Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

Sommario

Gli oligodendrociti sono le cellule mielinizzanti del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la coltura dei loro precursori, le cellule progenitrici degli oligodendrociti, da cortecce di ratto, nonché un metodo quantitativo rapido e affidabile per valutare l'oligodendrogenesi in vitro in risposta a fattori sperimentali.

Abstract

L'oligodendrogenesi efficiente è l'obiettivo terapeutico di una serie di aree di ricerca tra cui le lesioni del midollo spinale, l'ipossia neonatale e le malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla e la mielite trasversa. La mielinizzazione è necessaria non solo per facilitare la rapida propagazione dell'impulso all'interno del sistema nervoso centrale, ma anche per fornire supporto trofico agli assoni sottostanti. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) possono essere studiate in vitro per aiutare a identificare i fattori che possono promuovere o inibire la differenziazione degli oligodendrociti. Ad oggi, molti dei metodi disponibili per valutare questo processo hanno richiesto un gran numero di cellule, limitando così il numero di condizioni che possono essere studiate in qualsiasi momento, o metodi di quantificazione ad alta intensità di lavoro. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento di un gran numero di OPC altamente puri insieme a un metodo rapido e affidabile per determinare l'oligodendrogenesi da più condizioni contemporaneamente. Le OPC sono isolate da cortecce neonatali di ratto P5-P7 e coltivate in vitro per tre giorni prima della differenziazione. Quattro giorni dopo il differenziamento, l'oligodendrogenesi viene valutata utilizzando un test a scansione a fluorescenza a doppio infrarosso per determinare l'espressione della proteina mielina.

Introduzione

Efficiente conduzione nervosa nel sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) richiede mielinizzazione degli assoni dagli oligodendrociti. Durante lo sviluppo, oligodendrociti nascono da un pool di cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) che si pensa di migrare dalle zone ventricolari del prosencefalo sviluppo e tubo neurale ^1. Dopo OPC migrazione differenziano in maturi, oligodendrociti mielinizzanti che non solo facilitare l'utilizzo efficiente di propagazione degli impulsi, ma anche fornire gli assoni con il supporto trofico ^2. L'adulto CNS mantiene una popolazione abbondante di OPC che si disperdono in tutta la materia grigia e bianca che comprende circa il 5-8% di tutte le cellule ^3. A seguito di un insulto demielinizzante, OPC migrano al sito di lesione, proliferano e si differenziano per sostituire guaine mieliniche persi o danneggiati in assoni esposti. Tuttavia, in alcune impostazioni malattia / infortunio, questo processo si trova ad essere inefficiente o può fallire completamente ^4. Mentredemielinizzazione cronica è pensato di aggiungere al peso della malattia, oligodendrogenesis e rimielinizzazione efficiente può alleviare i sintomi ^5. È stato quindi interessante studiare OPC in vitro per determinare l'effetto di fattori sperimentali oligodendrogenesis.

Insight nelle diverse fasi di differenziazione degli oligodendrociti è stato reso possibile tramite l'identificazione di marcatori cellulari specifici stadi. Auto-rinnovamento delle cellule progenitrici precoci sono definite dalla loro espressione del fattore di crescita derivato dalle piastrine del recettore alfa (PDGFRα), neurale / glia antigene 2 (NG2) e A2B5 ^6-8. Come OPC iniziano il loro programma di differenziazione e si ritirano dal ciclo cellulare, che downregulate espressione di questi marcatori e cominciano a esprimere le proteine ​​indicativi di premyelinating oligodendrociti tra ciclico-nucleotide 3'-fosfodiesterasi (CNPase) e O4. Infine, la loro differenziazione in oligodendroc più maturoYtes si caratterizza per l'espressione di proteine ​​della mielina-associata, tra cui glicoproteina mielina-associata (MAG), proteolipid proteina (PLP), e proteina basica della mielina (MBP). MBP è una proteina periferica di membrana intracellulare e una componente importante della guaina mielinica. Topi privi MBP sviluppano una grave fenotipo in cui CNS mielinizzazione è significativamente diminuiti con conseguente tremori, convulsioni e morte precoce ^9,10. Questo ruolo importante MBP in myelination ha portato al suo uso come marker di differenziazione degli oligodendrociti sia in vitro che in vivo ^11.

