Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al Drosophila Larvale Giunzione neuromuscolare

Summary

La morfologia, le dimensioni e la posizione degli organelli intracellulari sono evolutivamente conservate e sembrano influenzare direttamente la loro funzione. Comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi è diventato un obiettivo importante della biologia moderna. Qui mostriamo come questi studi possano essere facilitati dall'applicazione di tecniche quantitative.

Abstract

La maggior parte degli studi sulla morfogenesi si basano su descrizioni qualitative di come tratti anatomici sono influenzate dalla perturbazione di specifici geni e percorsi genetici. descrizioni quantitative sono raramente eseguite, anche se le manipolazioni genetiche producono una serie di effetti fenotipici e le variazioni si osservano anche tra gli individui all'interno dei gruppi di controllo. prove emergenti mostra che la morfologia, dimensioni e la posizione di organelli giocano un ruolo fondamentale ma in precedenza sottovalutato in funzione delle cellule e la sopravvivenza. Qui forniamo istruzioni passo-passo per l'esecuzione di analisi quantitative di fenotipi a livello della giunzione neuromuscolare larvale Drosophila (NMJ). Usiamo diversi marcatori immunoistochimiche affidabili in combinazione con tecniche di bio-imaging e morfometriche analisi per esaminare gli effetti delle mutazioni genetiche sui processi cellulari specifici. In particolare, ci concentriamo sull'analisi quantitativa dei fenotipi che colpisce la morfologia, le dimensioni e la posizione di nuclei all'interno dei muscoli striati di Drosophila larve. La Drosophila larvale NMJ è un modello sperimentale prezioso per studiare i meccanismi molecolari alla base della struttura e la funzione del sistema neuromuscolare, sia in salute e malattia. Tuttavia, le metodologie che descriviamo qui possono essere estesi ad altri sistemi.

Introduction

L'analisi qualitativa limita l'attenzione della maggior parte degli studi sperimentali all'esame delle manipolazioni genetiche che portano a grandi effetti fenotipici o a fenotipi che non sono suscettibili di quantificazione, ad esempio, assenza/presenza. La quantificazione dei fenotipi di solito non viene eseguita e le variazioni presenti all'interno dei membri di un gruppo fenotipico non vengono prese in considerazione. Inoltre, senza descrizioni matematiche delle morfologie, potrebbe essere difficile determinare se i cambiamenti fenotipici su scala fine sono il risultato di alterazioni geneticamente indotte o se i cambiamenti osservati sono semplicemente dovuti a fluttuazioni casuali.

Proponiamo che per un'analisi accurata e imparziale dei difetti fenotipici dovuti alla distruzione genica, le metodologie quantitative dovrebbero accompagnare gli approcci qualitativi più tradizionali. La valutazione quantitativa dei fenotipi è particolarmente vantaggiosa per strutture come le sinapsi che presentano un alto grado di variabilità a causa della loro intrinseca plasticità morfologica e funzionale. Abbiamo selezionato esempi di analisi quantitative applicate ad aree di indagine con cui abbiamo più familiarità, vale a dire le giunzioni neuromuscolari larvali (NMJ) di Drosophila. Tuttavia, concetti e principi si applicano ugualmente bene ad altri sistemi sperimentali.

L'NMJ larvale è un eccellente sistema modello per studiare lo sviluppo e la funzione sinaptica a causa della natura altamente stereotipata della sua struttura. Ogni emisegmento del sistema neuromuscolare larvale contiene 32 motoneuroni identificabili che formano contatti sinaptici con il loro muscolo bersaglio postsinaptico. Ogni emisegmento contiene anche un numero fisso di muscoli visibili come fibre multinucleate attaccate alla superficie interna della cuticola¹. Un altro vantaggio dell'utilizzo del sistema neuromuscolare larvale è la potenza e la versatilità della genetica della Drosophila, che consente facilmente la generazione di un numero di alleli mutanti e la possibilità di modificare l'espressione genica in modo limitato nel tempo e nei tessuti. Infine, il 75% dei geni umani che causano una malattia hanno un ortologo evolutivamente conservato in Drosophila². In effetti, interi percorsi genetici sono conservati tra mosche e esseri umani. Per questo motivo, il sistema neuromuscolare larvale di Drosophila è un modello sperimentale molto popolare per chiarire i meccanismi molecolari alla base di una serie di malattie umane, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)¹.

Qui dimostriamo che la disponibilità di diversi marcatori immuno-istochimici affidabili, combinata con tecniche di bio-imaging e accurate analisi morfometriche può descrivere tratti anatomici che possono svolgere un importante ruolo funzionale^3,4,5. Tra i processi cellulari suscettibili di analisi quantitative, ci concentriamo sui cambiamenti di forma, dimensione e posizione delle strutture intracellulari come i nuclei. Tutti questi sono processi di cui sappiamo molto poco.

La sfida per i genetisti molecolari nei prossimi decenni sarà quella di ampliare le nostre attuali conoscenze analizzando l'effetto delle mutazioni genetiche che producono difetti fenotipici molto sottili. Le metodologie quantitative che consentono ai ricercatori di esplorare meticolosamente gli effetti delle mutazioni genetiche possono fornire una comprensione più completa di come i genotipi si relazionano ai fenotipi, in particolare per i processi cellulari poco compresi.

