La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

Summary

L'immunoistochimica è una potente tecnica di laboratorio per valutare la localizzazione e l'espressione delle proteine all'interno dei tessuti. Gli attuali metodi semi-automatici per la quantificazione introducono soggettività e spesso creano risultati irriproducibili. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'immunoistochimica multiplexata e la quantificazione oggettiva dell'espressione proteica e della co-localizzazione mediante imaging multispettrale.

Abstract

L'immunoistochimica è una tecnica di rilevamento clinico e di ricerca comunemente usata per studiare l'espressione e la localizzazione delle proteine all'interno dei tessuti. Sono stati sviluppati molti sistemi semiquantitativi per l'analisi dei punteggi utilizzando l'immunoistochimica, ma la soggettività intrinseca limita la riproducibilità e l'accuratezza dei risultati. Inoltre, lo studio di biomarcatori spazialmente sovrapposti come i fattori di trascrizione nucleare è difficile con le attuali tecniche di immunoistochimica. Abbiamo sviluppato e ottimizzato un sistema per lo studio simultaneo di più proteine utilizzando metodi ad alto rendimento di immunoistochimica multiplexata e imaging multispettrale. L'immunoistochimica multiplexata viene eseguita mediante l'applicazione sequenziale di anticorpi primari con anticorpi secondari coniugati alla perossidasi di rafano o alla fosfatasi alcalina. Cromogeni diversi vengono utilizzati per rilevare ogni proteina di interesse. I vetrini colorati vengono caricati in uno scanner automatico per vetrini e viene creato un protocollo per l'acquisizione automatizzata delle immagini. Una libreria spettrale viene creata colorando una serie di vetrini con un singolo cromogeno su ciascuno. Un sottoinsieme di immagini colorate rappresentative viene importato nel software di imaging multispettrale e viene creato un algoritmo per distinguere il tipo di tessuto definendo i compartimenti tissutali sulle immagini. I compartimenti subcellulari vengono segmentati utilizzando la controcolorazione dell'ematossilina e regolando l'algoritmo intrinseco. La soglia viene applicata per determinare la positività e la co-localizzazione delle proteine. L'algoritmo finale viene quindi applicato all'intero set di tessuti. I dati risultanti consentono all'utente di valutare l'espressione proteica in base al tipo di tessuto (es. epiteli vs. stroma) e al compartimento subcellulare (nucleo vs. citoplasma vs. membrana plasmatica). L'analisi di co-localizzazione consente di studiare i tipi di cellule doppiamente positive, doppie e singole positive. La combinazione dell'imaging multispettrale con l'immunoistochimica multiplex e l'acquisizione automatizzata di immagini è un metodo oggettivo e ad alto rendimento per lo studio dei biomarcatori all'interno dei tessuti.

Introduction

Immunoistochimica (IHC) è una tecnica di laboratorio standard per il rilevamento di proteine ​​nei tessuti, e IHC è ancora ampiamente utilizzato sia nella ricerca e patologia diagnostica. La valutazione di IHC colorazione è spesso semi-quantitativa, l'introduzione di potenziali bias in interpretazione dei risultati. Molti approcci semi-quantitativi sono stati sviluppati che incorporano sia l'intensità di colorazione e misura colorazione in diagnosi finale ^1-4. Altri sistemi includono intensità punteggio e posizione subcellulare al fine di localizzare meglio l'espressione ^5. Incorporazione di punteggi medi da più spettatori è sp....

Protocol

NOTA: Il protocollo descrive qui colorazione e analisi di un microarray tissutale (TMA), precedentemente descritto ^12,17,18. La spessa sezione TMA 4 micron è stato ottenuto da un blocco di paraffina utilizzando un microtomo standard.

NOTA: Una libreria spettrale per i 4 cromogeni e di contrasto deve essere creato per un'immagine quantificazione. Per fare questo, il protocollo ottimizzato per ciascun anticorpo deve essere eseguito con un anticorpo per vetrino, meno la controcolorazione finale. Un quinto diapositiva deve essere colorato con ematossilina per generare le 5 immagini necessarie per creare la libreria spettrale.

1. Multiplex imm....

Results

In figura 1, la formazione viene eseguito sui tessuti della prostata per immagini segmento in porzioni epiteliali e stromali, insieme con il vano non tessuto. Utilizzando il marcatore epiteliale di membrana E-caderina, la segmentazione delle cellule è stata eseguita per separare il nucleo, il citoplasma, e porzioni di membrana, mostrate nella Figura 2.