La quantificazione del MBP può essere effettuata mediante diverse metodologie differenti. RT-PCR e analisi Western Blot consentono per la quantificazione dei livelli di MBP sotto diversi regimi di trattamento. Immunocytochemistry è un approccio qualitativo comune che può anche essere quantitativa quando si utilizzano approcci microscopia basati su telecamere. Sebbene questi sistemi sono affidabili e fondamentale perlo studio della differenziazione degli oligodendrociti, ognuno ha i propri svantaggi che limitano il loro uso in screening di stupefacenti. In primo luogo, la quantità di OPC primari che sono necessari per la RT-PCR ed analisi Western blot riduce il numero di variabili che possono essere esaminati simultaneamente. Mentre il requisito cella per immunocitochimica è molto più basso, consistente lasso di tempo deve essere dedicato a ogni esperimento, se la quantificazione è l'obiettivo. Numerose immagini devono essere catturate e poi quantificati per facilitare l'analisi sperimentale. Questi avvertimenti diventano ostacoli importanti da considerare per gli studi che richiedono la valutazione elevato throughput. Qui si descrive un metodo che utilizza aspetti fondamentali sia dal immunocitochimica e metodologie Western Blot per mielina quantificazione, riducendo significativamente sia il numero di cellule necessario e il tempo per completare l'analisi quantitativa.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Usa Comitato (IACUC) e la Johns Hopkins School of Medicine.

1. Preparazione di piatti analisi, soluzioni di riserva, e OPC base per supporti multimediali

Nota: La base di ratto OPC (Sato) i media qui descritte sono state derivate da studi pubblicati in precedenza ^12,13. formulazioni dei media alternativi possono anche essere compatibili con questa procedura.

