Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.
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Articolo metodologico
Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali
In questo articolo
Sommario
Abstract
preferenze di integrazione firma retrovirus presentano su entrambi i scala locale e globale. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per (1) generazione di diverse librerie di siti di integrazione retrovirali che utilizzano amplificazione PCR legatura-mediata (LM-PCR) e di sequenziamento di prossima generazione (NGS), (2) la mappatura della posizione genomica di ogni virus- ospitare giunzione con BEDTools, e (3) analizzare i dati per rilevanza statistica. Il DNA genomico estratto da cellule infette è frammentata mediante digestione con enzimi di restrizione o mediante ultrasuoni. Dopo adatto DNA finale di riparazione, linker a doppio filamento sono legatura sul conclude il DNA, e semi-nested PCR è condotta utilizzando primer complementari sia per il long terminal repeat (LTR) fine del virus e il DNA linker legatura. I primer PCR portano sequenze necessarie per il clustering DNA durante NGS, negando la necessità di legatura adattatore separato. Il controllo di qualità (QC) è condotto per valutare il DNA di distribuzione dimensione del frammento e adattarsier l'incorporazione del DNA prima di NGS. file di output di sequenza vengono filtrati per LTR contenenti legge, e le sequenze che definiscono il LTR e il linker sono tagliate via. sequenze di cellule ospitanti rasata vengono mappati a un genoma di riferimento utilizzando BLAT e sono filtrati per minimo 97% di identità di un unico punto di riferimento nel genoma. siti di integrazione unici sono esaminati per adiacenti nucleotidi (nt) sequenza e di distribuzione relativi a varie caratteristiche genomiche. Usando questo protocollo, le biblioteche sito di integrazione di elevata complessità possono essere costruiti da DNA genomico in tre giorni. L'intero protocollo che comprende infezione virale esogena di cellule di coltura tissutale suscettibili di analisi sito di integrazione può quindi essere condotta in circa una o due settimane. Recenti applicazioni di questa tecnologia riguardano analisi longitudinale dei siti di integrazione da pazienti affetti da HIV.
Introduzione
L'integrazione del DNA virale (vDNA) nel genoma della cellula ospite è un passo essenziale nel ciclo di vita retrovirale. L'integrazione viene eseguita l'integrasi virale (IN), che svolge due processi catalitici distinti che portano alla creazione del provirus stabilmente inserita 1. IN subunità impegnare le estremità della vDNA lineare che viene generato attraverso trascrizione inversa, formando la intasome ordine superiore con vDNA estremità tenuto insieme da un multimero IN 2-4. IN unirà 'estremità del vDNA valle invarianti 5'-CA-3' del 3 sequenze in un processo noto come 3'-processing, lasciando incasso 3 'ter....
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Protocollo
1. Generare le riserve di virus
Nota: Un diagramma di flusso dell'aspetto panchina bagnata di questo protocollo è illustrato nella Figura 1 I dati di archivio di produzione virale e successiva infezione di cellule di coltura tissutale generalmente applicabile a diverse tipologie di retrovirus.. Per alcuni esperimenti, la cellula bersaglio non può esprimere il recettore virale endogena (s), e in tali casi la costruzione di particelle retrovirali pseudotyped ospitano eterologa glicoproteina virale, ad esempio la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), sarà necessaria per l'infezione
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Risultati
Tabella 4 elenca i risultati di un esperimento rappresentativo per illustrare la sensibilità di NGS per il recupero di siti di integrazione da una coltura di cellule infette. DNA cellulare non infetti è stata utilizzata per diluire serialmente DNA genomico da una infezione, in cui ogni cellula in media conteneva un integrazione 40. Le diluizioni sono stati preparati a passi di cinque a una diluizione massima di 1: 15.625. DNA genomico della serie titolazione è.......
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Discussione
Un protocollo per l'analisi dei siti di integrazione retrovirali, dalla fase virus iniziale fino mappatura dei modelli di distribuzione genomici, è descritto. Questo protocollo è applicabile a qualsiasi retrovirus e qualsiasi tipo di cellula infettabili. Inoltre, la conduttura dosaggio è molto sensibile, con la possibilità di recuperare un numero soddisfacente di integrazione siti unici da diluizioni seriali di DNA genomico equivalente a quella di una infezione avviato con una MOI di 6,4 x 10 -5. Questa s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati ai nostri colleghi Stephen Hughes e Henry Levin per un consiglio che è stato fondamentale per stabilire il protocollo di NGS per retrovirale sito di integrazione sequenziamento in laboratorio Engelman. Questo lavoro è stato sostenuto da Stati Uniti National Institutes of Health concede AI039394 e AI052014 (a ANE) e AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11965-084 | Terreno di coltura cellulare standard, compatibile con cellule HEK293T |
| Siero fetale bovino | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Potrebbe essere necessario effettuare un pre-screening di diversi lotti di siero per una produzione virale ottimale |
| Penicillina/streptomicina | Corning | 30-002-Cl | Antibiotici da aggiungere alla |
| soluzione salina tamponata con fosfato | Mediatech | 21-040-CV | Utilizzato per lavare le cellule |
| Tripsina EDTA | Corning | 25-053-CI | Utilizzato per staccare le cellule aderenti dalle piastre di coltura tissutale |
| PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | Reagente di trasfezione del DNA |
| 0,45 &; m Filtri | Thermo Scientific | 09-740-35B | Utilizzato per filtrare terreni di coltura cellulare contenenti particelle virali |
| Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Utilizzato per degradare il DNA plasmidico di carryover da stock virali |
| HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Utilizzato per quantificare la resa della produzione virale |
| DNeasy Blood & Kit di tessuti | Qiagen | 69506 | Utilizzato per purificare il DNA genomico dalle cellule |
| Sonicatore | Covaris | S2 | Con questo modello di sonicatore si eseguono due cicli di ciclo di lavoro, 5%; intensità, 3; cicli per raffica, 200; tempo, 80 sec |
| Acqua priva di nucleasi | GeneMate | G-3250-125 | consiglia di utilizzare l'acqua disponibile in commercio per ridurre la possibilità di contaminazione incrociata del campione |
| