Articolo metodologico

Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

DOI:

10.3791/53764

⸱

17 febbraio 2016

 ,  ,  , 
1Neurology, Johns Hopkins University, School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Gli oligodendrociti sono le cellule mielinizzanti del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la coltura dei loro precursori, le cellule progenitrici degli oligodendrociti, da cortecce di ratto, nonché un metodo quantitativo rapido e affidabile per valutare l'oligodendrogenesi in vitro in risposta a fattori sperimentali.

Abstract

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L'oligodendrogenesi efficiente è l'obiettivo terapeutico di una serie di aree di ricerca tra cui le lesioni del midollo spinale, l'ipossia neonatale e le malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla e la mielite trasversa. La mielinizzazione è necessaria non solo per facilitare la rapida propagazione dell'impulso all'interno del sistema nervoso centrale, ma anche per fornire supporto trofico agli assoni sottostanti. Le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) possono essere studiate in vitro per aiutare a identificare i fattori che possono promuovere o inibire la differenziazione degli oligodendrociti. Ad oggi, molti dei metodi disponibili per valutare questo processo hanno richiesto un gran numero di cellule, limitando così il numero di condizioni che possono essere studiate in qualsiasi momento, o metodi di quantificazione ad alta intensità di lavoro. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'isolamento di un gran numero di OPC altamente puri insieme a un metodo rapido e affidabile per determinare l'oligodendrogenesi da più condizioni contemporaneamente. Le OPC sono isolate da cortecce neonatali di ratto P5-P7 e coltivate in vitro per tre giorni prima della differenziazione. Quattro giorni dopo il differenziamento, l'oligodendrogenesi viene valutata utilizzando un test a scansione a fluorescenza a doppio infrarosso per determinare l'espressione della proteina mielina.

Introduzione

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Efficiente conduzione nervosa nel sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) richiede mielinizzazione degli assoni dagli oligodendrociti. Durante lo sviluppo, oligodendrociti nascono da un pool di cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) che si pensa di migrare dalle zone ventricolari del prosencefalo sviluppo e tubo neurale 1. Dopo OPC migrazione differenziano in maturi, oligodendrociti mielinizzanti che non solo facilitare l'utilizzo efficiente di propagazione degli impulsi, ma anche fornire gli assoni con il supporto trofico 2. L'adulto CNS mantiene una popolazione abbondante di OPC che si disperdono in tutta la materia grig....

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Protocollo

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Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Usa Comitato (IACUC) e la Johns Hopkins School of Medicine.

1. Preparazione di piatti analisi, soluzioni di riserva, e OPC base per supporti multimediali

Nota: La base di ratto OPC (Sato) i media qui descritte sono state derivate da studi pubblicati in precedenza 12,13. formulazioni dei media alternativi possono anche essere compatibili con questa procedura.

  1. Risospendere poli-L-lisina (PLL) ad una concentrazione di 10 mg / ml in acqua deionizzata sterile. Pipettare 400 ml di PLL diluito in ogni pozzetto di un fondo 24 tessuto ben ....

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Risultati

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OPC A2B5-positivi vengono isolati attraverso la selezione delle cellule positivo utilizzando un sistema di separazione della colonna magnetica. Prima della procedura di isolamento, l'intero cervello viene rimosso da cuccioli di ratto che sono tra P5 e P7. Una volta che l'intero cervello si stacca con successo dal cranio, bulbi olfattivi e del cervelletto vengono rimossi con pinza chirurgica sottili (Figura 1A). Per isolare tessuto corticale cerebrale ipotalamo, talamo e .......

