Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Summary

Qui, presentiamo protocolli per selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio di rilascio del colorante utilizzano substrati batterici target per la valutazione qualitativa e quantitativa dell'attività enzimatica.

Abstract

Le valutazioni iniziali di grandi librerie microbiche per potenziali produttori di nuove proteine antimicrobiche richiedono metodi sia qualitativi che quantitativi per lo screening degli enzimi bersaglio prima di investire maggiori sforzi e risorse per la ricerca. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare due saggi complementari per condurre queste valutazioni iniziali. Il saggio di diffusione su microvetrini fornisce una schermata di rilevamento iniziale o semplice per consentire la valutazione qualitativa e rapida dell'attività proteolitica rispetto a una serie di substrati bersaglio batterici sia vitali che uccisi termicamente. Come controparte, l'aumento della sensibilità e della riproducibilità del test di rilascio del colorante fornisce una piattaforma quantitativa per valutare e confrontare le influenze ambientali che influenzano l'attività idrolitica degli antimicrobici proteici. La capacità di marcare specifici substrati di colture cellulari uccise a caldo con il colorante Remazol brilliant blue R amplia questa capacità di personalizzare il saggio di rilascio del colorante per caratterizzare l'attività enzimatica di interesse.

Introduction

Gli agenti antimicrobici svolgono un ruolo essenziale nel colpire un'ampia gamma di microrganismi come virus, funghi e batteri. Le attività antimicrobiche prodotte da vari batteri variano in specificità del bersaglio da ad ampio spettro a specie-specifiche, compresi i patogeni batterici clinicamente rilevanti ¹. In natura, i composti antimicrobici proteici come le batteriocine e le lisine rappresentano un arsenale microbico di strumenti per l'autodifesa, la replicazione e l'acquisizione di nutrienti ^2,3. Fungendo da mediatori delle dinamiche di popolazione all'interno delle comunità microbiche, gli antimicrobici proteici forniscono un vantaggio competitivo all'organismo produttore rispetto alle specie sensibili e non produttrici ⁴. In quanto enzimi ricombinanti e probiotici, queste proteine hanno anche un'importanza economica e sociale, poiché la necessità di nuove fonti di controllo dei patogeni aumenta con ogni nuova espansione della resistenza antimicrobica all'interno della popolazione batterica ⁵.

Le prime valutazioni degli antimicrobici proteici appena scoperti includono la determinazione delle caratteristiche fisiche di base inerenti all'enzima. I metodi per lo screening rapido di potenziali antimicrobici consentono la selezione di candidati con attività idrolitica rispetto ai substrati target desiderati. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio quantitativo di rilascio di colorante consentono l'uso di una varietà di substrati nella rilevazione dell'idrolisi enzimatica. Per gli enzimi antimicrobici proteici con attività contro la parete cellulare batterica, la versatilità di questi saggi consente uno screening rapido ed efficace, qualitativo e quantitativo, contro cellule batteriche vitali (solo saggio su microvetrino), substrati di cellule batteriche intere uccise termicamente o peptidoglicano purificato dal batterio bersaglio. Questi saggi sono utili nella scoperta di enzimi antimicrobici per l'uso in campi come terapie alternative, integratori alimentari e inibitori della produzione di biofilm.

Il saggio di diffusione su microvetrini e il test di rilascio del colorante sono metodi dimostrati per il rilevamento e la caratterizzazione di nuovi antimicrobici proteici. Il test di diffusione su microvetrini fornisce una stima relativa (qualitativa) dell'attività antimicrobica e consente un'inferenza minima della concentrazione e dell'attività dell'enzima. Utilizzando questo metodo, l'attività è facilmente visualizzata come lo sviluppo di una zona di lisi con l'assenza di attività che comporta una mancata formazione di zone. La velocità di sviluppo della zona e il diametro della zona sono indicativi della quantità e della purezza dell'enzima presente nel campione; Tuttavia, questo tasso e la qualità della pulizia del substrato all'interno della zona possono anche essere influenzati dalla presenza di contaminanti, dalla completezza della reazione di idrolisi e dal tipo di substrato. I contaminanti interferenti possono influenzare la velocità di diffusione degli enzimi dal pozzo, mentre l'idrolisi incompleta o la variazione del tipo di substrato possono provocare una zona torbida di lisi ⁶.

Il saggio di rilascio del colorante valuta quantitativamente la quantità di prodotti coloranti Remazol blu brillante R legati covalentemente rilasciati nel surnatante di reazione dal substrato idrolizzato enzimaticamente. Il metodo presenta solo una leggera variabilità associata a una differenza nel substrato, consentendo così una maggiore sensibilità per il rilevamento dell'idrolisi rispetto al saggio di diffusione su microvetrino. Queste proprietà consentono al metodo di avere utilità nella caratterizzazione delle proprietà biochimiche dell'enzima e nella standardizzazione del saggio per il confronto tra diversi enzimi antimicrobici.

