Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

Summary

Forniamo un metodo di base riproducibile per la microscopia a lungo termine del ciclo di vita sessuale del lievito di fissione. Con i piccoli aggiustamenti descritti, il protocollo presentato consente di concentrare la ricerca su diverse fasi del processo riproduttivo.

Abstract

Il lievito di fissione Schizosaccharomyces pombe è stato un sistema modello inestimabile nello studio della regolazione della progressione del ciclo cellulare mitotico, della meccanica della divisione cellulare e della polarità cellulare. Inoltre, gli esperimenti classici sulla sua riproduzione sessuale hanno prodotto risultati fondamentali per l'attuale comprensione della ricombinazione del DNA e della meiosi. Analisi più recenti dell'accoppiamento con lievito di fissione hanno sollevato interessanti domande sui meccanismi di risposta agli stimoli estrinseci, sulla crescita cellulare polarizzata e sulla fusione cellula-cellula. Per studiare questi argomenti in dettaglio abbiamo sviluppato un semplice protocollo per la microscopia dell'intero ciclo di vita sessuale. Il metodo qui descritto è facilmente adattabile per studiare specifiche fasi di accoppiamento. In breve, dopo essere state coltivate in fase esponenziale in un terreno ricco di azoto, le colture cellulari vengono spostate in un terreno privo di azoto per periodi di tempo adatti allo stadio del ciclo di vita sessuale che verrà esplorato. Le cellule vengono quindi montate su camere di agarosio personalizzate e facilmente costruibili per l'imaging. Questo approccio consente di monitorare le cellule dall'inizio dell'accoppiamento fino alla formazione finale delle spore.

Introduction

Anche se lo scambio genetico tra due cellule è l'evento centrale nella riproduzione sessuale, si basa su una catena di eventi che promuovono la differenziazione cellulare, permettono di scelta del partner, svolgono la fusione cellula-cellula e mantenere la stabilità genomica. Così il ciclo di vita sessuale si presenta come un sistema modello per studiare una serie di questioni biologiche riguardanti gli interruttori di sviluppo, risposta a stimoli estrinseci, fusione della membrana plasmatica, la segregazione dei cromosomi, ecc Esplorando il lievito di fissione ciclo sessuale di studiare questi fenomeni porta i vantaggi della genetica potenti del sistema....

Protocol

Analisi al microscopio di lievito di fissione riproduzione sessuale

1. Carta Preparazione

1. Preparare terreno minimo sporulazione (MSL-N) ¹⁵ mescolando i seguenti componenti: Glucosio: 10 g / L, KH ₂ PO _4: 1 g / L, NaCl 0,1 g / L, MgSO ₄ · 7H ₂ O: 0,2 g / L. Aggiungere Oligoelementi (10.000X): 100 l / L, vitamine (1,000x): 1 ml / L, e 0,1 M CaCl ₂   ml / L. Filtro-sterilizzare utilizzando un formato di filtro 0,22 micron pori e conservare a temperatura ambiente (RT).
   1. Utilizza il seguente Vitamine (1,000x) stock: pantotenato: 1 g / L, acido nicotinico: 10 g / L, inos....

Results

Lievito di fissione la crescita e l'accoppiamento Dynamics dopo la rimozione di una fonte di azoto
Come fame di azoto è un prerequisito per l'inizio della riproduzione sessuale in lievito di fissione, il ceppo selvatico homothallic H90 è stato monitorato su passaggio da medio di azoto-privato ricco di azoto (figura 2), seguendo il protocollo descritto nella Figura 1. In breve, le cellule sono state coltivate O / N a fase esponenziale (OD

Discussion

Condizioni ambientali, e la disponibilità di nutrienti, in particolare, influenzano pesantemente la fisiologia fissione lievito. L'azoto fame è necessario per l'impegno per la riproduzione sessuale e porta a notevoli cambiamenti nella progressione del ciclo cellulare mitotico (Rif. ²¹ e Figura 2) inizialmente. Alla rimozione azoto popolazione in crescita esponenziale, dimensione delle celle a divisione diminuisce rapidamente (Figura 2C) e la maggior parte delle cellul.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	Sigma-Aldrich	71381
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Pantotenato	AppliChem	A2088,0025
Acido nicotinico	AppliChem	A0963,0100
Inositolo	AppliChem	A1716,0100
Biotina	AppliChem	A0967,0250
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	AppliChem	A1038,0250
ZnSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750
FeCl2• 6H2O	AppliChem	A3514,0250
Ossido di molibdeno (VI) (MoO3)	Sigma-Aldrich	69850
KI	AppliChem	A3872,0100
CuSO4• 5H2O	AppliChem	A1034,0500
Acido citrico	AppliChem	A2344,0500
Agarosio	Promega	V3125
(NH4)2SO4	Merck	1.01217.1000
L-Leucina	Sigma-Aldrich	L8000-100G
Adenina Emisolgrasso Sal, mini 99%	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Uracile	Sigma-Aldrich	U0750
Lanolina	Sigma-Aldrich	L7387
Vaselina	Reactolab	92045-74-4
Paraffina	Reactolab	7005600