Protocol

1. Preparazione sperimentale

Nota: Dissezioni e procedure immunoistochimica nelle sezioni 2 e 3 vengono eseguite in base ai riferimenti ^3-6, ma con modifiche.

1. Preparare 1x fosfato-Buffered Saline (PBS) e PBS contenente 0,1% Triton-X 100 (PBT). Tenerli in ghiaccio.
2. Preparare fissativo di Bouin (15 acido picrico: 10 Formaldeide: 1 acido acetico glaciale). Rendere questo reagente fresco.
3. Selezionare perni in acciaio inox minutien pulita e una pinza sottile.
4. Preparare piatti dissezione contenente un disco Sylgard in un cinque centimetri Petri.

2. dissezione di terze stadio larvale NMJs

1. Scegli vagare terzo instar larve da una fiala o di una bottiglia con un pennello fine e metterli in un piatto di 2 centimetri di Petri contenente 4 ° C PBS per lavare il cibo residuo via.
2. Mettere una larva sulla parte superiore della superficie sylgard della piastra dissezione e assicurarsi che sia positioned con il suo lato dorsale in modo che i due tubi tracheali longitudinali sono visibili sulla parte superiore.
3. Utilizzando le pinze per tenere il perno, il perno della larva fino alla sua estremità anteriore, proprio sotto il gancio bocca. Allungare la larva fuori il più possibile e perno terminale suo posteriore verso il basso.
4. Aggiungere abbastanza salina PBS per raggiungere le pareti della piastra e immergere completamente la larva.
5. Ripetere la procedura dal punto 2.1 a 2.3 per altre larve dello stesso genotipo. Un solo 5 centimetri Petri piatto piatto dissezione può facilmente ospitare fino a 8 larve.
6. Utilizzando le forbici micro-dissezione, sollevare leggermente la cuticola dorsale e fare una piccola incisione orizzontale alla fine posteriore in prossimità del perno.
7. Inserire forbici nella incisione, tagliare la larva fino all'estremità anteriore, lungo la linea mediana tra i due tratti longitudinali della trachea. Assicurarsi che i tagli della linea mediana sono abbastanza superficiali di passare solo attraverso la cuticola e per evitare di tagliare attraverso i muscoliil lato ventrale.
8. A ciascuna estremità, tagliare due tacche su entrambi i lati sinistro e destro.
9. Aprire il filetto posizionando due perni su entrambi i lati dell'incisione anteriore. Ripetere la stessa cosa con l'estremità posteriore. Quando si posizionano i pin, assicurarsi di diffondere la parete del corpo a parte.
10. Pulire gli organi interni con pinze e PBS soluzione salina. Lasciare il sistema nervoso centrale intatto. allungare delicatamente la larva con perni d'angolo fino a quando non è completamente tesa, ma fare in modo che i muscoli non sono strappati durante questo processo.
11. Ripetere la stessa procedura di dissezione per l'altro larve sulla stessa piastra dissezione.
12. Lavare con PBS soluzione salina tre volte per rimuovere tutti gli organi interni.
13. Sostituire il PBS con fissativo di Bouin e lasciare a temperatura ambiente per 10 min.
14. Lavare più volte con PBT.
15. Rimuovere i perni con cura e trasferire tutti i preparativi, che ora sono piuttosto rigida, in una provetta da 1,5 ml di micro-centrifuga per immuno-colorazione.

La colorazione 3. immunoistochimica di Drosophila NMJs con anticorpi specifici per i muscoli e mionuclei

1. lavare rapidamente i filetti larvale in PBT.
2. Bloccare i preparativi incubando con normale siero di capra 10% (NGS) in PBT per 2 ore sotto costante agitazione.
3. Incubare un set di NMJs sezionato in PBT contenente 5% di NGS e un anticorpo di coniglio anti-lamina (ad una concentrazione di 1: 500) e con una cavia anti-DVAP anticorpi (ad una concentrazione di 1: 500) per 2 ore a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte. Il DVAP anti-anticorpo colora i muscoli striati, mentre la colorazione anti-lamina rileva il contorno mionuclei.
4. Risciacquare una volta rapidamente in PBT per rimuovere gli anticorpi in eccesso. Lavare in PBT per 2 ore cambiando il PBT tampone ogni 15 min.
5. Incubare i campioni in PBT contenente 5% NGS e anticorpi secondari fluorescenti marcati a diluizione 1: 500 per 2 ore a temperatura ambiente. Gli stessi campioni cun essere sottoposti a colorazione con anticorpi multipli allo stesso tempo, se vengono utilizzati anticorpi secondari coniugati con diversi cromofori.
6. Rimuovere anticorpi secondari e lavare in PBT per 2 ore cambiando il PBT tampone ogni 15 min.
7. Per macchiare l'interno delle myonuclei lavare i campioni tre volte con PBS e procedere come segue:
   1. Aggiungere il marcatore nucleare TO-PRO-3 ad una diluizione di 1: 1000 in PBS e incubare per 20 min sotto costante agitazione. Questo marcatore viene utilizzato in questo studio, ma qualsiasi altro marcatore nucleare disponibile in commercio può essere utilizzato come bene.
   2. Lavare rapidamente tre volte in PBS prima del montaggio.