In questo protocollo, forniamo metodi per eseguire il saggio di diffusione di microvetrini di base e il saggio di rilascio del colorante, dimostrando al contempo la scala dei limiti di rilevamento e la variabilità per ciascuno. I saggi vengono utilizzati per eseguire valutazioni di base di una proteina antimicrobica sconosciuta purificata dal surnatante di coltura di un isolato batterico del suolo non caratterizzato. Le attività osservate contro i substrati cellulari batterici all'interno dei saggi consentono di confrontare le attività di reazione tra una proteina antimicrobica precedentemente non caratterizzata e la α-chimotripsina, un enzima proteolitico di controllo. Questi protocolli forniscono una base per l'applicazione delle due tecniche che possono essere ampliate e modificate per adattarsi a varie applicazioni.

Protocol

1. Preparazione di batteriche e peptidoglicano substrati

Nota: substrati batteriche tutta la cella e peptidoglicani purificate sono utilizzati come substrati enzimatici sia il test di diffusione MicroSlide e il saggio di tintura-release. Questi substrati richiedono una preparazione prima di effettuare le reazioni enzimatiche. Il protocollo che segue descrive la loro preparazione.

1. Tutto il substrato cellula batterica
   1. Produrre substrato cellula batterica inoculando 500 ml di brodo nutritivo con una cultura durante la notte 2 ml di Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubare a 30 ° C con agitazione (125 rpm) fino alla coltura raggiunga una fase di crescita esponenziale, definita come una fase di crescita rapida conseguente raddoppio della coltura batterica. Per la coltivazione di Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), usare brodo nutriente come mezzo di crescita a 37 ° C con agitazione (125 rpm).
   2. Calore-kill ciascuna coltura in autoclave per 10 minuti a 121 ° C sotto 3 atm di pressione.
   3. Raccogliere il substrato batterica ucciso al calore per centrifugazione per 20 minuti a 5000 x g. Lavare il pellet tre volte con acqua di tipo 1 e risospendere in una quantità minima di acqua. In questo studio, sospendere i substrati in 1.200 ml.
   4. Aliquota 300 ml di substrati cellulari batteriche provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a 20 ° C.
2. Purificata substrato peptidoglicano
   1. Purificare peptidoglicano dal substrato bersaglio batterio ^7-10 o acquistare da un fornitore (vedi Materiali e attrezzature Tabella). Purificare preparati peptidoglicano grezzi da polimeri della parete cellulare accessori.

2. qualitativa MicroSlide Diffusion Assay [Modificato da Lachica, et al. ^11]

Nota: Il saggio MicroSlide diffusione èun metodo qualitativo per rilevare la presenza di enzima antimicrobico in un campione. Poiché l'enzima diffonde attraverso un substrato matrice contenente agarosio, una zona di compensazione sviluppa come l'enzima idrolizza il substrato. Il protocollo che segue descrive la preparazione e le prestazioni del test MicroSlide diffusione per rilevare qualitativamente la presenza di antimicrobici proteine.