1. Risospendere poli-L-lisina (PLL) ad una concentrazione di 10 mg / ml in acqua deionizzata sterile. Pipettare 400 ml di PLL diluito in ogni pozzetto di un fondo 24 tessuto ben piatto nero parete, chiaro cultura grado.
2. Coat piatti di coltura di tessuti per 2 ore a 37 ° C tessuto cultura incubatore o durante la notte in un frigorifero C 4 °.
3. Aspirare PLL da piatti rivestiti di almeno 20 minuti prima della placcatura. Lasciare il restante PLL asciugare dal pozzo posizionando 24 pozzetti con il coperchio parzialmente socchiusa in coltura tissutalecappuccio. Verificare che i pozzi siano completamente asciutti prima di placcatura OPC isolati. Le cellule non aderiranno alla plastica che ha liquido PLL presente.
4. Preparare soluzione madre acetil-L-cisteina (NAC) N (1,000x): Sciogliere 100 mg N acetil-L-cisteina (NAC) in 20 ml di mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM). Aliquota e conservare a -20 ° C.
5. Preparare soluzione madre Idrocortisone (1,000x): Aggiungere 1 ml di etanolo a 1 mg di idrocortisone e agitare per sciogliere. Aggiungere 19 ml di DMEM, miscelare la soluzione, aliquotare e conservare a -20 ° C. L'aggiunta di idrocortisone ai mezzi di base ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza delle cellule gliali ^14.
6. Preparare d-biotina soluzione madre (5,000x): Sciogliere 2,5 mg di d-biotina in 50 ml di PBS. Aggiungere 1-2 x 5 gocce microlitri di 0,1 N NaOH per aiutare nella dissoluzione. Aliquota e conservare a -20 ° C.
7. Preparare la soluzione di insulina magazzino (100x): Sciogliere 25 mg di insulina in 50 ml di acqua di grado coltura di tessuti. Aggiungere 250 ml of 1 N HCl e mescolare fino a quando la soluzione è chiara. Sterilizzazione con un filtro da 0,22 micron e conservare a 4 ° C, per 6 settimane.
8. Preparare soluzione madre Sato (100x):
   1. Preparare la soluzione di progesterone magazzino (25 mg / mL): Sciogliere 2,5 mg di progesterone in 100 ml di etanolo.
   2. Preparare la soluzione selenite magazzino di sodio (400 ng / ml): sciogliere 4 mg di sodio selenite in 100 ml di 0,1 N NaOH. Aggiungere 10 ml di DMEM e mescolare.
   3. Per 100 ml di DMEM, aggiungere 1 g di umana apo-transferrina, 1 g di albumina di siero bovino, e 160 mg di putrescina e mescolare per sciogliere completamente. Aggiungere 25 ml di soluzione di progesterone magazzino, 1.000 ml di soluzione di selenite di sodio magazzino, e mescolare. Aliquota e conservare a -20 ° C.
9. Preparare OPC Base di supporto: per 100 ml di DMEM (con 4,5 g / L D-glucosio, L-glutammina, e 110 mg / l di sodio piruvato), aggiungere 100 ml NAC, 100 ml idrocortisone, 20 ml d-biotina, 1 ml insulina, 1 ml di Sato magazzino, 100 ml oligoelementi B,2 mL B-27 supplemento (50x), e 1 ml di penicillina / streptomicina (100x). Sterilizzare con un filtro 0,22 micron e conservare a 4 ° C.
10. Preparare PDGF-AA soluzione madre (1,000x): sciogliere 250 mg a 12,5 ml di PBS con 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) per ottenere una soluzione 20 mg / ml. Aliquota e conservare a -80 ° C.
11. Preparare OPC mezzi proliferazione: base per supporti multimediali OPC integrato con 20 ng / ml PDGF-AA.
12. Preparare i media differenziazione OPC: base per supporti multimediali OPC integrato con 45 Nm triiodotironina.
13. Preparare Colonna Buffer: Per 500 ml di PBS, aggiungere 2,5 g di BSA e 2 ml di 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e regolare il pH a 7,2. Sterilizzare con un filtro 0,22 micron e conservare a 4 ° C.

2. cervello di ratto dissezione

Nota: cuccioli P5-P7 di ratto vengono utilizzati in questo protocollo. Ogni corteccia dei ratti produce circa 1,5-2,0 x 10 ⁶ A2B5 cellule positive.