4. I campioni di montaggio sugli scivoli

1. Raccogliere i campioni con una pinza dal tubo 1,5 ml di micro-centrifuga e li stabiliscono su un vetrino di elaborazione.
2. Utilizzando le forbici micro-dissezione, tagliare la testa e la coda dei filetti e mantenere la loro superficie fino interna.
3. preparare °e il montaggio scorrevole avvolgendo circa tre strisce di nastro cellulosa su ciascun lato di un vetrino pulito ad una distanza di circa 1 cm l'una dall'altra. Una volta che il vetrino è posizionato sulla parte superiore delle due strisce, una lacuna verrà generato che evitino appiattimento dei campioni. Questo è fondamentale se tridimensionali rendering del volume delle strutture devono essere fatte.
4. Mettere una piccola goccia di circa 20 microlitri del mezzo di montaggio al centro della slitta di montaggio tra le tre strisce di nastro di cellulosa.
5. Dopo la diffusione del mezzo di montaggio con le pinze pulite, trascinare le larve sezionato alla slitta di montaggio nel mezzo di montaggio, mantenendo la superficie fino interna. Prova a montarli in file di quattro o cinque.
6. cadere delicatamente una scivolata copertura sulla parte superiore della slitta di montaggio e fare in modo che bolle d'aria sono generati. Sigillare il vetrino con smalto trasparente. Lasciate che i campioni asciugare per almeno 10 minuti prima di imaging.

5. Impostazioni confocale di Imaging

Nota: Le immagini presentate in questo studio sono effettuate utilizzando una unità confocale Nikon A1R integrato su un Ti: Microscopio E invertito. Tuttavia, qualsiasi microscopio confocale con un minimo di 3 unità laser disponibili nelle regioni di lunghezza d'onda di 488 nm, 561 nm e 642 nm e un sistema di rilevamento 3 canali è adatto a questo scopo.

1. Accendere il laser, unità rivelatore, bulbo di mercurio, di controller palco, microscopio e il PC. Avviare il software di controllo e fissare il vetrino sul supporto palco.
2. Per rendere più veloce delle immagini, selezionare e contrassegnare tutte le regioni di interesse (ROI) sul campione utilizzando un obiettivo 20X.
3. oscillare con cautela il revolver alla 60X di ingrandimento più elevato lente dell'obiettivo (60X Plan Apo VC / NA 1.4 OIL).
4. Mettere una goccia di olio di immersione sulla lente dell'obiettivo e selezionare una delle ROI segnata dalla finestra panoramica XYZ sul computer.
5. Inizia l'imaging utilizzando le seguenti impostazioni ottiche: Selezionare la prima Dichroic Mirror: 405/488/561/640. Selezionare 488 nm laser con filtro di emissione 525/50 nm nel canale 1, 561 nm laser con filtro di emissione 595/50 nel canale 2 e del laser 642 nm con passa-filtro lungo 650 nm nel canale 3.
6. Utilizzare le seguenti impostazioni di scansione prima di avviare l'acquisizione delle immagini: Seleziona scanner Galvano; Direzione di scansione: un modo; Velocità di scansione: 0,5 fotogrammi al secondo.
7. Selezionare serie di Channel per evitare canale sanguinare-through.
8. Regolare la dimensione pin-hole per 1 unità arioso. Scansione e regolare la potenza del laser, aumento di rilevazione e l'offset appropriato per ogni canale al fine di evitare la saturazione dei pixel e il livello di sfondo.
9. Acquisire z-stack utilizzando dimensioni voxel 0,2 x 0,2 x 0,5 micron ³ per tutto il ROI e la preparazione di scorrimento. Se le immagini saranno sottoposti a deconvoluzione quindi impostare la dimensione voxel di 0,06 x 0,06 x 0,15 micron ^3.
10. Salvare le immagini in formato di file o .ics formato .nd2.