1. Determinare la concentrazione dell'enzima antimicrobica essere valutato utilizzando un kit di acido bicinconinico (BCA) Protein Assay secondo il protocollo del produttore.
2. Utilizzare tampone fosfato salino (PBS) come un buffer enzimatica; tuttavia, determinare empiricamente la appropriata buffer per l'enzima data.
3. Eseguire una diluizione seriale dell'enzima antimicrobica utilizzando tampone fosfato salino (PBS) come tampone di reazione. La diluizione in serie utilizzata in questi test di diffusione MicroSlide prodotto finale masse proteiche dosaggio di 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 mg e 10 mg per volume di reazione.
4. Erogare masse proteine ​​in tubi microcentrifuga individuali e regolare i volumi di proteine ​​al 20 microlitri utilizzando PBS in preparazione per l'aggiunta di MicroSlide pozzetti di reazione.
5. Fare una soluzione di agarosio 0,5% sciogliendo 0,25 g di agarosio in 50 ml di PBS. Riscaldare la soluzione a ebollizione fino l'agarosio è completamente sciolto. Determinare l'acqua persa durante il processo di fusione in peso e aggiungere di nuovo alla soluzione.
6. Aggiungere 50 ml di sodio azide 10% in acqua alla soluzione di agarosio e regolare la temperatura della soluzione a 50 ° C in un bagno d'acqua. L'azide di sodio viene aggiunto per inibire la crescita batterica contaminanti durante l'incubazione del test MicroSlide diffusione. Se le cellule vitali sono utilizzati come substrato, omettere l'azide di sodio dalla soluzione di agarosio.
7. Scongelare il substrato batterico ucciso al calore sul ghiaccio.
8. Risospendere il substrato batterica in 12 ml della soluzione di agarosio a circa abbinare la torbidità di un McF 2.0Arland equivalenza standard (vedi Materiali Tavolo). Confronti le torbidità delle soluzioni visualizzando una linea nera su uno sfondo bianco attraverso le soluzioni, aggiungendo substrato batterico per l'agarosio fino a raggiungere la torbidità approssimativa.
9. Pipettare Subito 3 ml della soluzione di agarosio-substrato a ogni MicroSlide (25 x 75 x 1 mm ^3).
10. Dopo diapositive solidificano, punch tre pozzi nello strato di agarosio-substrato di ogni MicroSlide utilizzando una sonda di carotaggio (4,8 mm di diametro). Aggiungere 20 ml di ogni diluizione in serie proteina regolata ai rispettivi pozzetti.
11. Utilizzare PBS (20 ml) o albumina sierica bovina (5 mg in 20 ml PBS) in un controllo negativo. Utilizzare noti enzimi bacteriolytic appropriate per il substrato, come il lisozima, come controllo positivo.
12. Incubare il vetrino in una camera umida a 37 ° C o la temperatura attività ottimale dell'enzima. La durata dell'incubazione dipende dalla concentrazione eattività specifica dell'enzima antimicrobica. Un tempo di reazione tipica è la notte (circa 16 ore).
13. Dopo l'incubazione, osservare le diapositive sotto le immagini di luce e di acquisizione indiretta del saggio di sviluppo utilizzando una fotocamera digitale reflex con un obiettivo 60 mm alla distanza focale di circa 30 cm.
    Nota: L'attività enzimatica della proteina antimicrobica per il substrato proposta è correlata con lo sviluppo di un alone di idrolisi, che si forma attorno al nonché l'enzima diffonde nel agarosio.
14. Per qualificare l'attività enzimatica, osservare le dimensioni delle zone che si formano intorno ad ogni bene. Alta attività enzimatica riferisce qualitativamente ad una zona più ampia, mentre la bassa attività enzimatica riferisce qualitativamente ad una zona più piccola.

3. substrato Labeling - Remazol Brilliant Blue R Dye Etichettatura [Modificato da Zhou ^12]

Nota: Nel saggio dye-release, il substrato è covalente linked per Remazol brillante colorante R blu. Il protocollo che segue descrive la preparazione di substrati enzimatici tinti.

1. Fare una soluzione di 250 mm di idrossido di sodio (NaOH) sciogliendo 1 g di NaOH in 99 ml di acqua di tipo I da utilizzare per rendere la soluzione a 200 mm Remazol brillante R colorante blu (RBB).
2. Fare una soluzione 200 mM RBB sciogliendo 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml di una soluzione 250 mM NaOH fresco (passo 3.1).
3. Risospendere le cellule batteriche calore ucciso ad una concentrazione di 0,5 g di peso umido in 30 ml di soluzione RBB. Per peptidoglicano purificato, risospendere il peptidoglicano ad una concentrazione di 0,3 g di peso umido in 30 ml di soluzione di RBB.
4. Incubare la miscela di reazione in una beuta su una piattaforma rotante per 6 ore a 37 ° C con miscelazione delicata.
5. Trasferire la miscela di reazione in un incubatore a 4 °, e incubare per altri 12 hr con miscelazione delicata.
6. Dopo l'incubazione, raccogliere il substrato tinto per centrifugazione a 3.000 xgper 30 min. Decantare la soluzione colorante dal pellet substrato.
7. Rimuovere colorante solubile non covalente legato dai substrati lavando le cellule colorante marcato o peptidoglycan ripetutamente (circa 3-5 lavaggi) con acqua di tipo I seguita da centrifugazione. Con ogni aggiunta di acqua, risospendere accuratamente il pellet.
   Nota: Quando non legato tintura, solubile non è più visibile nel lavaggio con acqua dopo la centrifugazione. Il substrato dovrebbe essere dato un lavaggio supplementare. Si noti che il substrato rimarrà blu, mentre il surnatante della ultimo lavaggio sarà chiaro.
8. Memorizzare i substrati tinti sospese in una quantità minima di acqua a -20 ° C per un uso successivo.

4. Quantitative Dye-release Assay

Nota: Durante il test di colorante-release, l'idrolisi del substrato RBB-tinto nelle versioni di reazione enzimatiche prodotti tinti nel surnatante reazione. misura colorimetrica della quantità di colorante rilasciato indica l'amount dell'attività enzimatica presente nel campione per un dato enzima. Il metodo quantitativo permette il confronto delle differenti enzimi attraverso substrati e permette la variazione delle condizioni ambientali influenzano la reazione enzimatica (ad esempio, temperatura, salinità e pH). Il protocollo che segue descrive la preparazione e le prestazioni del dosaggio dye-release per rilevare quantitativamente l'attività enzimatica della proteina antimicrobici.

1. Preparazione per il saggio Dye-release
   1. Lasciare il substrato tinto congelati per tornare a temperatura ambiente e lavata due volte con tampone (PBS), che è empiricamente determinata per l'enzima data.
   2. Calcolare il volume di sospensione substrato che è necessario moltiplicando il volume di reazione 200 microlitri per il numero di saggi dye a rilascio da eseguire.
   3. Preparare la sospensione substrato aggiungendo substrato tinto al volume di tampone, determinata 4.1.2, fino ad una densità ottica (OD) di 2,0 si ottiene a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro. Per rimanere entro i limiti funzionali dello spettrofotometro, misurare il 2,0 OD ₅₉₅ come 1.0 a 1: 1 diluizione della soluzione concentrata. Utilizzare tampone come bianco.
      Nota: La torbidità substrato per la reazione può essere sollevato oltre 2.0 per abbinare i livelli di attività di enzimi altamente efficienti.
   4. Sospendere il antimicrobico proteine ​​da valutare in tampone ad una concentrazione stimata di 1 mg / ml.
   5. Utilizzando il test micropiastra di un kit di analisi BCA Protein secondo il protocollo del produttore, determinare la concentrazione effettiva del campione di proteine ​​deve essere analizzato. Regolare la concentrazione della sospensione di 1 mg / ml utilizzando tampone.
2. Usando il saggio Dye-release per determinare l'incubazione condizioni ottimali per una proteina antimicrobica
   1. Diluire il brodo di proteine ​​sospensione antimicrobico a 100 ng / ml. Questa concentrazione dà afmassa di reazione inale di 1 mg di proteina per volume (10 microlitri) aggiunto alla reazione dosaggio.
   2. Determinare il campo termico da valutare per la proteina bacteriolytic. La gamma termica in questi saggi inclusa 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C e 65 ° C.
   3. Eseguire i test di reazione in 0,5 ml tubi microcentrifuga. Per ogni condizione termica, aggiungere 10 ml di proteine ​​stock da 200 ml di sospensione substrato preparato.
   4. Incubare in un termociclatore per 8 ore con miscelazione per inversione una volta ogni ora.
   5. Dopo l'incubazione, arrestare le reazioni aggiungendo 25 ml di etanolo.
   6. Rimuovere digerito, substrato insolubile per centrifugazione a 3.000 xg per 2 minuti, e trasferire 150 ml di surnatante di reazione per ciascuna miscela di reazione ad una micropiastra a 96 pozzetti a fondo piatto, facendo attenzione a non disturbare il pellet di substrato non digerito.
   7. Misurare l'attività enzimatica della proteina AntimicrobIAL per il substrato proposta determinando la quantità di colorante solubile RBB dissociato dal substrato dopo idrolisi enzimatica. Per quantificare l'attività enzimatica, misurare l'assorbanza del surnatante a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Aumento assorbanza dal colorante solubile rilasciata nel surnatante dal substrato marcato è una misura quantitativa dell'attività enzimatica.
      Nota: Le variazioni di assorbanza è rappresentato da unità di attività (AU), dove 1 AU determina un aumento del 0,01 della densità ottica del surnatante reazione colorante release a 595 nm. Una reazione vuoto, incubate con tutti i componenti della reazione ad eccezione di enzima, viene utilizzato per sottrarre il colorante che libera dal substrato RBB-classificazione in base al incubazione. La temperatura ottimale enzimatica fornisce la misura unità picco di attività.
   8. Ripetere i passaggi 4.2.1 tramite 4.2.7 utilizzando vari buffer di incubazione, per determinare le condizioni di buffer ottimali per l'enzima antimicrobica. in tsaggi hese, usano PBS.
3. Usando il saggio Dye-release per determinare la concentrazione minima attivo alla temperatura ottimale di incubazione per una proteina antimicrobica
   1. Eseguire una diluizione seriale del magazzino sospensione proteina antimicrobica tramite tampone. La gamma serie di diluizioni varierà con l'attività dell'enzima antimicrobica. La diluizione d'ordine utilizzati per questi test ha prodotto finale quantità di proteine ​​dosaggio di 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 mg e 10 mg.
   2. Eseguire ogni saggio di reazione in una micropiastra fondo 48-ben piatta. Per ciascuna condizione dosaggio, aggiungere 10 ml di sospensione rispettiva proteina per 200 ml di sospensione substrato preparato. Regolare qualsiasi variazione di volume della soluzione proteica aggiunto alla reazione di 10 microlitri utilizzando tampone di reazione.
   3. Sigillare la micropiastra con la pellicola piastra saldante per evitare variazioni di volume a causa dell'evaporazione. Incubare in un incubatore shaker a ottimale determinatotemperatura cubation per la data proteina antimicrobica per 16 ore con agitazione.
   4. Dopo l'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 25 ml di etanolo a ciascun pozzetto e rimuovere substrato digerito mediante centrifugazione a 3000 xg per 2 min.
   5. Trasferire 150 ml di surnatante di reazione per ciascuna miscela di reazione ad una micropiastra a 96 pozzetti a fondo piatto, facendo attenzione a non disturbare il pellet del substrato non digerito.
   6. Per quantificare l'attività enzimatica, misurare l'assorbanza del surnatante a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Una reazione vuoto, incubate con tutti i componenti della reazione ad eccezione di enzima, viene utilizzato per sottrarre il colorante che libera dal substrato RBB-classificazione in base al incubazione. Aumento assorbanza dal colorante solubile rilasciata nel surnatante dal substrato marcato fornisce una misura quantitativa di attività enzimatica.
      Nota: La variazione di assorbanza è rappresentato da unità di attività (AU), dove 1 AU risultati in0,01 aumento della densità ottica del surnatante reazione colorante release a 595 nm.

