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Articolo metodologico

In Vivo alcalina Comet Assay e l'enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

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DOI:

10.3791/53833

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4 maggio 2016

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1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

In questo articolo

Sommario

Il test della cometa alcalina misura le rotture del filamento di DNA nelle cellule eucariotiche. Aggiungendo una fase di digestione dell'endonucleasi III o dell'8-ossoguanina-DNA-N-glicosilasi umana, il test è in grado di rilevare in modo efficiente il danno ossidativo al DNA. Descriviamo i metodi per utilizzare questi saggi per rilevare il danno al DNA nel fegato di ratto.

Abstract

Il danno al DNA non riparato può portare a instabilità genetica, che a sua volta può migliorare lo sviluppo del cancro. Pertanto, l'identificazione di potenziali agenti dannosi per il DNA è importante per proteggere la salute pubblica. Il saggio della cometa alcalina in vivo, che rileva il danno al DNA quando si rompe il filamento, è particolarmente rilevante per valutare i rischi genotossici degli xenobiotici, poiché le sue risposte riflettono l'assorbimento, la distribuzione tissutale, il metabolismo e l'escrezione (ADME) in vivo delle sostanze chimiche, nonché il processo di riparazione del DNA. Rispetto ad altri saggi di danno al DNA in vivo, il test è rapido, sensibile, visivo e poco costoso e, convertendo il danno ossidativo al DNA in rotture di filamento utilizzando specifici enzimi di riparazione, il test può misurare il danno ossidativo al DNA in modo efficiente e relativamente privo di artefatti. La misurazione del danno al DNA con il test della cometa può essere eseguita utilizzando disegni di studio di tossicologia sia acuta che subcronica e, integrando il test della cometa con altre valutazioni tossicologiche, il test soddisfa i requisiti di benessere degli animali facendo il massimo uso delle risorse animali. Un altro grande vantaggio dei saggi è che richiedono solo una piccola quantità di cellule e le cellule non devono essere derivate da popolazioni cellulari proliferanti. I saggi possono anche essere eseguiti con una varietà di campioni umani ottenuti da individui clinicamente o professionalmente esposti.

Introduzione

Il test della cometa misura rotture del DNA a livello di singola cellula. Sospensioni di cellule singole sono incorporati in agarosio su un vetrino da microscopio e le cellule lisate per formare nucleoidi, che contengono loop supercoiled di DNA. Elettroforesi a pH> 13 risultati in perdita di superavvolgimento nei cicli di DNA contenenti rotture dei filamenti, con i filamenti di DNA liberati migrano verso l'anodo, la creazione di strutture cometa simili che possono essere osservati al microscopio a fluorescenza. DNA frammentato migra dalla "testa" della cometa nella "coda" in base alle dimensioni del frammento, e la relativa fluorescenza della coda della cometa rispetto all'intensità totale (testa e coda) può essere utilizzato per quantificare DNA rotture 1 , 2. Il test è semplice, sensibile, versatile, rapida e relativamente poco costoso 1. La rilevazione del DNA frammentato causate da agenti che danneggiano il DNA viene utilizzato un test per quantificare il danno al DNA nelle cellule o nuclei isolati da INDIVIdoppi tessuti degli animali trattati con materiale potenzialmente genotossico (s). Grazie ai suoi vantaggi, il test della cometa in vivo è raccomandato come una seconda vivo test in genotossicità (in coppia con il test del micronucleo in vivo) per effettuare valutazioni di sicurezza dei prodotti in corrente Conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH) 3 e dell'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA ) 4 linee guida di legge. Nel nostro laboratorio, abbiamo impiegato il test di valutazione dei danni al DNA vivo indotto da ingredienti alimentari, prodotti farmaceutici e nanomateriali 5-10. fegato di ratto sarà utilizzato come esempio in questo protocollo, ma il comet assay può essere eseguita con altri tessuti / organi di animali da esperimento, purché singole cellule intatte possono essere isolate dal tessuto.

