Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di Burnetii Coxiella

Summary

Abbiamo descritto qui un semplice metodo di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) utilizzando reagenti liofilizzati per la rilevazione di C. burnetii in campioni di pazienti.

Abstract

Coxiella burnetii, l'agente che causa la febbre Q, è un batterio intracellulare obbligato. Saggi diagnostici basati sulla PCR sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici. PCR richiede attrezzature specializzate ed estesa formazione degli utenti finali, e quindi non è adatto per il lavoro di routine specialmente in una zona risorse limitate. Abbiamo sviluppato un saggio loop-mediata di amplificazione isotermica (LAMP) per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di pazienti. Questo metodo viene effettuata ad una sola temperatura di circa 60 ° C in un bagnomaria o riscaldamento. La sensibilità di questo test LAMP è molto simile a PCR con un limite di rilevazione di circa 25 copie per reazione. La relazione descrive la preparazione della reazione con reagenti liofilizzati e visualizzazione dei risultati usando blu di idrossinaftolo (HNB) o una lampada UV con colorante fluorescente intercalante nella reazione. I reagenti LAMP erano lyophilized e conservato a temperatura ambiente (RT) per un mese senza perdita di sensibilità di rilevazione. Questo test è particolarmente robusta LAMP perché la preparazione della miscela di reazione non comporta complessi passaggi. Questo metodo è ideale per l'utilizzo in ambienti con risorse limitate, dove la febbre Q è endemica.

Introduction

Il piccolo batterio Gram-negativi Coxiella burnetii è l'agente eziologico della febbre Q, che è una zoonosi in tutto il mondo. A causa della distribuzione a livello mondiale di febbre Q e l'alta infettività di C. burnetii, militari e civili personale statunitense dispiegate all'estero sono a rischio di infezione nelle zone endemiche.

La febbre Q si manifesta in due forme: infezioni acute e croniche. Acuta febbre Q si presenta con sintomi simil-influenzali, l'epatite, o polmonite, ed è di solito una malattia autolimitante con un basso tasso di mortalità. Cronica febbre Q, mentre meno diffuso, si traduce sp....

Protocol

1. Preparare plasmidi DNA diluizioni come standard per LAMP Reazione

1. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica (OD) a 260 nm per determinare il plasmide (contenente gene target IS1111a di C. burnetii RSA 493) concentrazione di DNA. Un OD ₂₆₀ di 1 equivale a 50 mg / mL di DNA.
2. Convertire la quantità di DNA plasmide nel numero di copie. Poiché la dimensione del plasmide è 6.330 bp, il peso molecolare di questo plasmide è 4,1 x 10 ⁶ g (6.330 bp x 649 g / bp). La concentrazione di DNA del plasmide è 34,2 ng / ml (come determinato dal punto 1.1). 1 ml di questo campione di DNA contiene 34,2 ....

Results

I reagenti LAMP liofilizzati all'interno del tubo 0,2 ml contiene polimerasi Bst DNA, primer, e dNTP. 20 microlitri di tampone di ricostituzione è usato per risospendere i reagenti liofilizzati. La Figura 1 mostra i risultati di reazione LAMP su gel di agarosio con reagenti appena preparati e reagenti liofilizzati. Il reagente liofilizzato non riduce la sua attività. Reazioni LAMP preparati da entrambi i reagenti in grado di rilevare 25 copie del DNA stampo.

Discussion

In precedenza, abbiamo sviluppato un saggio LAMP sensibile e specifico mira l'elemento di inserimento IS1111a ^14. L'elemento IS1111 è stato scelto perché è altamente conservata tra i diversi ceppi di C. burnetii e il suo alto numero di copie (7-110) nei batteri (Klee 2006). I nostri risultati hanno mostrato che LAMP può rilevare circa 25 copie dell'elemento IS1111, che può correlare il meno una copia cromosomale di Coxiella DNA. In questo studio, polime.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primer LAMP	Eurofins MWG operone	10 nmol, senza sale	Sequenza progettata dal cliente
Bst DNA polimerasi	New England Biolabs	M0275L	8 unità/ml
10x Thermo pol	tampone New England Biolabs	B9004S
miscela dNTP	New England Biolabs	N0447L	10 mM ciascuno
Betaina	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimetilglicina
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	tampone di caricamento gel
SYBR verde	Invitrogen	S7585	10.000x, visualizzare i prodotti in tubi
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10.000x, visualizzare i prodotti in gel
Reagenti liofilizzati	Gene Reach
Idrossinaptolo blu	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		rilevamento in tempo reale