6. Calcolo della distanza tra Nuclei all'interno striato60; muscoli con il metodo di Analisi del vicino più vicino

1. Per questa analisi, utilizzare le immagini confocale che mostrano i muscoli del corpo a parete larvali colorate con anticorpi DVAP di visualizzare i muscoli e con anticorpi Lamin e un marcatore nucleare per evidenziare i nuclei.
2. Per stimare la distanza più vicina tra i nuclei, utilizzare punti di misura all'interno del modulo MeasurementPro del software di analisi di immagine (ad esempio, Imaris). Altre applicazioni software simili per l'analisi delle immagini possono essere utilizzate per gli stessi scopi.
3. Aprire le immagini confocale. Per iniziare, fare doppio clic sull'icona del software. Trascinare e rilasciare le immagini z-stack confocale in Arena.
4. Fare doppio clic sulle immagini per loro si apre automaticamente nella vista sorpassare, sotto l'icona barra degli strumenti del menu . Il Surpass View ha tre principali pannelli dell'area di lavoro: Area di visualizzazione, oggetto elenco e Proprietà oggetto Area.
5. Creare un volume reso timmagine del canale hree facendo clic sull'icona del menu 3D View .
6. Clicca sui punti sull'icona Aggiungi nuova misurazione dal Oggetti barra degli strumenti e seguire la procedura guidata di creazione che appare in oggetto Proprietà Area.
7. Dalla procedura guidata di creazione selezionare la scheda Modifica prima e poi del canale specifico. Selezionare il marcatore nucleare o il canale lamina per evidenziare i nuclei.
8. Impostare il puntatore per il modo di selezione premendo la linguetta Esc sulla tastiera.
9. Regolare le dimensioni della scatola cursore 3D con il mouse per contenere un determinato nucleo nell'immagine. Aggiungere un punto di misura tenendo premuto il tasto Shift e tasto sinistro del mouse sullo stesso nucleo.
10. Aggiungere il secondo punto su un nucleo vicina sullo stesso muscolo ripetendo i passi precedenti. Una linea è disegnata automaticamente tra i due punti e la distanza misurata tra vengono visualizzati i due nuclei. La distanza tra i due nuclei è ora registrata come una variabile statistica in oggetto Proprietà area sotto la scheda Statistiche> Dati dettagliata> Distanza.
11. Ripetere la procedura dal punto 6.6 a 6.10 per tutti i nuclei che circondano un determinato nucleo.
12. Da Statistiche> Dati dettagliata> Distanza che mostrano tutti i punti di misura raccolti, selezionare la distanza più breve.
13. Cliccando sulle statistiche delle esportazioni sulla scheda Display per file disponibile sotto la Proprietà oggetto Area, i dati verranno salvati su un foglio di calcolo.
14. Ripetere la stessa procedura per gli altri nuclei circostanti e per un numero selezionato di fibre muscolari per genotipo.
15. Utilizzando i dati esportati in un file di foglio di calcolo, calcolare la distanza media più breve (D _ave) per tutto il numero M di muscoli utilizzando la seguente equazione:
    OAD / 53821 / 53821eq1.jpg "/>
    Di è la distanza più breve per il nucleo confinante per un dato nucleo i dove i varia da 0 a N e N è il numero di nuclei analizzate per muscolare. La somma dei valori di j = 0 per j = m indica il numero M dei muscoli analizzati.
16. In alternativa, utilizzare Macchie procedura guidata di creazione e macchie a macchie Distanza minima per stimare la distanza media per nucleo contigue. Per questo, è necessario un modulo di estensione Matlab.
    1. Fare doppio clic su una specifica immagine sull'immagine 3D volumi Arena e sarà visualizzato nell'area di visualizzazione. Fare clic sull'icona di creazione degli oggetti e aggiungere nuovi spot dalla barra degli strumenti Oggetti.
    2. Dalla procedura guidata di creazione della Proprietà oggetto Area, fare clic sull'opzione Skip Creazione automatica, modificare manualmente.
    3. Selezionare la lamina o il canale marcatore nucleare per visualizzare i nuclei.
    4. Maiusc e fare clic su LEFt pulsante del mouse su tutti i nuclei di un muscolo specifico dell'immagine. Apparirà un posto per ogni nucleo.
    5. Selezionare posti per Macchie Minima distanza elencato nella scheda Strumenti nella Proprietà dell'oggetto zona. appare selezionare Spots statistiche sotto la modalità risultato e una finestra di Matlab.
    6. Sotto la scheda Statistiche, selezionare valori dettagliati e quindi specifici. Clicca sulla Distmin e appariranno i valori delle distanze minime per ogni nucleo.
    7. Esportare i dati in un file foglio di calcolo e calcolare la media di queste distanze per muscolo. Ripetere la sequenza per tutti i muscoli di un dato genotipo.

7. determinare la forma dei nuclei all'interno dei muscoli del corpo a parete di larve di Drosophila

1. Per questa analisi, utilizzare le immagini confocale dei muscoli del corpo a parete colorati con lamina e un marcatore nucleare per visualizzare i nuclei.
2. Per valutare la forma di myonuclei, misura sfericità (definito come rapporto del sursuperficie frontale di una sfera con lo stesso volume come nucleo data, alla superficie del nucleo) o ellitticità (distingue tra ellissoidi prolate oblate / e sferoidi).
3. Apri l'immagine come descritto in precedenza. Clicca sull'icona barra degli strumenti Oggetti Aggiungere nuove superfici .
4. Nella procedura guidata di creazione che appare nella Proprietà oggetto, selezionate la colorazione marcatore nucleare come il canale sorgente per visualizzare i nuclei.
5. Impostare l'intensità assoluta opzione come la soglia. Assicurarsi che la maggior parte dei nuclei mostrano una resa liscia e non sovraccaricato cambiando il valore sulla curva di soglia. Al tempo stesso, evitare la presenza di fori o maschera incompleta qualsiasi nucleo utilizzando la stessa curva.
6. Usa il strumento di filtro per escludere qualsiasi rumore nel rendering di superficie. Nella scheda Modifica dello strato superficiale di nuova creazione, Split o unire le superfici nuclei che sono erroneamente rindered.
7. Esporta in un foglio di calcolo file di valori ellitticità e sfericità della superficie nuclei resi disponibili sotto la scheda Statistiche.
8. In alternativa, utilizzare il software ImageJ o Fiji per misurare la circolarità di nuclei in cui la circolarità (C) è definita come C . Un valore di uno rappresenta un cerchio perfetto mentre un valore prossimo a zero indica una forma sempre più allungata.
9. Crea proiezioni di massima intensità delle z pile dal menù Immagini> Stack> Z Project. Impostare tipo di proiezione a Max intensità.
10. Dividere i canali e selezionare il canale marcatore nucleare.
11. Dal menu principale, selezionare Immagine> Regola> Soglia.
12. Segmento i nuclei regolando la soglia di intensità. Se i nuclei vicine sono segmentati come una singola unità, cliccare sul processo> Binary> strumento dei bacini idrici per scollegare i nuclei.
13. Dal menu principale, selezionare Modifica> Selezione> Crea selezione.
14. Aggiungere tutti gli ROI selezionati al ROI Manager facendo clic sul menu Analizza> Strumenti> ROI Manager. Nella finestra ROI manager cliccare su Aggiungi. All'interno della stessa finestra selezionare Altro> Spalato.
15. Selezionare descrittori di forma in Analizza> Imposta misurazioni. Nella finestra Gestione ROI fare clic sulla scheda Misurare. Verrà visualizzato un elenco di valori di circolarità di tutti i nuclei selezionati.
16. In aggiunta, per misurare il volume nucleare, seguire procedura guidata di creazione superficie utilizzando il canale di colorazione marcatore nucleare come descritto nelle sottosezioni 7.3-7.7.

