Ipofunzione delle ghiandole salivari, un importante effetto avverso della radioterapia della testa e del collo diminuisce la qualità della vita di un paziente. La dimostrazione dell'efficacia di nuove terapie in modelli animali è un prerequisito prima della transizione clinica. Questo protocollo descrive la somministrazione retroduttale e l'irradiazione locale delle ghiandole sottomandibolari di ratto.
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Articolo metodologico
Retroductal ghiandola sottomandibolare instillazione e localizzati frazionato irradiazione in un modello murino di salivare Ipofunzione
In questo articolo
Sommario
Abstract
I tessuti normali che si trovano all'interno dei portali di radiazione vengono inavvertitamente danneggiati. Le ghiandole salivari sono spesso danneggiate durante la radioterapia della testa e del collo. Il danno cellulare irreparabile provoca una perdita cronica della funzione salivare che compromette le attività orali di base e aumenta il rischio di infezioni orali e carie dentali. L'ipofunzione salivare e le sue complicanze hanno un grave impatto sul comfort del paziente. L'attuale gestione sintomatica della condizione è inefficace e sono necessarie nuove terapie per alleviare la condizione.
Le ghiandole salivari sono ghiandole esocrine, che espellono le loro secrezioni in bocca attraverso i dotti escretori. L'incannulamento di questi dotti fornisce un accesso diretto alle ghiandole. La somministrazione retroduttale di un mezzo di contrasto alle ghiandole salivari maggiori è una procedura ambulatoriale di routine per la diagnostica per immagini. Utilizzando una procedura simile, è possibile un trattamento localizzato delle ghiandole. Tuttavia, l'esecuzione di questa tecnica in studi preclinici con piccoli animali pone sfide uniche. In questo studio descriviamo la tecnica di somministrazione retroduttale nelle ghiandole sottomandibolari di ratto, una procedura che è stata perfezionata nel laboratorio del Dr. Bruce Baum (NIH)1, e delineiamo una procedura per l'irradiazione locale delle ghiandole.
Introduzione
la distruzione collaterale dei tessuti sani rappresenta un certo numero di deleteri effetti collaterali dei trattamenti contro il cancro. Una parte o la totalità di ghiandole salivari maggiori che si trovano con i campi di radiazione sono inevitabilmente distrutti. Pertanto, la maggior parte dei pazienti sottoposti a radioterapia per cancro della testa e del collo, linfoma cervicale, o radiazioni su tutto il corpo prima del trapianto di midollo osseo subiscono uno degli effetti collaterali più comuni e persistenti delle radiazioni, delle ghiandole salivari ipofunzione 2-6.
Le cellule acinari fluido-produzione delle ghiandole salivari sono molto sensibile alle radiazioni. Danni alle ghiandole salivari provoca una drastica diminuzione del flusso salivare, una condizione di cui ipofunzione come salivare. La riduzione cronica del flusso salivare compromette attività chiave orali come la masticazione, deglutizione, della parola e il gusto, ma la sequele morbosa di intenso dolore, le lacrime delle mucose, disfagia, infezioni opportunistiche, e la carie dentale peggiora unpaziente di benessere e la funzione 2,3.
Dal momento che la perdita di cellule salivari radioterapia associata è irreversibile, non esiste alcun trattamento correttivo di xerostomia. Attuale trattamento che si concentra su assuaging sintomi con sostituti salivari artificiali e farmaci prosecretory è inefficace per il sollievo a lungo termine 6. Sebbene tecniche perfezionate di consegna radiazioni hanno contribuito diminuire la gravità della condizione, normale tossicità per i tessuti e le sue complicazioni rimangono un fattore limitante nel trattamento del cancro 6,7. misure preventive per prevenire le complicanze radioterapia associate sono, di conseguenza, diventando la norma. Agenti radio-protettiva che eliminano specie di ossigeno dei radicali liberi, ripopolamento cellulare adottiva, o migliorano la riparazione del DNA sono in fase di studio per evitare ipofunzione salivare 8-11.