Alcuni tipi di danni al DNA sono difficili da rilevare come rotture del DNA senza modificare il test della cometa di base. In caso di danno ossidativo al DNA, sezione Breaks possono essere creati in lesioni ossidative nel DNA da digerire con gli enzimi di riparazione, come umano 8-oxoguanine-DNA-N-glicosilasi 1 (hOGG1, che crea pause a 8-oxoguanine (8-oxoGua) e metil-fapy-guanina 11. Inoltre, endonucleasi III (Endo III) crea pause principalmente alle pirimidine ossidate 1. Così, l'aggiunta di una fase enzima digestione rende il test un metodo specifico e sensibile per misurare il danno ossidativo del DNA in vivo 12. Utilizzando questi saggi, abbiamo dimostrato danno ossidativo causata da agenti tossici nel fegato di ratti e topi 6-8 e nel cuore di ratto 10.

Il test della cometa ha molte applicazioni in tossicologia genetica e il biomonitoraggio umano: 1) come un follow-up di test in vivo per genotossine individuate dal sensibile test in vitro 3,13, 2) per valutare i meccanismi di danno al DNA xenobiotici indotto in diversi tessuti 14, 3) per verificare se unacancerogeno funziona utilizzando un una modalità non-genotossico di azione (MOA) 7 genotossico o, 4) per valutare il DNA riparazione dei danni 15, 5) per studiare le malattie umane e esposizioni professionali 16, e 6) come un potenziale test di screening high-throughput per organo-specifica genotossicità 17.

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Protocollo

Etica dichiarazione: Le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la FDA degli Stati Uniti / Centro Nazionale per la ricerca tossicologica.

NOTA: Il disegno dello studio qui descritto si basa sul protocollo sviluppato dal Centro giapponese per la convalida dei metodi alternativi (JACVAM) per la loro validazione del test in vivo roditore alcalina cometa 18, e ulteriormente modificata in base alle raccomandazioni in linea guida OECD TG489 19 .

1. Preparazione

  1. preparazione del vetrino
    1. Sciogliere regolare agarosio fusione a 1% (w / v) in tampone fosfato (Ca 2+, Mg 2+ libero e rosso fenolo libero) mediante riscaldamento in un forno a microonde.
    2. Posizionare il 1% soluzione di agarosio standard di fuso a bagnomaria C 55 ° ed equilibrare la temperatura con il bagno. microscopio in vetro tuffo scivola nella soluzione di agarosio, defluire eventuali excess agarosio e pulire la parte posteriore dei vetrini puliti. Porre i vetrini in posizione verticale su una superficie piana e consentire le diapositive ad asciugare a temperatura ambiente; memorizzare le diapositive in luogo asciutto.
  2. Preparazione delle soluzioni Comet assay
    1. Preparare 0,5% soluzione di agarosio a basso punto di fusione. Sciogliere bassofondente agarosio in tampone fosfato (Ca 2+, Mg 2+, e rosso fenolo libero) mediante riscaldamento in un forno a microonde. Mantenere la soluzione a 37-45 ° C durante la preparazione del vetrino cometa; scartare qualsiasi soluzione di agarosio rimanente dopo.
    2. Preparare Lysis buffer. Fare una soluzione 100 mM di disodio acido etilendiamminotetraacetico (EDTA disodico, il sig 372,24 g / mol), 2,5 M di cloruro di sodio (NaCl, il sig 58.44 g / mol), e 10 mm Tris idrossimetil aminomethane (Tris Base, il sig 121.14 g / mol) in acqua purificata, e regolare a pH 10 con 10 N soluzione di idrossido di sodio (NaOH, Mr 40 g / mol). Il giorno di utilizzo, aggiungere Triton X100 e dimetil solfossido (DMSO, Mr 78.13 g / mol) alla soluzione per realizzare concentrat finaleioni di 1% e 10%, rispettivamente, e mescolare a 4-10 ° C per almeno 30 minuti prima dell'uso.
    3. Fare tampone enzima fresco il giorno di utilizzo. Preparare una soluzione contenente 40 mM 2- [4- (2-idrossietil) piperazin-1-il] etansolfonico acido (HEPES, Mr 238,3 g / mol), 100 mM di cloruro di potassio (KCl, Mr 74.55 g / mol), 0,5 mM disodio EDTA e 0,2% di siero albumina bovina (BSA, Mr 66.463 g / mol) in acqua purificata. Regolare il pH a 8.0 con 10 soluzione N idrossido di potassio (KOH, 56,1 g / mol). Mescolare a RT e verifica completa dissoluzione prima dell'uso.
    4. Preparare una soluzione tampone alcalina contenente 300 mM NaOH e 1 mM EDTA bisodico in acqua purificata. Mescolare a 4-10 ° C per almeno 30 minuti prima dell'uso. Misurare il pH della soluzione prima dell'uso e assicurarsi che il pH è> 13.
    5. Preparare una soluzione di 0,4 M Tris base in acqua purificata, e regolare a pH 7,5 con acido cloridrico (HCl, il sig 36.46). Conservare la soluzione a 4-10 ° C. Questa è la neutralizzazione del buffer.
    6. Fare fResh tritare tampone il giorno di utilizzo. Preparare una soluzione contenente 20 mM di disodio EDTA e il 10% di DMSO in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, e rosso fenolo libero). Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    7. Per preparare soluzione colorante, diluire fluorescente acido soluzione macchia magazzino nucleico con Tris-borato-EDTA (TBE buffer) a 1: 10.000 (v / v). Proteggere la soluzione dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Conservare a 2-8 ° C e utilizzare con 24 hr.