Results

Il saggio MicroSlide diffusione e la tintura test-rilascio quantitativa sono metodi efficaci per lo screening e misurare le indagini iniziali di nuovi antimicrobici proteine. Ogni test ha vantaggi e limitazioni; Tuttavia, quando eseguito in combinazione, consentono un rapido screening iniziale e caratterizzazione di base di un antimicrobico.

Il test di diffusione MicroSlide permette in modo efficiente per lo screening rapido di librerie microbiche, la produzione di proteine ​​antimicrobici. Quando i livelli di concentrazione enzimatica sono di preoccupazione, sensibilità di rilevamento vincoli possono limitare il dosaggio, che richiede una maggiore quantità di enzima da aggiungere alla reazione ben più saggio dye-release. Come illustrato in figura 1, le proprietà qualitative del saggio permettono all'osservatore di confrontare importi enzimatici relativi presenti in ogni pozzetto.

Figura 1A (25 mg di enzima), il bordo anteriore della zona visualizza lisi torbida o incompleta del substrato, mentre la zona più vicina al pozzo visualizza una lisi substrato più completa. Questo fenomeno, un prodotto della concentrazione diminuzione dell'enzima diffusione all'avanguardia, complica la misurazione accurata del diametro della zona. Come i pozzetti vengono osservati in Figura 1 B (15 mg), C (10 mg), D (5 mg), E (1,0 mg), e F (0,1 mg), il diametro della zona di completo lisi dissipa all'estinzione correlando alla ridotta quantità di enzima. Per la condizione F (0,1 mg), la concentrazione dell'enzima all'interno agarosio è inferiore al limite che permetterà l'enzima diffondente da visualizzare come si muove attraverso l'agarosio, idrolisi del substrato. Il saggio MicroSlide diffusione è stato eseguito utilizzando anche purificati Bacillus subtilis Peptidoglycan come substrato (Figura 2). Mentre la zona è meno definito rispetto a quelli osservati con cellule intere Salmonella enterica causa della riluttanza dei peptidoglicano sospendere uniformemente in agarosio, l'idrolisi del peptidoglicano dall'enzima antimicrobica ignoto è evidente.

Il saggio dye release è un test più sensibile e versatile del dosaggio MicroSlide diffusione, consentendo un limite di sensibilità e variazione di fattori ambientali influenzano la reazione enzimatica. Nei saggi rappresentativi, la temperatura è stata variata per determinare la temperatura ottimale per l'enzima antimicrobica, determinata essere 35 ° C in PBS (Figura 3). Questo ottimale si vede chiaramente nelle surnatanti di reazione come una maggiore quantità di colore blu (Figura 3B), così come rappresentato in unità di attività conseguenti a misurazioni di assorbanza a 595 nm (Figura 3A). Ilversatilità del dosaggio dye-release consente al ricercatore di variare non solo le temperature ma anche il tampone di reazione e componenti tampone per determinare rapidamente condizioni di incubazione ottimali per un dato enzima.