Secrezioni delle ghiandole salivari esocrine scarico nella bocca attraverso le principali dotti escretori. incannulamento intraorale di The dotti escretori per l'iniezione di mezzi di contrasto è fatto di routine in regime ambulatoriale. Utilizzando un approccio simile, ghiandole salivari possono essere mirati direttamente per il trattamento localizzato 12. Oltre a ridurre il rischio di effetti collaterali sistemici, retroductal instillazione ghiandola ha aggiunto benefici. La disposizione monostrato di cellule salivari intorno all'albero duttale permette di mira di tutte le cellule epiteliali salivari, e l'incapsulamento fibroso degli atti ghiandola come una barriera per ridurre la diffusione terapeutico indesiderati. In sostanza, le ghiandole salivari sono perfettamente adatti per il trattamento mirato di afflizioni ghiandole come la radiazione indotta salivare ipofunzione.
radioterapia convenzionale per il trattamento del cancro è consegnato in piccole dosi (1,8-2,5 Gy / frazione / giorno, cinque giorni alla settimana) per un periodo di settimane. Pertanto, una terapia radio-protettiva che mostra efficacia contro uno schema radiazioni protratta in modelli sperimentali ha maggior cuscinetto clinica. comprofunzione salivare neralmente eseguita dopo la radiazione frazionato è stato registrato nei piccoli animali, ma sorgente di radiazione, frazione della dose, e protocolli utilizzati sono molteplici 9,10,13.
Questa relazione stabilisce i metodi per la consegna retroductal da e per la radiazione localizzata di ratto ghiandole sottomandibolari che utilizzano sorgenti di radiazioni sul paziente in questione e frazione della dose.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal LSU Salute, Shreveport, cura degli animali e del Comitato Usa ed erano in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Incannulazione di Rat sottomandibolare ghiandole salivari
- Preparazione della siringa-Tubing Assembly
- Tagliare una lunghezza di 10 cm di PE10 tubi in polietilene con un bisturi. Tenere entrambe le estremità del tubo tra il dito indice e il pollice. Riscaldare la sezione centrale del tubo sopra una fiamma dolce, e allungare delicatamente il tubo ammorbidito a raddoppiare la sua lunghezza tirando entrambe le parti.
- Tagliare il tubo nel mezzo con un bisturi ad un angolo di 45 o per ottenere 2 cannule - ciascuno con una estremità rastremata. Espandere l'estremità non rastremata della cannula mediante innesto su un ago 29 G di 0,5 cc Siringa.
- Rimuovere la cannula, e disegnare 220 ml di soluzione salina nella siringa. Toccare per rimuovere le bolle d'aria. Montare il Cannuleal di sopra l'ago, e spingere lo stantuffo della siringa per espellere l'aria e garantire un libero flusso di soluzione attraverso la cannula. Regolare il volume a 200 ml.
- Cannulazione intra-orale della ghiandola sottomandibolare Duct
NOTA: strumenti Autoclave prima della procedura, e sterilizzare in-tra le procedure in uno sterilizzatore a caldo tallone.- Pesare il ratto Sprague Dawley, e dispensare il volume calcolato di ketamina (42 mg / kg) / xilazina (8 mg / kg) / acepromazine (1,4 mg / kg) della miscela in una siringa ipodermica.
- Trattenere gli animali afferrando la base della coda tra il dito indice e il pollice di una mano, facendo scorrere l'altra mano sul corpo di afferrarlo. Appoggiare l'indice e il medio lungo i lati della testa, mentre tenere il busto con il pollice e altre dita.
- Iniettare l'anestetico della muscolatura degli arti posteriori. Confermare la profondità dell'anestesia per pizzico punta e riflesso palpebrale. Applicare lubrificante occhio per prevenire la secchezza mentreanimale è sotto anestesia.
- Posto l'animale su una piattaforma appositamente progettati (figura 1), e impegnare i denti incisivi superiori sulla barra trasversale. Tirare la mascella inferiore dal loop un elastico intorno incisivi inferiori e ancorandola alla piattaforma.
- Far passare una sutura sterile attraverso la lingua e sollevarlo per alzare il pavimento della bocca. Bloccare i punti di sutura con una pinza emostatica, e passarlo sopra la barra trasversale.
- Espandere le guance con una guancia spreader su misura (figura 1), e sotto un microscopio da dissezione individuare le papille sublinguale sul pavimento della bocca.
- Afferrare l'estremità rastremata del tubo PE10 preformato con un delicato pinza. manipolare delicatamente la punta della cannula nel foro duttale sul papille sublinguale. Confermare il posizionamento della cannula infilando il 3 - 5 mm nel condotto; assicurare che passa senza alcun ostacolo.
- Sottomandibolare Gland Instillation
- Iniettare atropina (0,5 mg / kg) per via sottocutanea nella collottola, e attendere 10 min per una riduzione delle secrezioni salivari.
- Fissare la cannula per l'orifizio del condotto con una goccia di cianoacrilato (colla), e lasciare asciugare. Instillare la soluzione nella ghiandola (200 pl / ghiandola) premendo lentamente lo stantuffo della siringa ad una velocità di ~ 50 microlitri / min.