2. preparazione di sospensioni singola cellula da fegato di ratto

  1. Euthanize ratti con gas CO 2 seguenti metodi consigliati nelle linee guida mediche americana veterinari per l'eutanasia degli animali: Edizione 20 del 2013.
    1. Impostare la velocità di flusso di CO 2 a 2.75. Mettere il topo nella camera di eutanasia (per esempio, vaso essiccatore, gabbia ratto con coperchio ventilato) e accendere la CO 2 aprendo la valvola del serbatoio. Attendere 1,5 a 2,5 minuti fino a quando latopo diventa incosciente. Aumentare il flusso di CO 2 sul valore massimo. Dopo la cessazione della respirazione, lasciare il topo nella camera per circa 1 min per assicurare eutanasia. Verificare l'eutanasia palpando per confermare che il topo non ha battito cardiaco, e pizzicare le dita dei piedi per determinare che il topo non ritira la sua arto.
  2. Disinfettare la capelli-pelle con il 70% di etanolo. Aprire la cavità addominale e rimuovere il fegato intatto con forbici chirurgiche. Dopo aver rimosso il fegato, rimuovere il lobo laterale sinistra dal fegato rimanendo con forbici chirurgiche. Posizionare il lobo laterale sinistro su un tagliere e tagliare due 3-4 mm di spessore sezioni trasversali adiacenti con una lama usa e getta singolo taglio di rasoio.
  3. Inserire una sezione trasversale su carta da filtro (per evitare la deformazione della sezione), e posizionare la sezione in formalina 10% neutra tamponata (NBF). Assicurarsi che il rapporto del 10% NBF al tessuto è di 10: 1 o superiore. Dopo un tempo di fissazione di almeno 72 ore, procESS fegato per istopatologia (vedi sezione 7, di seguito).
  4. Posizionare la seconda sezione trasversale di fegato in 5 ml ghiacciata buffer di macinazione (sezione 1.2.6) in una capsula di Petri 6 centimetri e risciacquare 3 volte per rimuovere residui di sangue.
  5. Trasferire la sezione di fegato di un nuovo 2 ml provetta da centrifuga contenente 1 ml di tampone macinazione ghiacciata. Macinare sezione fegato ben risciacquato, con un paio di forbici sottili per liberare le cellule. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron per rimuovere eventuali grumi di tessuto.
  6. Posizionare la sospensione singola cella in ghiaccio e utilizzare per rendere le diapositive entro 1 ora. Controllare la concentrazione di cellule contando (ad esempio, con un emocitometro o contatore di cellule elettronico) per assicurare che la sua concentrazione di circa 2 x10 6 cellule / ml.

3. Preparazione del Comet diapositive

  1. Mescolare un volume della sospensione cellulare singola con 10 volumi di fuso, 37 ° C, la soluzione di agarosio bassofondente 0,5% (sezione 1.2.1).pipetta Immediatamente 100 microlitri su un vetrino rivestito con regolare agarosio punto di fusione (punto 1.1). Porre immediatamente un vetrino sopra il composto di cellule-agarosio. Fare almeno 8 scivoli per ogni campione.
    NOTA: Tutte le diapositive devono essere identificati da un codice numerico o simili e la loro identità registrati, in modo che le diapositive possono essere segnati in cieco (vedi 6.2.2, di seguito).
  2. Posare le diapositive piatta e fredda a 4 ° C per 30 min.
  3. Dopo che il gel si è solidificato, rimuovere delicatamente il coprioggetto e immergere i vetrini in tampone di lisi pre-raffreddata (punto 1.2.2). Proteggere le diapositive dalla luce e mantenere le diapositive nel tampone di lisi a 4 ° C da 1 ora (minimo) a O / N (massimo).