8. Rendering volume 3D dei nuclei selezionati all'interno dei muscoli del corpo a parete Drosophila larvali di valutare la Intranuclear localizzazione di una specifica proteina

1. Usare le immagini confocale di reporting muscoli della parete del corpo macchiati con un pennarello nucleare e con anticorpi specifici per Lamin e DVAP.
2. Aprire le immagini avviando il software e SELect nucleo specifico da analizzare. Questo può essere fatto selezionando la voce del menu principale Modifica> Crop 3D.
3. Seguire procedura guidata di creazione di superficie utilizzando il canale della lamina, come descritto nella sottosezione 7,3-7,7.
4. Una volta creata la superficie, fare clic su Modifica nella proprietà degli oggetti Area e quindi selezionare mascherare tutti per isolare il segnale all'interno del nucleo. Questo crea una nuova finestra.
5. Selezione segnale DVAP dal menu a discesa selezionare Canale. Selezionare il segnale immuno-reattività DVAP all'interno del nucleo cliccando sull'opzione Imposta Voxels all'esterno della superficie a zero. Un nuovo canale mascherato viene creata ed è disponibile nella finestra di regolazione di visualizzazione per la selezione.
6. Per visualizzare la presenza del segnale all'interno del nucleo creare un piano di contorno facendo clic sull'icona Aggiungi nuovo piano di ritaglio dalla barra degli strumenti Oggetti.
7. Interattivamente regolare l'angolo del clippingaereo e la posizione visualizzare la distribuzione del segnale all'interno del nucleo.

Results

La SLA è una malattia degenerativa che colpisce specificamente i motoneuroni che portano ad una paralisi progressiva e fatale dei muscoli striati ^7. Mutazioni missenso nel umani VAMP-proteina associata B (hVAPB) causano una serie di malattie del motoneurone, tra cui la SLA Tipo 8 ^8-12. Una mutazione missense (V234I) nel gene hVAPB è stato recentemente identificato in un caso di SLA tipici negli esseri umani ^13. Per valutare il suo potenziale patogeno, abbiamo generato mosche transgenici che esprimono la hVAPB Drosophila ortologo DVAP portando la mutazione responsabile della malattia (DVAP-V260I). L'espressione di questo transgene è stata mirata ai muscoli utilizzando il sistema UAS / GAL4 e muscolo-specifica del driver BG57-GAL4 ^14,15. L'effetto di DVAP-V260I espressione transgenica è stato confrontato e contrapposto a quello degli altri due transgeni (DVAP-WT1 e DVAP-WT2), che esprimono diversi livelli della proteina wild-type DVAP ^16. More in particolare, l'aumento di DVAP immunoreattività è 2,2 volte superiore rispetto ai controlli per la linea DVAP-WT2 mentre i livelli DVAP-V260I e DVAP-WT1 mostra comparabili e inferiore dello stesso segnale ^16.

Alterazioni nucleari sono state associate con l'invecchiamento e molte malattie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson ^17,18. Per valutare se il nostro modello di volo per ALS8 mostra cambiamenti nel nucleare architettura, la posizione e le dimensioni, abbiamo macchiato nuclei all'interno di muscoli striati di genotipi adeguate con un pennarello nucleare e l'anticorpo anti-lamina ^19-22, che visualizza l'involucro nucleare. Per evidenziare i muscoli, un anticorpo specifico per DVAP inoltre è stato aggiunto a detti campioni (Figura 1). immagini confocali sono state raccolte e analisi dettagliate morfometriche sono state eseguite utilizzando un software di analisi delle immagini. In muscoli di controllo, i nuclei sono stati trovati per essere distribuito in modo uniforme lungo il muscolofibre mentre in DVAP-V260I e DVAP-WT esprimere i muscoli, i nuclei mostrano una tendenza a ridistribuire in cluster strettamente legate (Figura 1).