1. Sterilizzare tutte le apparecchiature dissezione con un 2506; C tallone riscaldata sterilizzatore.
2. Aggiungere 15-20 ml di PBS (senza Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ a 50 ml provette coniche. Un tubo da 50 ml è sufficiente per 3-4 cortecce topo cucciolo. Mettere 50 ml provette coniche su ghiaccio. Utilizzare 50 ml provette coniche per tenere il tessuto corticale dadini durante la dissezione.
3. Aggiungere PBS freddo a 10 cm Petri. Questo piatto sarà utilizzato per la dissezione al microscopio ottico.
4. Sacrifice cuccioli di ratto per decapitazione con grandi forbici chirurgiche. Spray testa con il 70% di etanolo.
5. Estrarre il cervello intero
   1. Utilizzo di piccole forbici tagliare la pelle verso il basso la linea mediana e dietro le orecchie e lembi cutanei buccia indietro. Tagliare il cranio lungo la linea mediana partendo dal tronco cerebrale e termina gli occhi. Fare attenzione a non tagliare troppo profondamente per preservare la struttura della corteccia sottostante.
   2. Fare due tagli laterali inferiori al cervelletto inserendo piccole forbici chirurgiche nel foro occipitale. Effettuare un taglio ulteriore in mezzo agli occhi, formicaerior ai bulbi olfattivi.
   3. buccia con attenzione ogni metà del cranio posteriore. Rimuovere l'intero cervello e mettere in 10 centimetri Petri piatto pieno di PBS freddo.
6. Sotto il microscopio ottico dissezione, rimuovere i bulbi olfattivi e cervelletto con fini pinza chirurgica.
7. Capovolgere il cervello in modo che la superficie ventrale è visibile sotto il microscopio ottico.
8. Uso di pinze diritte sottili eseguire una dissezione smussa mettendo pinze punte chiuse tra la corteccia e l'ipotalamo ad una profondità di circa 2/3 del cervello. Una volta pinze sono in atto consentire alle estremità di aprire. Ripetere l'operazione per l'altro emisfero.
9. Tease la corteccia dall'ipotalamo e regioni del mesencefalo.
10. Rimuovere l'ipotalamo, talamo e mesencefalo tenendo mesencefalo alla sua superficie posteriore e peeling verso la fine anteriore del cervello. Sever i collegamenti anteriori.
11. Rimuovere l'ippocampo da pealing verso l'esterno e poi tranciamento il suo collegamento alcorteccia con pinza sottile dissezione piegate.
12. Rimuovere restante striato da rottamazione che dalla corteccia sottostante in un movimento verso l'esterno in diagonale con pinza sottile dissezione piegate.
13. Cancellare tutti i vasi sanguigni e meningi dalla superficie ventrale della corteccia.
14. Capovolgere il cervello in modo che la superficie dorsale è visibile. Meningi e vasi sanguigni dovrebbe essere evidente. meningi Peel dalla corteccia sottostante con pinze dissezione fine. Avviare peeling dalla posizione olfattiva attacco lampadina.
15. Completa i passaggi 2,4-2,14 per un totale di 3-4 cuccioli di ratto.