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Discussione

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Il protocollo presentato qui descrive un metodo veloce e affidabile per isolare OPC ratto e quantificare in oligodendrogenesis vitro in risposta a fattori sperimentali. Utilizzando selezione positiva, alte rese di OPC vitali e puri sono utilizzati direttamente a fini sperimentali. Questo metodo semplifica l'isolamento, la coltura, e passi differenziazione in un arco di tempo 1 Settimana, e cellule fissate possono essere convenientemente conservato a 4 ° C per diverse settimane senza alcuna perdita .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Concedere sponsor: National Institutes of Health; codice di autorizzazione: R37 NS041435.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali Dissection
PBS senza Ca2+ e Mg2+Mediatech21-040-CV1x 10
cm Piastre di Petri in polistireneFisherbrand0857512
Microscopio per dissezione otticaMoticSM2-168
Dissociazione Materiali
Rotatore di tubiMiltenyi Biotec130-090-753
Kit di dissociazione del tessuto neurale del rotatore del tubo di dissociazione (P)Miltenyi Biotec130-092-628Kit di dissociazione enzimatica
PBS con Ca2+ e Mg2+Corning20-030-CV1x
40 μ m Filtro cellulareCorning352340
A2B5 Purificazione della colonna  Microsfere
Anti-A2B5Miltenyi Biotec130-097-864anticorpi A2B5 legate a perline
Miltenyi Biotec130-042-401Colonne a selezione magnetica
EDTACorning46-034-Cl2 mM
PBS con Ca2+ e Mg2+Corning20-030-CV1x
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA96470,50%
Materiali di coltura
PDGF-AAPeproTech Inc100-13A20 ng/ml
Dimetil solfossidoSigma-AldrichD2650Hybri-Max 100 ml
Triiodotironina Sigma-AldrichT639745 nM
Clemastina fumarato saleSigma-AldrichSML0445-100MG1 μ M
Quetiapina emifumarato saleSigma-AldrichQ3638-10MG1 μ M
N-acetil cisteinaSigma-AldrichA91655 μ g/ml
ProgesteroneSigma-AldrichP878360 ng/ml
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP152410 μ g/ml
PutrecineSigma-AldrichP750516 μ g/ml
Selenito di sodioSigma-AldrichS526140 ng/ml
IdrocortisoneSigma-AldrichH013550 ng/ml
d-BiotinaSigma-AldrichB463910 ng/ml
InsulinaSigma-AldrichI66345 μ g/ml
Apo-TransferrinaSigma-AldrichT1147100 μ g/ml
Siero Bovino AlbuminaSigma-AldrichA4161100 μ g/ml
Oligoelementi BCorning25-022-Cl1x 
B-27 SupplementoLife Technologies175040441x 
Penicillina/streptomicinaLife Technologies151401221x 
DMEMLife Technologies11995-0651x 
Visiplate nero a 24 pozzetti con coperchioPerkin Elmer1450-605Grado di coltura tissutale
Immunocitochimica e quantificazione
PFASigma-Aldrich100-13A4%
Triton X-100Sigma-Aldrich787870,10%
Siero di capra normaleJackson Immuno Research005-000-1215%
monoclonale di topo anti-MBPBiolegendSMI-99P1:1.000 Diluizione
coniglio policlonale anti-ActinSanta Cruz BiotecnologySC-72101:200 Diluizione
coniglio policlonale anti-Olig2MilliporeAB96101:1.000 Diluizione
capra anti-topo 680RDLicor926-680701:500 Diluizione
capra anti-coniglio 800CWLicor926-32211Diluizione 1:500
Alexa Fluor 594 capra anti-topoLife TechnologiesA11032Diluizione 1:1.000
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglioLife TechnologiesA11008Diluizione 1:1.000
Prolong Gold antifade con DAPILife TechnologiesP36931
DPBS con Ca2+ e Mg2+Corning21-030-CV
Licor Odyssey Clx Sistema di imaging a infrarossiLicor
Colonne LS per

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
  2. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
  3. Dawson, M. R. L., Polito, A., Le....

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Cellule progenitrici degli oligodendrocitiQuantificazione dell oligodendrogenesiDissezione corticale di rattoSelezione cellulare attivata magneticamenteRilevazione della proteina basica della mielinaImmunocitochimica per Olig2Differenziamento in coltura cellulareTrattamento con fattori sperimentaliAnalisi di immagini a fluorescenza

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