Il livello di attività dell'enzima sconosciuta antimicrobica (Figura 4) e l'enzima comando α-chimotripsina (Figura 5) sono stati misurati alla temperatura di incubazione ottimale determinato di 35 ° C in PBS contro substrato ucciso al calore Bacillus subtilis RBB-marcato. Il confronto dei risultati di figura 4 e figura 5 indica che l'enzima antimicrobica sconosciuta ha quasi due volte l'affinità per l'B. subtilis substrato. Inoltre, il controllo α-chimotripsina non digerire completamente i ucciso al calore B. subtilis substrato all'interno del pozzo (dati non mostrati). L'attività del controllo di α-chimotripsina comincia a piastraau circa 0,3 mg rispetto al continuo aumento in unità di attività di tutti gli importi enzimi per l'enzima antimicrobica sconosciuta (figura 4 e figura 5). Questo potrebbe indicare che l'enzima sconosciuto ha una maggiore attività sostenuta o che ci sono un numero maggiore di siti di taglio disponibili all'enzima all'interno B. subtilis substrato.

Figura 1:. Enzyme attività contro Salmonella enterica cellula intera substrato Il saggio MicroSlide diffusione è stato utilizzato per valutare qualitativamente l'attività di una proteina antimicrobica sconosciuto contro il calore ucciso Salmonella enterica subsp enterica (ATCC 10708).. Le masse proteici del antimicrobica sconosciuta sospesa in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) che sono stati aggiunti ai rispettivi pozzettigli scivoli inclusi 25 mcg (beh A), 15 mg (bene B), 10 mcg (bene C), 5 mg (beh D), 1 mg (beh E), e 0,1 mg (ben F). solo PBS è stato utilizzato per i controlli negativi dei saggi. Zone di lisi sono stati ripresi dopo una incubazione 6 ore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. Enzyme attività contro Bacillus subtilis cellulare peptidoglicano parete Il saggio MicroSlide diffusione è stato utilizzato per valutare qualitativamente l'attività di una proteina antimicrobica sconosciuto contro peptidoglycan di Bacillus subtilis 168. Sospeso in 20 ml di PBS, 10 ug del antimicrobica sconosciuta è stato aggiunto al pozzetto A delle microslides. solo PBS è stato usato come negativocontrollo per il saggio (bene B). La zona di lisi è stato ripreso dopo una incubazione di 6 ore a 37 ° C. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Ottimale Reazione temperatura per una proteina antimicrobica La versatilità del dosaggio dye-release consente la variazione di parametri fisici e chimici, quali temperature di incubazione e tamponi, per determinare le loro influenze sull'attività dell'enzima di interesse ^6. Come illustrato in questa figura, l'attività della proteina antimicrobica sconosciuta (1 mg) è stata valutata in PBS contro RBB-etichettati Bacillus subtilis calore ucciso sotto una gamma di temperature di incubazione. Visualizzato come unità di attività (AU) in (A), l'assorbanza di RBB-bound prodotti rilasciati nel surnatante dopo idrolisi è stata misurata a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Ad ogni condizione di temperatura, reazioni senza enzima aggiunto stati usati per sottrarre gli effetti di qualsiasi colorante rilasciato che il risultato di incubazione a varie temperature. I surnatanti di reazione corrispondenti ad ogni temperatura di incubazione sono stati ripresi prima della misura di assorbanza (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Intervallo attività per una proteina antimicrobica La gamma di attività per il antimicrobica proteina sconosciuta è stata misurata come unità di attività dopo incubazione overnight per 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 e 1.000 ng , come misurato dal prot BCAassay ein (A). Per queste reazioni, il RBB marcato B. livello del substrato subtilis è stato portato a dare una densità ottica di 5,0 a 595 nm per garantire che la reazione con la più alta quantità di enzima (1.000 ng) non idrolizza completamente tutta substrato disponibile entro il periodo di incubazione di reazione. Le reazioni di controllo senza enzima aggiunto stati usati per sottrarre gli effetti di qualsiasi colorante rilasciato causata dalla sola incubazione. I surnatanti di reazione corrispondenti ad ogni quantità dell'enzima sono stati ripresi prima misure di assorbanza (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. Gamma di attività per la α-chimotripsina La gamma di attività per la α-chimotripsina è stata misurata come activunità lità dopo incubazione overnight per 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 e 1.000 ng di enzima (A). Per queste reazioni, il RBB marcato B. livello del substrato subtilis è stato portato a dare una densità ottica di 5,0 a 595 nm per garantire che la reazione con la più alta quantità di enzima (1.000 ng) non idrolizza completamente tutta substrato disponibile entro il periodo di incubazione di reazione. Le reazioni di controllo senza enzima aggiunto stati usati per sottrarre gli effetti di qualsiasi colorante rilasciato causata dalla sola incubazione. I surnatanti di reazione corrispondenti ad ogni quantità dell'enzima sono stati ripresi prima misure di assorbanza (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il saggio MicroSlide diffusione e il test di tintura-stampa forniscano vantaggi per la rilevazione e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici precedentemente non identificati. Questi metodi rapidi e sensibili permettono di high-throughput screening di librerie di origine organismo per l'identificazione di enzimi di interesse prima di investire maggiori risorse per la ricerca. Come alto profilo enzimi bersaglio sono identificati, variazioni dei test di rilevazione possono essere utilizzati per rilevare rapidamente l'enzima o per determinare caratteristiche biochimiche dell'enzima. Ad esempio, durante una schema di purificazione proteica multistep, il saggio MicroSlide diffusione può rapidamente rilevare frazioni contenenti l'enzima di interesse. Inoltre, optima reazione per l'enzima può essere determinato alterando i buffer di reazione e temperature di incubazione nel test dye-release.