In un esperimento, abbiamo usato multipla.......

Discussion

L'uso di immunoistochimica tradizionale per valutare l'espressione della proteina è limitata dalla metodi semiquantitativi soggettivi di analisi ^22,23. piattaforme Advance sono stati creati per l'analisi high-throughput di espressione biomarker e la localizzazione. la segmentazione dettagliata di entrambi i tessuti e compartimenti subcellulari consente agli utenti di studiare l'espressione biomarker, la localizzazione, e co-localizzazione con altri marcatori di interesse. In studi precedenti, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3F1GAL	Valutazione NFPA: Salute – 2, Fuoco – 3 , Reattività – 0
Alcol etilico-200 proof	Fisher Scientific 4355223		Valutazione NFPA: Salute – 0, Fuoco – 3 , Reattività – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Valutazione NFPA: Salute – 2, Fuoco – 0 , Reattività – 0
Tris idrossimetilamnometano HCl	Fisher Scientific	BP153-1	Valutazione NFPA: Salute – 2, Fuoco – 0 , Reattività – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	Valutazione NFPA: Salute – 0, Fuoco – 1 , Reattività – 0
Soluzione salina tamponata con fosfato	Fisher Scientific	BP2944-100	Valutazione NFPA: Salute – 1, Fuoco – 0 , Reattività – 0
Perossidato	Biocare Medical	PX968	Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Può causare irritazioni cutanee e danni agli occhi.
Recettore degli estrogeni alfa	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	Non classificato come pericoloso
Recettore degli androgeni	SCBT	sc-816	Non classificato come pericoloso
CD147	Biodesign	P87535M	Non classificato come pericoloso
E-caderina	Dako	M3612	Non classificato come pericoloso
Renoir Red Andibody Diluente	Biocare Medical	PD904	È appositamente progettato per funzionare con anticorpi a base di Tris
DeCloaking Chamber	Biocare Medical	Model DC2002	Prendere le normali precauzioni per l'utilizzo di una pentola a pressione
Barrier pen-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000-Fase
di eluizione	Biocare Medical	DNS001H	Non classificato come pericoloso
Mach 2 Capra anti-coniglio HRP Polimero	Biocare Medical	RHRP520	Non classificato come pericoloso
Mach 2 Capra anti-coniglio AP Polimero	Biocare Medical	RALP525	Non classificato come pericoloso
Mach 2 Capra anti-Topo HRP Polimero	Biocare Medical	M3M530	Non classificato come pericoloso
Kit di cromogeni Betazoidi DAB	Biocare Medical	BDB2004	1. Il DAB è noto per essere un sospetto cancerogeno. 2. Non esporre i componenti DAB a luce intensa o alla luce diretta del sole. 3. Indossare dispositivi e indumenti di protezione individuale adeguati. 4. Il DAB può causare sensibilizzazione della pelle. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. 5. Osservare tutte le normative federali, statali e locali in materia di smaltimento
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	Corrosivo. Acido che può causare irritazione della pelle o danni agli occhi.
Kit cromogeno verde Vina	Biocare Medical	BRR807	Dannoso se ingerito
Kit cromogeno viola Bajoran	Biocare Medical	BJP807	Liquido infiammabile. Tenere lontano da fonti di calore, fiamme e scintille. Nocivo per ingestione o assorbimento. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi ed evitare l'inalazione.
Gatto Ematossilina	Biocare Medico	CATHE	Viola   soluzione   con   a   lieve   acetico   acido   (aceto)   profumo.   Maggio   be   irritante   per   pelle   oppure   occhi.   Evitare   Contatto   con   pelle   e   occhi.   Evitare   ingestione.
Supporti di montaggio XYL	Richard Allen	8312-4	Valutazione NFPA: Salute - 2, Fuoco - 3 , Reattività - 0
1.5 Vetrini coprioggetti	Fisher Brand	22266858	Spigoli vivi
Incubazione (Umidità) Camera	obsoleta obsoleta		Più fornitori disponibili
Forno a convezione	Stabil- Therm	C-4008-Q
Sfondo Reagente bloccante Punitore	Biocare Medical	BP974	Questo prodotto non è classificato come pericoloso.
Software inForm	PerkinElmer	CLS135781	Software di imaging multispettrale primario utilizzato nel software
Nuance Software	PerkinElmer	Nuance EX	Software utilizzato per creare librerie spettrali all'interno
microscopio e scanner per vetrini Vectra	PerkinElmer	VECTRA	Scanner e microscopio automatizzato per vetrini per ottenere cubi di immagini IM3