16. Mettere 3-4 sezionati cortecce ratto cuccioli in una capsula di Petri asciutto e tagliare con una lama di rasoio sterilizzato fino a 1 mm pezzi x 1 mm si ottengono. Raccogliere il tessuto sciacquando piatto con PBS da un tubo da 50 ml (fase 2) quindi inserire di nuovo sul ghiaccio.

3. enzimatica e meccanica dissociazione Tissue

Nota: Per questo passaggio, si consiglia un kit di dissociazione neurali papaina-based. utilizzando NeKit dissociazione Ural (P), sono descritti passaggi speciali che sono ottimali per l'isolamento OPC.

1. Preparare il primo enzima dissociazione diluendo dell'enzima P con il tampone appropriato. Il contenuto di ogni conica 50 ml (1 campione) saranno risospese con un totale di 1.950 ml di miscela enzimatica. Posto nel mix enzima in un bagno a 37 ° C per 10 min.
   1 campione: 1.900 ml di tampone + 50 ml di enzima papaina
2. Spin tutti i 50 ml provette coniche contenenti 3-4 dadini cortecce cuccioli di ratto a 300 xg per 3 min.
3. Aspirare il surnatante e aggiungere 1.950 ml di soluzione enzimatica a ciascuna provetta e rompere a parte il pellet invertendo il tubo e scuotendo delicatamente.
4. Incubare a 37 ° C tessuto cultura incubatore per 15 min con rotazione tubo continuo.
5. Durante gli ultimi 5 min di incubazione, preparare la seconda miscela enzimatica A. Diluire l'enzima nel suo buffer appropriata. Sarà aggiunto un totale di 30 microlitriper ogni 50 ml provetta conica.
   1 del campione: 20 ml di tampone + 10 ml di enzima
6. Dopo incubazione è completato aggiungere 30 microlitri della seconda miscela enzima per ciascuna provetta e miscelare.
7. Usando una pipetta Pasteur di vetro collegato a un controller pipetta, dissociarsi meccanicamente il tessuto pipettando 10-15 volte o fino a quando i pezzi di tessuto sono di dimensioni ridotte e la soluzione è diventata torbida. Riportare il campione al 37 ° del tessuto C cultura incubatore per 15 minuti con rotazione continua.
8. Pipettare ciascun campione di tessuto omogenato 10-15 volte con una pipetta 1 ml.
9. Pipettare ciascun campione di tessuto omogenato 15-20 volte con una pipetta 200 microlitri
10. Rientro tutti i campioni al 37 ° del tessuto C cultura incubatore per 10 minuti con rotazione continua.
11. Aggiungere 10 ml di PBS (con Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ per ogni campione e filtrare l'omogeneizzato attraverso un filtro 40 micron pori posto sopra un 50 ml tubo. Lavare il filtro con un ulteriore 1-2 ml di PBS.
12. Pool tutti i campioni di omogenato in una provetta da 50 ml conica e acquisire un numero complessivo di cellule.
13. Dopo aver eseguito il conteggio delle cellule, dividere l'omogeneizzato in modo uniforme in 15 ml provette coniche (1 tubo per ogni campione). Centrifugare per 10-12 min a 300 x g.