Abbiamo condotto un'analisi vicino più prossimo ad effettuare una valutazione quantitativa della distribuzione dei nuclei lungo le fibre muscolari di ogni genotipo. Un'analisi vicino più prossimo primo identifica il vicino più prossimo per ogni nucleo misurando la distanza tra il centro di un dato nucleo e il centro di ogni altra nucleo circostante. Questo procedimento viene quindi ripetuto per ogni altri nuclei lungo la fibra muscolare. Infine, la distanza minima tra i nuclei all'interno di un muscolo specifico, viene calcolato facendo la media delle distanze più brevi di ogni nucleo e i suoi vicini più prossimi. (Figura 2A - C). Rispetto ai controlli, i muscoli che esprimono sia il transgene DVAP-V260I o uno qualsiasi dei transgeni sovraesprimono la proteina wild-type, Presentare una drammatica riduzione della distanza media minima tra i nuclei e, di conseguenza, nuclei sembrano essere strettamente associato a grappoli. L'effetto della ALS causando allele DVAP-V260I è più grave di quella associata con la sovraespressione della proteina wild-type, anche se il più forte transgene DVAP-WT2 viene utilizzato (Figura 1 e Figura 2D).

Sovraespressione di uno DVAP-V260I o DVAP-WT transgeni presenta anche un grave deterioramento della architettura nucleare conseguente nuclei deformati con una struttura allungata (figura 1). Questa aberrazione strutturale è stato quantificato usando il software ImageJ in cui circolarità è definita dalla formula C , Che misurano la larghezza al rapporto di lunghezza di ogni nucleo con C = 1 rappresenta un cerchio perfetto e C = 0 un poligono allungato infinitamente. in contrnuclei ol presentano una forma rotonda distinta, C è pari a 1 mentre nei mutanti transgenici un cambiamento di forma con conseguente perdita di circolarità, causa una significativa deviazione da questo valore (Figura 1 e Figura 3).

Abbiamo anche trovato che nei muscoli esprimono gli stessi transgeni, nuclei mostrano un volume nucleare allargata marcata rispetto ai controlli, anche se l'causando allele ALS sembra essere più efficace nell'indurre questo fenotipo rispetto ai transgeni DVAP-WT (Figura 4).

Quasi tutte le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un accumulo intracellulare di aggregati contenenti la proteina patogena. Abbiamo fatto ricostruzioni 3D e rendering di volume dei nuclei e abbiamo scoperto che nei muscoli che esprimono il transgene mutante o sovraesprimono la proteina wild-type, DVAP immuno-reattività cluster un formatond che alcuni di essi sono stati localizzati anche in nuclei (Figura 5). Viceversa, in NMJs controllo, DVAP immuno-reattività è debolmente disperso in fibra muscolare ed è escluso dal nucleo ^16.

. Figura 1: le immagini confocale di mionuclei all'interno muscoli striati che esprimono sia il transgeni DVAP-260I DVAP-WT o (A) BG57-GAL4 / + di controllo, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 e (D) BG57; muscoli DVAP-WT2 esprimono i transgeni indicate sono macchiati con anticorpi specifici per DVAP (segnale rosso), Lamin (segnale verde) e con un marcatore specifico nucleare per visualizzare i nuclei (segnale blu). Barra di scala = 30 micron Clicca qui per visualizzare ungrande versione di questa figura.

Figura 2: analisi Vicino più prossimo per determinare la distanza media tra un nucleo e il suo unico vicino più prossimo (B) I risultati rappresentativi che mostrano il posizionamento nucleare alterato nei muscoli sovraesprimono il transgene DVAP-WT2 rispetto ai controlli (A).. Distanza media nucleare nei muscoli dei genotipi indicati è stata stimata utilizzando la formula (C) ed i dati sono riportati in (D). NMJs larvali sono macchiati con anticorpi specifici per DVAP (segnale rosso), Lamin (verde) e con un pennarello nucleare (segnale blu). Gli asterischi indicano significatività statistica. *** P <0,001, ** P <0,01. Per l'analisi statistica di questo esperimento e tutti gli esperimenti riportati qui di seguito un test ANOVA unidirezionale è stato utilizzato e multip del Tukeytest di confronto le è stato applicato come un test post-hoc quando le differenze tra genotipi sono risultati significativi dal test ANOVA. Le barre di errore rappresentano SEM. Barra di scala = 30 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Immagini che mostrano passi rappresentativi nel calcolo del volume nucleare (A) Una immagine rappresentativa che mostra nuclei segmentati utilizzando la procedura guidata di creazione di superfici. Nuclei al confine delle immagini sono state ignorate. (B) Immagine che mostra il segnale DVAP nucleare dopo colorazione intorno DVAP è stato mascherato utilizzando la superficie creata nel canale marcatore nucleare. (C) strato superficiale fornisce informazioni di parametri aggiuntivicompreso il volume nucleare e la sfericità. (D) I dati sul volume nucleare di diversi genotipi. Gli asterischi indicano significatività statistica. NMJs sezionati sono state colorate con anticorpi anti-DVAP (segnale rosso), anticorpi anti-Lamin (segnale verde) e un marcatore nucleare (segnale blu). *** P <0,001, ** P <0,01. Le barre di errore rappresentano SEM. Barra di scala = 30 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: immagini che mostrano passi rappresentativi della stima della forma nucleare da parte ImageJ.    sporgenza massima intensità delle immagini sono stati analizzati utilizzando ImageJ per stimare circolarità dei nuclei all'interno di muscoli. (A) Un esempio rappresentativo di proiezione intensitàdell'immagine tre canali come al punto 7.9 del protocollo. È selezionato (B) Immagine che mostra passo 7.10 del protocollo in cui sono divisi i canali e il canale marcatore nucleare. (C) Una immagine rappresentativa che mostra che dopo l'applicazione della soglia di intensità di segmentare il plugin nuclei e direttore di ROI in ImageJ, tutti i nuclei di interesse possono essere selezionati e la loro forma misurati tramite descrittori di forma (i punti 7,11-7,15). (D) Quantificazione della circolarità dei diversi genotipi. Sulle NMJs larvali, il segnale rosso indica DVAP colorazione mentre il verde delinea nuclei e corrisponde alla colorazione lamina. L'interno di ogni nucleo è etichettato in blu causa la colorazione con un marcatore nucleare. Gli asterischi indicano significatività statistica. *** P <0,001, ** P <0,01. Le barre di errore rappresentano SEM. Barra di scala = 30 micron Cliccate suoe per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: immagini che mostrano fasi specifiche nella creazione di rendering del volume di mionuclei. (A) Immagine che mostra l'intensità 3D dei muscoli colorati con DVAP proteine ​​(rosso), la lamina (verde) e il marcatore del DNA (blu) miscelato. (B) Immagine che rappresenta uno strato superficiale generato utilizzando il canale lamina di segmentare i nuclei. (C) Immagine che rappresenta un nucleo in cui lo strato superficiale è stato usato per mascherare il segnale DVAP fuori dal nucleo selezionato. Evidenziato in giallo è un piano di taglio che è stato aggiunto all'immagine. Il suo angolo di vista e posizione può essere regolata in modo interattivo per visualizzare la distribuzione del segnale all'interno del nucleo. (D) Un'immagine segnalare una vista in sezione trasversale dello strato superficiale usi nucleare creatong il canale lamina fusa con DVAP smascherato e segnali marcatori nucleari. (E ed F) Ulteriori rendering di volume sezionate dello stesso nucleo. Barra di scala = 10 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