4. trattamento enzimatico di Comet diapositive

  1. Rimuovere 6 degli 8 vetrini preparati da ciascun campione di tessuto dal tampone di lisi e risciacquarli 3x per 5 minuti ciascuno con tampone di enzima (punto 1.2.3) a temperatura ambiente. Utilizzare i rimanenti due scivoli per il test della cometa alcalino wenza enzima-trattamento (v 5.1, qui di seguito). Dopo il risciacquo, rimuovere il liquido in eccesso drenando e tamponando le diapositive con i tessuti.
  2. Diluire scorte enzimi hOGG1 e Endo III con tampone enzimatica a 1: 1.000 (v / v). Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  3. Applicare 200 ml di seguenti soluzioni ai vetrini preparati da ciascun gruppo di trattamento: 200 ml di tampone enzima da solo (2 scivoli usati come diapositive di riferimento), 200 soluzione ul hOGG1 (2 scivoli) o 200 ml soluzione Endo III (2 scivoli).
  4. Mettere i vetrini in piastre di Petri piene di asciugamani di carta inumidite, coprire i vetrini con Parafilm e incubare a 37 ° C per 45 minuti per Endo III-trattata e diapositive di riferimento e di 30 minuti per diapositive hOGG1-trattati.
  5. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini con acqua distillata e proseguire l'elaborazione come descritto in 5.2, di seguito.

5. svolgimento e elettroforesi

  1. Per diapositive non trattati con enzimi, rimuovere i vetrini dal tampone di lisi, Scolate le diapositive e risciacquare una volta con tampone di neutralizzazione fredda (sezione 1.2.5) per 5 minuti per rimuovere il detersivo residuo e sali.
  2. Collocare i vetrini da Piazza di 4.5 e 5.1 in modo casuale in un serbatoio di elettroforesi su gel orizzontale, evitando eventuali spazi. Riempire il serbatoio con pH> 13 buffer per elettroforesi appena fatto (punto 1.2.4) fino a quando il livello del liquido copre solo gli scivoli (evitare bolle sopra l'agarosio e assicurarsi che il serbatoio è di livello). Registrare il pH tampone e temperatura all'inizio di svolgimento DNA.
  3. Che i vetrini rimangono nel buffer alcalina per 20 minuti per consentire lo svolgimento del DNA ed espressione di danni alcalino-responsabile.
  4. Durante lo svolgimento, il programma di alimentazione per produrre 0,7 V / cm nel serbatoio elettroforesi (V / cm = Volt diviso per la distanza in cm tra gli elettrodi positivi e negativi).
  5. Dopo lo svolgimento, premere il pulsante di esecuzione sulla rete di alimentazione. Se necessario, regolare la corrente a 300 mA alzando o abbassando il livello del buffer. mantenere °livello di buffer e appena sopra la superficie delle diapositive. Eseguire elettroforesi a 4 ° C per 20 min. Registrare il posizionamento scorrevole, la temperatura del tampone e la corrente (ampere) all'inizio e alla fine di elettroforesi.
    NOTA: Troppo tampone provocherà tensioni inferiori che possono interferire con la migrazione DNA.
  6. Dopo l'elettroforesi, neutralizzare l'alcali in eccesso sollevando delicatamente i vetrini dalla vaschetta e immergendo in tampone di neutralizzazione (sezione 1.2.5) per 5 min. Scolate le diapositive e ripetere altre due volte.
  7. Fissare i vetrini immergendoli in acqua fredda 100% di etanolo per 5 min. Lasciare i vetrini si asciughino all'aria e posto in un luogo asciutto per la conservazione.