- Schiacciare il tubo con una pinza emostatica, e rimuovere con attenzione la siringa. Conservare il tubo nel condotto per 30-60 minuti fino a quando l'animale riprenda coscienza. Rimuovere la sutura che mantiene la linguetta.
- Trasferire l'animale ad una gabbia separata, e utilizzare una lampada di calore per mantenerlo caldo durante il recupero. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza per mantenere prona sternale.
- Dopo che l'animale è completamente ambulatoriale, la casa è al vivaio con accesso illimitato al cibo e all'acqua.
2. localizzato frazionato irradiazionedi ghiandole sottomandibolari
- Trattenere l'animale come descritto in precedenza, e anestetizzare con la somministrazione intramuscolare di ketamina (33 mg / kg) / xilazina (6 mg / kg) / acepromazine (1 mg / kg) in miscela dell'arto posteriore. Confermare la profondità dell'anestesia, e applicare il lubrificante per gli occhi.
- Posizionare la supina animale sul tavolo acceleratore lineare, ed estendere il collo inclinando la testa. Collimare il campo di radiazione (3 cm di larghezza della fessura) per comprendere l'area dal bordo inferiore della mandibola all'inizio dello sterno.
- Inserire un bolo di tessuto-equivalente 1 cm quello della regione, e regolare la distanza tra la sorgente di radiazione e la parte superiore del bolo a 100 cm.
- Irradiare l'animale (2,5 Gy) utilizzando un MV fotoni di un acceleratore lineare 6. Dose rate, dimensioni del campo, e la distanza dalla sorgente di radiazione a bolo superficie detterà il tempo di esposizione. Nell'attuale configurazione, gli animali sono stati irradiati ad una dose di 1 Gy ~ / min.
- Ripetere l'esposizione; 2,5 Gy / giorno per un totale di 8giorni; 4 giorni / settimana con un intervallo di 2 giorni in mezzo. Tenere il caldo degli animali durante il recupero. Trasferire l'animale al vivaio dopo che è completamente ambulatoriale.
- Raccogliere stimolata sottomandibolare della ghiandola saliva 8 settimane dopo la radiazione per misurare la funzione della ghiandola 14. Eutanasia degli animali sotto anestesia da perfusione cardiaca del freddo paraformaldeide al 4% / tampone fosfato salino pH 7,2. Estirpare ghiandole sottomandibolari per istologica e immunoistochimica analisi 14.
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Risultati
Adattare una tecnica mini-invasiva scialografia, trattamento locale di ghiandole salivari maggiori è fattibile. Amministrazione Retroductal nel ratto ghiandole salivari sottomandibolari e ha tentato da incannulamento intra-orale dei condotti di Wharton (Figura 2). I condotti salivari di Wharton aperte sul papille sub-linguale situato al piano della bocca, ma gli orifizi non sono facilmente visibili. L'inserimento della cannula è stata, quindi, fatto da dolce sondaggi...
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Discussione
ghiandole salivari spesso ricevono dosi di radiazioni oltre la soglia di recupero dei tessuti in pazienti sottoposti a radioterapia per il cancro della testa del collo, l'ablazione elettiva di linfonodi del collo, o neoplasie ematologiche regionali. Anche se le cellule acinari liquido che secernono della ghiandola sono terminalmente differenziate, sono paradossalmente sensibili alle radiazioni. La funzione secretoria cade entro le prime settimane di radiazioni, e ne risultano danni irreversibili ghiandola in un usci...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. John Chang (Radiation Oncology, LSU Health Science Center) per l'assistenza nelle misurazioni della dose di radiazioni. Lo studio è stato supportato dall'American Cancer Society (numero di sovvenzione: 116945-RSG-09-038-01-CCE), dal National Institute of Health (numero di sovvenzione: R21CA173162) e dal Feist-Weiller Cancer Center.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo in polietilene Intramedic (PE10) | Becton Dickson | 427401 | |
| 1/2 cc Siringa da insulina U-100 | Becton Dickson | 309306 | |
| Lacrime artificiali | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Sterilizzatore a tallone caldo | Strumenti di scienza fine | 18000-45 | |
| Sutura di seta Perma-Hand | Ethicon | K833H | |
| Graefe forcipe | Strumenti di scienza | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Stereo microscopio | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Linear Accelerator | Elekta | ||
| Bolo - Senza pelle | Civco | MTCB410 | |
| Lampada Termica | Braintree Scientific | HL-1 110V |
Riferimenti
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