4. Anti-A2B5 Bead Application, Purificazione Colonna, e placcatura

1. Eseguire calcoli per buffer di colonna e microsfere anti-A2B5. Aggiungere 7 ml Colonna buffer per ogni cellule 1 x 10 ^6. Aggiungere 2 microlitri microsfere anti-A2B5 ogni cellule 1 x 10 ^6.
2. Unire tutti i campioni da risospendere le cellule in un volume totale di 10 ml di tampone colonna e centrifugare a 300 xg per 10-12 min.
3. Risospendere il pellet di cellule in quantità appropriata di tampone colonna come calcolata al punto 4.1. Se il pellet è grande e sciolto, aggiungere solo circa la metà del volume di tampone di colonna per mantenere l'anticorpo alla concentrazione appropriata in risospensione delle cellule.
4. Incubare la sospensione cellulare per 10 min a 4 ° C.
5. Aggiungere microsfere anti-A2B5 (calcolata al punto 4.1), capovolgere diverse volte e incubare a 4 ° C per 30-60 min. Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte ogni 10 min. tempi di incubazione più lunghi possono aumentare le rese di cellule, ma possono aumentare legame non specifico.
6. Aggiungere 5 volumi di tampone di colonna. Se le cellule sono risospese in un volume di 1 ml, aggiungere 5 ml di tampone di colonna, mentre se le cellule sono risospese in 2 ml, aggiungere 10 ml di tampone di colonna.
7. Centrifugare per 10 min a 300 x g.
8. Determinare il numero di LS colonne saranno necessari per la purificazione. Una colonna LS è sufficiente per 15-20 x 10 ⁶ cellule totali.
9. Risospendere il pellet cellulare in 1.000 ml di tampone di colonna per colonna LS utilizzato.
10. Prime ciascuna colonna LS aggiungendo 5 ml di tampone di colonna. Raccogliere il flusso attraverso una provetta conica da 50 ml. Una volta che i bu colonnaffer ha completamente attraversato la camera superiore, applica 1,000 ml di sospensione cellulare per ogni colonna e permettono alle cellule di attraversano per gravità.
    Nota: Se la densità delle cellule è troppo alta, la colonna può funzionare lento.
11. Subito dopo la sospensione cellulare è passato attraverso la colonna, aggiungere lentamente 3 ml di tampone di colonna per ciascuna colonna per lavare le cellule non legato. Se il lavaggio viene facilmente eseguito attraverso la colonna (1 goccia per ogni 30-45 sec), lavare ancora due volte con 3 ml di tampone di colonna.
12. Rimuovere ogni colonna e posizionarlo su un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 ml di tampone colonna e precipitare il tampone attraverso la colonna ad una velocità rapida utilizzando il pistone di plastica che si comprime con la colonna. Immergendo sarà rimuovere le cellule legate li rilasciano dalla colonna.
13. Aumentare la purezza eseguendo il campione attraverso un secondo turno di LS colonne. Utilizzare un terzo del numero di colonne utilizzate durante il primo passaggio. Prime le colonne con 5 ml di tampone di colonna.Lasciare il buffer colonna per passare attraverso la camera superiore.
14. Poiché il volume di sospensione cellulare sarà molto maggiore, applicare uniformemente 1.000 ml di sospensione cellulare per ogni colonna e consentire la sospensione di passare attraverso la camera superiore della colonna prima reintegro con altri 1.000 ml.
15. Una volta che la sospensione cellulare è stato completamente applicato al secondo turno di colonne, lavare 2-3 volte con 3 ml di tampone colonna.
16. Rimuovere ogni colonna e metterlo sopra un tubo da 15 ml sterile. Aggiungere 5 ml di tampone colonna e precipitare il buffer utilizzando lo stantuffo di plastica che viene fornito con la colonna. Immergendo sarà rimuovere le cellule legate li rilasciano dalla colonna.
17. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 12-15 min. Il pellet deve apparire compatta.
18. Risospendere il pellet cellulare in 5-10 ml di mezzi di OPC proliferazione pre-riscaldato (supporto di base OPC integrato con PDGF-AA 20 ng / ml).
19. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
20. Piastra le cellule. Diluire le cellule a 60.000 cellule / ml con i media OPC proliferazione. In ogni nero, chiaro fondo 24 bene, pipetta 500 ml di cellule lungo il lato del pozzo per ottenere 30.000 cellule per pozzetto. Mescolare le cellule agitando la piastra orizzontale con una figura otto movimento. Se l'esecuzione del saggio in 48, 96, o 384 pozzetti, aggiungere 15.000, 7.500, o 1.500 cellule per pozzetto, rispettivamente. Questi numeri possono essere regolati a seconda dei singoli di targa.
21. Preparare un piatto a parte per il giorno 0 colture di controllo della linea di base. Questo piatto di controllo deve essere fissato con paraformaldeide al 4% come descritto nel paragrafo 5.7, quando viene avviata la differenziazione al giorno 0.
22. Cultura le cellule in proliferazione OPC supporti a 37 ° C per 3 giorni con nessun cambiamento media.