6. DNA di colorazione, Comet visualizzazione e analisi

  1. colorazione del DNA
    1. Porre i vetrini su un vassoio di cartone o di metallo e aggiungere 200 ml di soluzione colorante fluorescente di lavoro degli acidi nucleici (sezione 1.2.7) per ogni diapositiva e coprire con un vetrino di vetro. Proteggere le diapositive dallaluce consentire i vetrini di rimanere in contatto con la soluzione colorante per almeno 30 minuti prima competenza. Stain i vetrini in lotti di 20 alla volta.
    2. Prima di leggere ogni diapositiva, delicatamente macchia lontano soluzione colorante in eccesso, facendo attenzione a non disturbare il vetro di copertura.
  2. Visualizzazione Comet e punteggio
    1. Utilizzare una videocamera collegata ad un microscopio a fluorescenza per visualizzare le immagini in diretta della diapositiva cometa sul monitor del computer.
    2. Casualmente scegliere un microscopio a campo contenente cellule. Utilizzando un mouse, selezionare una cella. Fare clic sul centro della "testa della cometa" con click sinistro del mouse.
      NOTA: Il software calcola tutti i parametri di misura per la cella e aggiunge i dati in un file di dati.
    3. Punteggio tutte le cellule nel campo corrente (vedere il punto 6.2.4), e quindi utilizzare i controlli di scena del microscopio e il video sullo schermo per trovare un altro gruppo di cellule. Punteggio queste cellule come descritto al punto 6.2.2.
    4. Nota la slitta From destra a sinistra e in basso a alto. Scegliere circa 10 campi in modo casuale. Durante questo processo, qualsiasi cella cometa adatto che compare nel campo Vista risposta deve essere senza pregiudizi.
      NOTA: non segna una cometa se una delle seguenti condizioni: 1) che si trova su uno dei bordi della slitta; 2) due o più comete si sovrappongono; 3) c'è detriti nella coda; 4) il software non può distinguere tra la testa e la coda; o 5) la colorazione del nucleo e / o di coda differisce notevolmente da altre comete nella diapositiva.
      NOTA: Le comete con quasi tutta la loro fluorescenza del DNA nella coda sono spesso indicati come le comete 'riccio'. comete Hedgehog non devono essere lanciati, ma il numero di ricci rilevati durante le marcature di scorrimento devono essere registrati e riportati come percentuale di comete totali.
    5. Analizzare almeno 75 comete per vetrino, la lettura di due scivoli per organo / tessuto per ottenere almeno 150 cellule / cometa campione in totale. Dopo il numero di cellule richiesto da una diapositiva hanno essereit ha segnato, il risultato viene salvato come file di foglio di calcolo per l'analisi dei dati in seguito.

7. Analisi istopatologia

  1. Dopo un minimo di fissaggio 72 hr a 10% NBF, seguita da tessuto rifilatura 21, ordinariamente elaborare e incorporare il lobo epatico laterale sinistro dei campioni in paraffina basata media 22. Sezione campioni a circa 5 micron e raccogliere su vetrini.
  2. Macchiare le sezioni con ematossilina e eosina (H & E):
    1. Riscaldare i vetrini con le sezioni di tessuto di paraffina in forno a 60 ° per 2 ore prima della procedura di colorazione.
    2. Utilizzare xilene a Deparaffinare lati. Reidratare i vetrini con etanolo graduato (EtOH) per una esecuzione risciacquo con acqua di rubinetto.
    3. Porre i vetrini in 450 ml di ematossilina per 2 min e 40 sec. Sciacquare i vetrini con acido (acido acetico glaciale 2 ml a 450 ml di acqua deionizzata) per 4 sec seguito da 5 minuti eseguendo risciacquo con acqua di rubinetto.
    4. Posizionare il fatto scorrerees in 450 ml 70% EtOH contenente 1 ml di idrossido di ammonio per 2 minuti, seguita da risciacquo correndo acqua corrente per 2 min e 30 sec, e il 70% EtOH risciacquo per 1 min.
    5. Incubare i vetrini con 450 ml di soluzione eosina Y contenente acido acetico glaciale 4 ml per 3 min.
    6. Disidratare i vetrini con classificato EtOH. Cancellare i vetrini con xilene (tre volte 1 min ciascuna), e tenere le diapositive in xilene fino vetrini sono collocati sugli scivoli.
  3. Esaminare i vetrini al microscopio ottico, i risultati record, e grado lesioni non neoplastiche per la gravità come 1 (minimo), 2 (lieve), 3 (moderato) o 4 (marcato).
    NOTA: Il grado di gravità applicata per una lesione specifica si basa sulla proporzione relativa del fegato con la lesione (= minimal <1-15%; lieve = 16-35%; moderato = 36-60%, e ha segnato = 61- 100%).