La gamma della massa enzima necessario per la rivelazione nel saggio MicroSlide diffusione è una funzione di caratterizzazione enzimaticistiche. limiti di rilevazione del test richiedono generalmente l'impiego di una maggiore quantità di enzima rispetto saggio dye-release. In questo studio, confronto dei limiti di segnalazione dell'analisi MicroSlide diffusione (Figura 1) per il saggio dye-release (figura 4) illustra che il saggio MicroSlide diffusione è una tecnica meno sensibile saggio dye-release. Quando la concentrazione dell'enzima non è un problema, il saggio MicroSlide permette un rapido screening iniziale di librerie per la produzione di proteine ​​antimicrobici contro substrati bersaglio con bassi di manodopera e attrezzature richieste. Anche se richiede uno sforzo maggiore e le attrezzature, il saggio di tintura-release è più sensibile e riproducibile, ottenendo risultati quantitativi che consentono il confronto tra i test di colorante a rilascio dello stesso o di diversi enzimi per un determinato substrato. I due metodi sono eseguiti facilmente nella maggior parte dei laboratori microbiologici senza necessità di strumentazione altamente specializzato. Nel representasaggi tive, l'enzima di controllo, α-chimotripsina, è stata rilevata a valori bassi quanto 100 ng (Figura 5) usando il saggio dye-release, mentre la quantità minima rilevata nel saggio MicroSlide diffusione era 1 ug (dati non mostrati).

Fornire utilità come test determinazione qualitativa per gli enzimi antimicrobici, un certo numero di variazioni del dosaggio diffusione sono stati segnalati ^11,13. Rivedendo questi test, il test MicroSlide diffusione è stato sviluppato per la sua relativamente alta sensibilità come una schermata iniziale e per la sua facilità di osservanza reazione. Modificato dal lavoro di Lachica et al. ^11, in cui le sovrapposizioni agarosio sono stati usati per rilevare la produzione di nucleasi da ceppi di Staphylococcus aureus, il saggio diffusione MicroSlide funziona in modo simile al metodo radiale immunodiffusione ¹⁴ come la proteina diffonde dal pozzo nel agarosio contenente il substrato. Il immunodiffu radialeMetodo sione arresta l'espansione della zona di immunoprecipitazione quando il sistema raggiunge un equilibrio formazione complesso tra l'antigene e l'anticorpo diffusione all'interno agarosio. Al contrario, il substrato del saggio MicroSlide diffusione è inizialmente digerito dal antimicrobica proteine ​​diffondente in una zona in continua espansione di lisi circonda il pozzo. La crescente diametro della zona continua finché l'enzima perde attività o il substrato è esaurito. La velocità di produzione della zona di lisi è accelerato come purezza, e quindi l'attività specifica, dell'enzima oppure la concentrazione dell'enzima aggiunto al pozzetto aumenta.

Per valutare quantitativamente l'attività enzimatica di antimicrobici proteina contro il calore ucciso B. subtilis, il saggio di tintura-release è stato scelto. test colorimetrici che utilizzano Remazol brillante colorante blu R (RBB) -labeled substrati permettono di valutazione versatile e sensibile di proteine ​​Activi antimicrobicoty. idrolisi enzimatica dei risultati substrato RBB marcate nel rilascio di prodotti solubili blu che può essere facilmente misurata con uno spettrofotometro a 595 nm. Diverse varianti di dosaggio colorante rilascio RBB, sviluppati per caratterizzare altre proteine ​​enzimi antimicrobici, mostrano la flessibilità di questo saggio per applicazione con altri substrati. Ad esempio, nel determinare gli effetti di lysostaphin attività bacteriolytic, Zhou, et al., Ha registrato un saggio di tintura a rilascio utilizzando cellule di stafilococco RBB-tinti e stafilococchi peptidoglicano come substrati ^12. In una modifica dell'applicazione di questo test dye release RBB, RBB marcato substrato luteus Micrococcus stato proposto per l'uso come un mezzo rapido e sensibile per diagnosticare e schermo per malattie come infezioni batteriche e la presenza di un carcinoma maligno, che può essere correlato a livelli di espressione lisozima umani nel siero del sangue ^15. Inoltre, substrati cellulari batteriche RBB-etichettati hannoLSO stato utilizzato in un metodo zimogramma per la rilevazione di lisozima ^16.