5. L'induzione di OPC Differenziazione e fissazione con paraformaldeide al 4%

Nota: Durante il test l'effetto di piccole molecole su oligodendrogenesis, abbiamo quotidianamente dissolve farmaci in dimetilsolfossido (DMSO) per preparare 1,000x stock che possono poi essere conservati a -80 ° C e diluita direttamente nei mezzi di SATO per ottenere una concentrazione finale di 0,1% DMSO. Abbiamo osservato nessun cambiamento sia OPC proliferazione o la differenziazione utilizzando questa concentrazione di DMSO (dati non mostrati).

1. Pre-caldo supporto di base OPC a 37 ° C e scongelare le scorte di trattamento farmacologico a temperatura ambiente. Quando si eseguono trattamenti in doppio, allestire circa 1,25 ml di media per ogni gruppo di trattamento in una provetta da 1,5 ml. Per i campioni in triplicato, usare 2 tubi ml centrifuga per tenere conto di gioco.
2. Preparare il master mix di trattamento per i pozzi repliche diluendo le scorte di trattamento direttamente nel supporto di base OPC. Brevemente vortex o mescolare delicatamente ciascun mastermix assicurare una distribuzione omogenea del trattamento.
3. Preparare 45 nM triiodotironina (T ₃₎ come controllo positivo e il veicolo appropriato come controllo negativo. Diluire 10 mm t _{3 stock}1: 1.000 in 1 ml di supporti di base OPC e poi ulteriormente diluito nel master mix trattamento per ridurre la concentrazione finale di DMSO se necessario.
4. Aspirare il supporto dal gruppo un trattamento pozzetti di coltura alla volta in modo da evitare l'essiccazione delle cellule. Utilizzare una punta della pipetta 200 microlitri sull'estremità della pipetta Pasteur di vetro per evitare raschiando nero materiale dalle pareti del pozzo e nella cultura.
5. Aggiungere lentamente 500 ml di mastermix trattamento lungo il lato del pozzetto usando una pipetta 1 ml.
6. Incubare le culture per il periodo di tempo desiderato, eseguendo uno scambio completo dei media con i media di trattamento freschi ogni 2-3 giorni. Noi abitualmente osserviamo un 30-40% MBP ⁺ cultura dopo 4 giorni nei media differenziazione.
7. Alla fine del periodo di trattamento desiderato, preparare freschi 4% paraformaldeide (PFA) o scongelare uno stock congelati a temperatura ambiente. ATTENZIONE: PFA è estremamente tossico e deve essere preparato in una cappa aspirante.
8. Aspirare i media e aggiungere lentamente 4001; l di PFA al lato del pozzetto per fissare le cellule. Incubare la piastra per 20 min a temperatura ambiente.
9. Aspirare il PFA e aggiungere lentamente 500 ml di sterile D-PBS (con Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ al lato del pozzo per lavare le cellule. Ripetere il lavaggio per un totale di altre due volte. Non aspirare il lavaggio finale.
10. Avvolgere il piatto in parafilm e conservare a 4 ° C per la successiva elaborazione o procedere direttamente alla fase successiva. Le piastre possono essere conservate per diverse settimane.

6. Immunocitochimica e la quantificazione di proteina basica della mielina

Nota: Quando si eseguono le procedure di gestione dei liquidi nei 24 pozzetti, si consiglia di lavorare velocemente per evitare l'essiccamento delle cellule. Qui, si raccomanda l'utilizzo di un aspiratore multicanale e pipetta multicanale.

1. Portare la piastra a temperatura ambiente, aspirare i pozzetti, e aggiungere 250 ml di D-PBS (con Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ contenente 0,1% Triton X-100 e 5%siero di capra normale (NGS). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente orbitale.
2. Preparare la soluzione di incubazione primaria diluendo il mouse monoclonale anti-MBP anticorpi 1: 1.000 e l'anticorpo policlonale di coniglio anti-actina 1: 200 in D-PBS (con Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ contenente 5% NGS. In alternativa, policlonale di coniglio anti-Olig2 a 1: 1.000 può essere utilizzato per oligodendrociti normalizzazione specifico in colture gliali miste. Preparare la soluzione primaria sufficiente per ospitare 250 microlitri per bene.
3. Incubare gli anticorpi primari a 4 ° C durante la notte per 16-18 ore agitando delicatamente orbitale.
4. Aspirare la soluzione di incubazione primaria e lavare le cellule 3 x 10 min con 500 ml di D-PBS (con Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ a temperatura ambiente agitando delicatamente orbitale.
5. Mentre ci si lava la piastra, preparare la soluzione di incubazione secondaria diluendo anti-topo 680 e anti-coniglio 800 anticorpi 1: 500 in D-PBS (con Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ contenente 5% NGS. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce ambientale durante la preparazione di questa soluzione.
6. Aspirare il lavaggio finale e aggiungere 250 ml di soluzione di incubazione secondaria. Proteggere la piastra dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente orbitale.
7. Aspirare la soluzione di incubazione secondaria e lavare i pozzetti 3 x 10 min con 500 ml di D-PBS (con Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ a temperatura ambiente agitando delicatamente orbitale.
8. Eseguire la scansione del piatto utilizzando un sistema di imaging in grado di rilevare 700 nm e 800 nm emissioni di fluorescenza. Come punto di partenza, impostare l'offset a 3 e sensibilità a 1,5 per MBP, 5.0 per actina, e 3.5 per Olig2 focale. Regolare i valori di sensibilità come necessario per evitare la sovraesposizione del segnale.
9. Quantificare l'entità del oligodendrogenesis con metodi basati su software semi-automatici.
   1. Utilizzando il software, impostare la modalità di analisi piatto a "24 Well" e allineare i cerchi intorno tegli perimetro esterno dei pozzi sottoposti a scansione. Impostare il canale di normalizzazione a "800" ed esportare le intensità totali e relativi fluorescenza per il 700 nm (MBP) e 800 nm (Olig2 / actina) canali.
   2. Dividere la intensità a 700 nm per l'intensità a 800 nm per l'espressione MBP normalizzata in unità di fluorescenza relativa. Calcolare la media di misurazioni ripetute e scalare l'espressione al giorno 0 controlli + PDGF come necessario per l'analisi.

