Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare mappe del destino e traccianti di lignaggio per indirizzare le iniezioni nei singoli blastomeri che danno origine al rene degli embrioni di Xenopus laevis.
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Articolo metodologico
Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il rene embrionale di Xenopus laevis (rana), le pronephros, costituito da un unico nefrone, e può essere usato come modello per malattie renali. Embrioni di Xenopus sono grandi, sviluppano esternamente, e possono essere facilmente manipolati da microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, le mappe destino sono stati stabiliti per i primi embrioni di Xenopus. microiniezione mirata nella blastomere individuo che alla fine darà origine a un organo o tessuto di interesse può essere usata per iperespressione selettivamente o abbattere l'espressione genica all'interno di questa regione ristretta, diminuendo gli effetti secondari nel resto dell'embrione in via di sviluppo. In questo protocollo, si descrive come utilizzare le mappe di Xenopus destino stabilito di indirizzare il sviluppo di Xenopus rene (i pronephros), tramite microiniezione in specifiche blastomeri di embrioni a 4 e 8 celle. Iniezione di traccianti lineage permette la verifica del targeting specifico dell'iniezione.Dopo gli embrioni si sono sviluppati a mettere in scena 38-40, tutto il montaggio immunostaining viene usato per visualizzare lo sviluppo pronephric, e il contributo da parte delle cellule mirati alle pronephros può essere valutata. La stessa tecnica può essere adattato per indirizzare altri tipi di tessuto oltre ai pronephros.
Introduzione
Il rene embrionale di Xenopus, i pronephros, è un buon modello per lo studio dello sviluppo dei reni e le malattie. Gli embrioni sviluppano esternamente, sono di grandi dimensioni, può essere prodotto in grandi quantità, e sono facilmente manipolati tramite microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, i geni che regolano lo sviluppo del rene nei mammiferi e anfibi sono conservati. Reni mammiferi progredire attraverso tre fasi: Pronefro, mesonefro e metanefro 1, mentre gli anfibi embrionali hanno un pronephros e anfibi adulti hanno una metanefro. L'unità di filtraggio di base di queste forme di rene è il nefrone, ed entrambi i mammiferi e g....
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Protocollo
Il seguente protocollo è stato approvato dalla University of Texas Health Science Center presso il Centro di Houston per animali da laboratorio Animal Medicine Comitato Welfare, che serve come cura e del Comitato Istituzionale Usa (protocollo #: HSC-AWC-13-135).
1. Identificazione e selezione dei blastomeri per iniezioni renali mirati
- Prima di generare embrioni, utilizzare la tabella Normale di Xenopus Sviluppo 21 per capire l'orientamento delle divisioni cellulari primi nell'embrione. In alternativa, gli schemi di accesso dei primi stadi di sviluppo di Xenopus su Xenbase 11.
- Accedere alle m....
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Risultati
Microiniezioni di 4 e 8-cell embrioni di Xenopus con MEM-RFP mRNA mostrano diversi livelli di targeting ai pronephros. Figura 4 spettacoli 40 embrioni con MEM-RFP pattern di espressione di mRNA corretti. Gli embrioni sono stati iniettati nel blastomere ventrale sinistro (Figura 4A), e ordinati per il corretto pattern di espressione di MEM-RFP mRNA. Oltre ad esprimere MEM-RFP nel prossimale, intermedio, distale e collegando tubuli del rene, embri.......
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Discussione
Targeting le pronephros di sviluppo di embrioni di Xenopus si basa sull'identificazione e iniettare la blastomeri corretta. L'iniezione del blastomero V2 di embrioni 8 celle obiettivi dei pronephros sinistra 18. Questo lascia i pronephros controlaterale destra come un controllo interno. Se morpholino knockdown o RNA sovraespressione è usato per alterare lo sviluppo del rene, i pronephros controlaterale destra possono essere utilizzati per confrontare gli effetti di knockdown gene o sovraespre.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un National Institutes of Health NIDDK concessione (K01DK092320) e il finanziamento di avvio del Dipartimento di Pediatria presso l'Università del Texas Medical School McGovern.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | Fisher | S271-3 | |
| Cloruro di potassio | Fisher | P217-500 | |
| Solfato di magnesio | Fisher | M63-500 | |
| Cloruro di calcio | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Soluzione di gentamicina, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cisteina, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| Piastra Petri 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Incubatrice da banco per embrioni. |
| Gap43-RFP | Per la produzione di RNA tracciante. Rif: Davidson et al., 2006. | ||
| Destrano di rodamina, 10.000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Grado di biologia molecolare, acqua purificata sterile USP | Corning | 46-000-CI | |
| Provette di ricambio Drummond da 7 | Aghi per microiniezione | Drummond | 3-000-203-G/XL |
| Estrattore per aghi | Sutter Instruments | P-30 | |
| Pinza fine | Dumont | 11252-30 | Per rompere la punta dell'ago per microiniezione. |
| Microiniettore | Nanoject II | Drummond | 3-000-204 |
| Olio minerale, pesante | Fisher | CAS 8042-47-5 | Olio per aghi. |
| 27 G Ago ipodermico monogetto | Covidien | Per caricare l'olio minerale nell'ago per microiniezione. | |
| Siringa Luer-Lok da 5 ml | BD | 309646 | Per caricare l'olio minerale nell'ago per microiniezione. |
| Piastra di Petri da 60 mm x 15 mm | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Rete in poliestere | Piccole parti | CMY-0800-C | |
| Pipette di trasferimento | Fisher | 13-711-7M | Per il trasferimento di embrioni. Tagliare la punta in modo che gli embrioni vengano facilmente assorbiti dalla pipetta. |
| Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldeide | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Fiala con filettatura a vite | Fisher | 03-339-25B | Per il fissaggio, la colorazione e la conservazione degli embrioni. |
| Piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Etanolo | Fisher | BP2818-4 | |
| Metanolo | Fisher | A412-4 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x polvere | Fisher | BP661-50 | |
| Albume sierico bovino | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, modello 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Siero di capra, origine neozelandese | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodio azide | Fisher | S227I-25 | |
| Anticorpo monoclonale 3G8 | European Xenopus Resource Centre | Anticorpo primario da marcare prossimale Tubuli. | |
| Anticorpo monoclonale 4A6 | Xenopus Resource Centre | Anticorpo primario per marcare tubuli intermedi, distali e di collegamento. | |
| anticorpi anticorpi anti-RFP, IgG/MBL | PM005 | per marcare il tracciante Gap43-RFP. | |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG | Life Technologies | A11001 | Anticorpo secondario per marcare i tubuli renali. |
| Alexa Fluor 555 capra anti-coniglio IgG | Life Technologies | A21428 | Anticorpo secondario per marcare il tracciante Gap43-RFP. |
| Piastra spot a 9 cavità | Corning | 7220-85 | |
| Benzil benzoato | Fisher | 105862500 | Opzionale - per la pulizia degli embrioni |
| Alcool benzilico | Fisher | A396-500 | Opzionale - per la pulizia degli embrioni |
Riferimenti
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W.
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Ristampe e permessi