In passato, le variazioni morfologiche all'interno e tra i gruppi sperimentali sono stati raramente presi in considerazione. Tuttavia, l'applicazione di metodi quantitativi sta diventando la norma in studi comparativi di morfologia e descrizione matematica di forme anatomiche sono calcolati. L'utilizzo di analisi quantitative di valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche sui processi cellulari specifici, promettenti nel migliorare la nostra capacità di rilevare i cambiamenti morfologici e nel migliorare la precisione con cui vengono descritti questi cambiamenti. Inoltre, l'analisi statistica dei dati quantitativi ci permette di valutare se le differenze osservate tra fenotipi sono significativi.

In muscoli striati, nuclei presentano una struttura arrotondata distinto e sono distribuiti uniformemente lungo la fibra muscolare. Sebbene i meccanismi molecolari stabilire e mantenere dimensioni, la forma e l'architettura di nuclei non sono noti, queste caratteristiche nucleari sono suscettibili to giocare un ruolo fondamentale nel controllo della funzione muscolare. Infatti, diverse miopatie sono causate da mutazioni nei geni che regolano la morfologia e la posizione dei nuclei all'interno di muscoli. L'importanza funzionale della forma e la distribuzione dei nuclei all'interno di una cella non è limitata ai muscoli. Accumulando prove mostrano che i difetti nucleari sono anche associati a malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson ^18,24. Inoltre, stiamo cominciando a comprendere che la morfologia, le dimensioni e la distribuzione intracellulare di altri organelli tra cui reticolo endoplasmatico e mitocondri possono avere conseguenze funzionali. Per esempio, le alterazioni nella morfologia mitocondriale sono associate a disturbi neurologici come tipo-1 atrofia ottica (OPA1) e di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A neuropatia ^25.

Per assistere nel processo di chiarire i meccanismi molecolari alla base di questi processi importanti, si propone di coniugare alta risoluzione confocaledati con software di imaging e morfometriche analisi per valutare quantitativamente come le manipolazioni genetiche possono influenzare la forma, le dimensioni e la posizione dei nuclei all'interno di fibre muscolari. La potenza e la versatilità della genetica Drosophila insieme alla natura altamente stereotipati del sistema neuromuscolare in Drosophila larve rendono larvale NMJ un modello sperimentale particolarmente adatto a questo tipo di analisi. Alle NMJs larvali, analisi fenotipica può essere eseguita in una sola risoluzione sinapsi che consente un'accurata analisi morfometrica dove un certo numero di NMJs può essere studiata all'interno dello stesso volo e anche lo stesso identificabile NMJ può essere confrontata tra le mosche di diversi genotipi ^3,4.