Risultati

OPC A2B5-positivi vengono isolati attraverso la selezione delle cellule positivo utilizzando un sistema di separazione della colonna magnetica. Prima della procedura di isolamento, l'intero cervello viene rimosso da cuccioli di ratto che sono tra P5 e P7. Una volta che l'intero cervello si stacca con successo dal cranio, bulbi olfattivi e del cervelletto vengono rimossi con pinza chirurgica sottili (Figura 1A). Per isolare tessuto corticale cerebrale ipotalamo, talamo e ...

Discussione

Il protocollo presentato qui descrive un metodo veloce e affidabile per isolare OPC ratto e quantificare in oligodendrogenesis vitro in risposta a fattori sperimentali. Utilizzando selezione positiva, alte rese di OPC vitali e puri sono utilizzati direttamente a fini sperimentali. Questo metodo semplifica l'isolamento, la coltura, e passi differenziazione in un arco di tempo 1 Settimana, e cellule fissate possono essere convenientemente conservato a 4 ° C per diverse settimane senza alcuna perdita ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali Dissection
PBS senza Ca2+ e Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x 10
cm Piastre di Petri in polistirene	Fisherbrand	0857512
Microscopio per dissezione ottica	Motic	SM2-168
Dissociazione Materiali
Rotatore di tubi	Miltenyi Biotec	130-090-753
Kit di dissociazione del tessuto neurale del rotatore del tubo di dissociazione (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Kit di dissociazione enzimatica
PBS con Ca2+ e Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μ m Filtro cellulare	Corning	352340
A2B5 Purificazione della colonna  Microsfere
Anti-A2B5	Miltenyi Biotec	130-097-864	anticorpi A2B5 legate a perline
	Miltenyi Biotec	130-042-401	Colonne a selezione magnetica
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS con Ca2+ e Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A9647	0,50%
Materiali di coltura
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimetil solfossido	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodotironina	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastina fumarato sale	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μ M
Quetiapina emifumarato sale	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μ M
N-acetil cisteina	Sigma-Aldrich	A9165	5 μ g/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P1524	10 μ g/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μ g/ml
Selenito di sodio	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Idrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotina	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	5 μ g/ml
Apo-Transferrina	Sigma-Aldrich	T1147	100 μ g/ml
Siero Bovino Albumina	Sigma-Aldrich	A4161	100 μ g/ml
Oligoelementi B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplemento	Life Technologies	17504044	1x
Penicillina/streptomicina	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
Visiplate nero a 24 pozzetti con coperchio	Perkin Elmer	1450-605	Grado di coltura tissutale
Immunocitochimica e quantificazione
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0,10%
Siero di capra normale	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
monoclonale di topo anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1.000 Diluizione
coniglio policlonale anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Diluizione
coniglio policlonale anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1.000 Diluizione
capra anti-topo 680RD	Licor	926-68070	1:500 Diluizione
capra anti-coniglio 800CW	Licor	926-32211	Diluizione 1:500
Alexa Fluor 594 capra anti-topo	Life Technologies	A11032	Diluizione 1:1.000
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio	Life Technologies	A11008	Diluizione 1:1.000
Prolong Gold antifade con DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS con Ca2+ e Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Sistema di imaging a infrarossi	Licor