall'anestesia. Se è stato utilizzato isoflurano, il ratto dovrebbe riprendere conoscenza in pochi minuti. Se MMF è stato usato come una anestesia iniettabile, antagonizzare con un'iniezione sottocutanea di atipamezolo (0,75 mg / kg), flumazenil (0,2 mg / kg), e naloxone (9.12 mg / kg), che invertire gli effetti dell'anestesia e consentire agli animali di recuperare la coscienza entro 20 min. Mantenere ratti caldo con una lampada a raggi infrarossi riscaldamento durante la fase di risveglio iniziale.
   1. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
   2. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
6. Monitorare ratti post-operatoria per i segni patologici di disagio, e followcon analgesici, come richiesto dalla commissione cura degli animali e uso locale. Ad esempio, la buprenorfina può essere somministrato a 0,05 mg / kg ogni 12 ore.

Risultati

Con l'esperienza, un tasso di successo quasi il 100% (il che significa che l'arteria è stato dissezionato successo e iniettata, e l'animale sopravvissuto chirurgico) può essere raggiunto. Tuttavia, lo stato di salute del ratto prima dell'intervento chirurgico (grado di carico tumorale, la funzione epatica sottostante, etc.) sarà ovviamente un ruolo nel risultato dell'intervento chirurgico. Dopo l'intervento chirurgico, i ratti può aspettare che una perdit...

Discussione

Sebbene l'iniezione intratumorale diretta sia senza dubbio il metodo più semplice per ottenere un'efficiente trasduzione tumorale di un singolo nodulo tumorale, l'infusione arteriosa epatica rappresenta una via di somministrazione ideale per colpire l'HCC multifocale e ortotopico. Questo metodo si è dimostrato sicuro ed efficace per il trattamento dell'HCC in ratti immunocompetenti con virus oncolitici. Inoltre, poiché i pazienti con HCC sono trattati di routine mediante applicazione transarteriosa di chemioembolizzazi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tosatrici veterinarie	Aesculap	GT415	Piccolo rifinitore a batteria ideale per rimuovere il pelo dall'area chirurgica
Stereomicroscopio	Zeiss	Stemi SV6
30 G Aghi	Braun	4656300	30 G x ½ "
Siringhe da 1 ml Braun		9161406V	Siringa per tubercolina
Bisturi monouso	Feather	2975#15	#15 lama
Forbici chirurgiche standard	Fine Science Tools	14001-13	Affilato/smussato, per l'apertura della pelle e dei muscoli
Pinza Adson	Fine Science Tools	1101-12	Con denti, per afferrare la pelle e il muscolo
Divaricatore Alm	Fine Science Tools	17008-07	Con denti smussati, per allargare la cavità addominale aperta durante l'intervento chirurgico
Tamponi di garza	Lohmann & Rauscher	18504	7,5 cm x 7,5 cm, deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso
Tamponi applicatori con punta in cotone	Lohmann & Rauscher	11970	Sterile
Foreceps a punta fine	Fine Science Tools	11063-07	0,4 mm, punta angolata, per la dissezione dell'arteria epatica
Forbici a molla Vannas	Fine Science Tools	91500-09	Per il taglio delicato
Micro-porta aghi	Fine Science Tools	12076-12	Per legare l'arteria gastroduodenale
Porta aghi	Fine Science Tools	12005-15	Ganasce in carburo di tungsteno
7-0 Suture in prolene	Ethicon	8648H	Sutura in polipropilene con ago curvo, per legare l'arteria gastroduodenale
4-0 Suture in vicryl	Ethicon	V3040H	Con ago curvo montato
Lampada riscaldante a infrarossi	Beurer	IL11	Per il mantenimento della temperatura corporea dopo l'intervento