La caratterizzazione fenotipica della posizione nucleare, forma e dimensione al Drosophila larvale NMJ inizia eseguendo immunocolorazione di NMJs sezionati con anticorpi che mettono in risalto i muscoli e dei nuclei all'interno dei muscoli. Nel protocollo descritto nella this carta, mionuclei sono state colorate con anticorpi policlonali contro Lamin, un marker della membrana nucleare, con un pennarello nucleare mettendo in evidenza le interne e con nucleari anticorpi specifici per DVAP di macchiare l'intero muscolo. Gli anticorpi lamin utilizzati in questi esperimenti sono stati gentilmente forniti da Paul Fisher ^19-22 ma fonti alternative di anticorpi anti-lamina possono essere utilizzati. Inoltre, un certo numero di altri anticorpi specifici per la membrana nucleare sono disponibili in commercio. Infine, marcatori nucleari, come DAPI e ioduro di propidio, sono disponibili anche mentre i muscoli possono essere visualizzati mediante colorazione con anti-actina o anti-tubulina anticorpi. Se gli anticorpi diversi da quelli utilizzati in questa procedura sperimentale sono impiegati, il protocollo immunocolorazione richiederà extra-passaggi in cui dovranno essere ottimizzati metodiche di fissazione e concentrazioni di lavoro per i nuovi anticorpi. Un passo fondamentale in questo protocollo, in particolare quando i rendering di volume devono essere analizzati, è the il montaggio dei campioni sul vetrino. In questo caso, è importante comprendere distanziatori tra il vetrino e coprioggetto in modo che i campioni non vengono schiacciati. Tre bande di nastro di cellulosa avvolte intorno alla slitta su entrambi i lati del vetrino rappresentano un modo semplice di fare distanziatori.

Mentre ImageJ è stato utilizzato per le immagini 2D, la maggior parte delle immagini multi-canale 3D analisi presentate in questo documento, sono stati fatti utilizzando Imaris a causa della sua disponibilità in-house. Tuttavia, qualsiasi altro simile software commerciale può essere utilizzato per queste applicazioni.

Ci sono diversi open-source (per esempio, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME e altri) e le piattaforme software commerciali disponibili per l'analisi di immagini confocale. ImageJ ^26, il software gratuito dal NIH o la sua versione più avanzata, conosciuta come Fiji ^27, ha un gran numero di filtri di importazione, macro e plugin disponibili per la comu immagini in tutto il mondoty. La maggior parte di questi plugin sono focalizzati sulla elaborazione delle informazioni sul modo fetta slice-by-. Ci sono anche plugin disponibili per la visualizzazione e l'analisi di immagini 3D multicanale. Tuttavia, essi sono spesso progettati per un compito specifico e gli utenti possono avere bisogno di estendere o adeguare questi plug-in per i propri bisogni. D'altra parte, piattaforme commerciali bersaglio utenti relativamente inesperti e spesso sono focalizzati sulla facilità da usare, un'ampia copertura delle operazioni di elaborazione delle immagini con velocità incredibile.

La procedura sperimentale insieme con l'analisi quantitativa fenotipica descritto in questo protocollo, può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che controllano organello morfologia e la loro distribuzione all'interno di una cella. Tuttavia, questo approccio ha il limite evidente di analizzare questi processi in una determinata end-point. Il processo di controllo morfologia e distribuzione degli organelli è probabile che sia molto dinamica e di variare non solo tra diversi ty cellulepes ma anche all'interno della stessa cella in base allo stato di sviluppo o fisiologico. Un ulteriore attuazione di questa analisi sarebbe rappresentato da immagini lasso di tempo che permette cambiamenti di organelli morfologia e posizione da monitorare nel corso del tempo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-pinze 0,3 mm x 0,25 mm	Strumenti per la scienza fine	11030-12
Placche di dissezione Sylgard	SIGMA-ALDRICH	76103	Miscelare la base elastomerica pre-pesata con l'agente indurente. Versare il composto in una capsula di Petri da 5 cm. Lascialo polimerizzare a 60 gradi C per almeno 24 ore
Acciaio inossidabile/acciaio Minutien Perni 0,1 mm di diametro	Strumenti di scienza fine	26002-10
Forbici per microdissezione (ultra-fine)	Strumenti di Fine Science	15200-00
1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato). Composizione: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7			NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)
Soluzione di Bouin. Composizione: Acido Picrico, Formaldeide, Acido Acetico (15:10:1)			Acido Picrico (SIGMA 197378), Formaldeide (F8775), Acido Acetico (SIGMA-1005706)
1x PBT (Soluzione Salina Tamponata con Fosfato con Tritone). 1x PBS + 0,1% Tritone			Tritone-X100. SIGMA-T8787
Siero di capra normale	SIGMA	G9023
		anti-DVAP per porcellini d'India	Fornito dalla Dott.ssa Giuseppa Pennetta (Università di Edimburgo, Regno Unito). Utilizzare a diluizione 1:200 in 5% NGS
Rabbit anti-HRP (Horseradish perossidasi)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Utilizzare a diluizione 1:500 in PBT contenente il 5% di
NGS Rabbit anti-Lamin antibody			Fornito dal Dr. Paul Fisher (Università statale di New York a Stony Brook). Utilizzare a diluizione 1:500 in PBT contenente il 5% di NGS
TO-PRO-3	Molecular Probes	T3605
Anticorpo anti-coniglio di capra, Alexa Fluor488, coniugato	Jackson ImmunoResearch	bs-295G-A555-BSS	Utilizzare a diluizione 1:500 in PBT contenente il 5% di
anticorpo IgG anti-cavia NGS di capra, Cy3, coniugato	Jackson ImmunoResearch	bs-0358G-Cy3-BSS	Utilizzare a diluizione 1:500 in PBT contenente il 5% di
NGS Vectashield terreno di montaggio per a fluorescenza	Vector laboratories	H-1000