Dimostriamo il limite abbassato di rilevazione, la convenienza, e la riproducibilità del test dye-release, che consente per lo screening della libreria rapida per la produzione di enzimi. Modifiche del dosaggio consentono test di caratterizzazione valle quantitative biochimiche, inclusi gli effetti di temperatura, pH, salinità e nonché gli effetti di altri enzimi proteolitici sull'attività delle proteine ​​antimicrobiche ^6. Inoltre, il saggio dye-release quantitativa può essere utilizzata per confrontare le attività di più enzimi per un determinato substrato. Il saggio dye release RBB ha segnalato utility per enzimi con attività contro polisaccaridi in aggiunta alla caratterizzazione e la rilevazione di proteine ​​agenti antimicrobici. Pettersson e Eriksson riportato un test per la rilevazione di attività endoglycanase utilizzando amorfi, perline polisaccaridi RBB-tinti di cellulosa, xilano, mannano, e chitin ^17. In un'espansione di questi risultati, un metodo sensibile per la rilevazione degli enzimi chitinasi prodotta da Bacillus thuringiensis Bt-107 è stato sviluppato utilizzando chitina colloidale marcato con RBB ^18. Da questi e altri studi, le fonti disponibili in commercio di substrati RBB-tinti sono emerse per l'utilizzo nella rilevazione di attività glicolitica, compresi quelli contro la cheratina, amilopectina, amilosio, il glicogeno, laminarin, D-silano, glucano Azo-orzo, e amido.

In questo studio, dimostriamo l'utilità del saggio dye-release in un formato micropiastra, riducendo il volume di substrato RBB-marcato e enzima necessario per produrre il risultato colorimetrico. Come illustrato in figura 4 e figura 5, il saggio dye-release micropiastre fornisce un limite di rilevazione inferiore al dosaggio diffusione MicroSlide per rivelazione di attività enzimatica. Per quanto riguarda il rapido utilizzo, la conservazione del lavoro, e la facilità di interpretazione, il microfonoassay diffusione roslide fornisce utilità schermi high-throughput iniziali per la presenza di attività antimicrobica e l'indicazione della presenza della proteina antimicrobica in passi di isolamento e purificazione di proteine ​​a valle. La combinazione di questi due saggi completano in screening iniziale e finale caratterizzazione di nuovi antimicrobici proteine

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropiastra a fondo piatto a 48 pozzetti con coperchio a bassa evaporazione	Becton Dickinson	3078
Micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
agarosio	Fisher Scientific	BP162-100
&alfa;-chimotripsina	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad
piralide del sughero	Humboldt	H-9661
lisozima	Sigma-Aldrich	L6876-1G
standard di equivalenza McFarland (2.0)	Fisher Scientific	R20412
microvetrini	Fisher Scientific	22-38-103
brodo nutriente	Fisher Scientific	S25959B
peptidoglicano di Bacillus subtilis 168	Sigma-Aldrich	69554-10MG-F
soluzione salina tamponata con fosfato (1x)	Teknova	P0200
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	Life Technologies	23227
Spettrofotometro per micropiastre Synergy HT	BioTek Instruments, Inc.
Remazol blu brillante colorante R (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	American Type Culture Collection	10708
azoturo di sodio	Fisher Scientific	S227-100
idrossido di sodio (NaOH)	Fisher Scientific	S318-500
Titer Tops film di polietilene adesivo pretagliato	Diversified Biotechnology	T-TOPS-50
Acqua distillata ultrapura	Invitrogen	10977-015
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Solution
soluzione di agarosio 50 ml di PBS 0,25 g di agarosio			Aggiungere il 10% di sodio azide alla soluzione fusa di PBS/agarosio
brodo nutriente medium 4 g di brodo nutritivo 500 ml di acqua
250 mM di soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 1 g di NaOH 99 ml di acqua
di tipo I200 mM di colorante R blu brillante (RBB) 1,25 g di RBB 98,75 ml di soluzione