Analisi 8. Dati

  1. L'animale è considerato l'unità sperimentale per valutazioni statistiche. danno al DNA è espressa in% DNUn in coda.
  2. danno ossidativo al DNA è calcolato come segue: le diapositive di riferimento (senza trattamento enzimatico) forniscono una stima delle rotture dei filamenti di DNA di sfondo (SB).
    NOTA: Le diapositive enzimi trattati forniscono una misura di rotture dei filamenti e basi ossidate (SB + OX). Assumendo una dose-risposta lineare per% DNA in coda in funzione del danno al DNA, sottrazione di SB da SB + OX fornisce una stima di rotture del DNA da pirimidine / purine alterati ossidati 23.
  3. Analizzare% DNA in coda come funzione della dose da ANOVA, seguita da test di Dunnett per confronti a coppie delle risposte in animali trattati al controllo del veicolo.
    NOTA: Tutte le prove sono a una coda e un valore p inferiore a 0,05 è impostato come criterio di significatività statistica.

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Risultati

Il test della cometa in vivo è stata eseguita in concomitanza con il saggio comet enzima modificato per misurare sia diretta e danno ossidativo del DNA nel fegato di ratti trattati con ciproterone acetato (CPA) 5. CPA è un farmaco ormonale sintetica che induce i tumori di fegato di ratto in maniera specifica per il sesso, con cinque volte dosi più elevate necessarie per indurre tumori al fegato nei ratti maschi rispetto alle femmine 24. Abbiamo trovato che ...

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Discussione

Questo protocollo descrive la misurazione simultanea di entrambi danno al DNA diretti e ossidativo nel fegato di ratto a livello di singola cellula. Il protocollo generale è applicabile a qualsiasi tessuto da cui singole cellule o nuclei possono essere isolati con il minimo danno al DNA trasformazione indotta (cioè, danno al DNA indotto non dal agente di test, ma dalla manipolazione e la lavorazione dei tessuti animali). Nella nostra ricerca, abbiamo condotto test della cometa alcaline su cellule dal midollo os...

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Dichiarazioni

Nessuno degli autori ha interessi in competizione o in conflitto. Le informazioni contenute in questi materiali non costituiscono una diffusione formale di informazioni da parte della FDA e non rappresentano la posizione o la politica dell'agenzia.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Prendiamo atto della pubblicazione originale dello studio CPA di Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Analisi dose-risposta sesso-specifica della genotossicità nei ratti F344 trattati con ciproterone acetato. Ricerca sulle mutazioni 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetrini coprioggetti (n. 1, 24 x 50 mm) Fisher12-544-14
Vetrini per microscopioFisher12-550-123
Dimetilsolfossido (DMSO) Fisher67-68-5
EDTA, disodicoFisherBP120-1
Soluzione salina tamponata con fosfatoFisherICN1860454
1x Soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) (Ca2+, Mg2+ libero)HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
Agarosio a basso punto di fusione ( LMP)Lonza50081NuSieve GTG Agarosio
a Fusione Normale (NMA) FisherBP1356-100
Strisce di carta per il test del pH (pH 7,5-14)FisherM95873
Cloruro di potassioFisher7447-40-7
Idrossido di potassioFisher1310-58-3
etichette per vetrini (0,94 x 0,5 pollici)FisherNC9822036
cloruro di sodio (NaCl) Fisher7647-14-5
Idrossido di sodio (NaOH) Fisher1310-73-2
SYBR&commercio; Oro InvitrogenS11494
Triton X-100 Fisher9002-93-1
Base TrizmaFisher77-86-1
Provette per microcentrifuga da 2,0 mlFisher05-402-6
Filtro cellulare (40 & micro; m)Fisher22363547
Endonucleasi III (Nth) New England BiolabsM0268SDiluizione 1:1.000
hOGG1 New England BiolabsM0241SDiluizione 1:1.000

Riferimenti

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
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  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).
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In Vivo alcalina Comet Assay e l'enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto
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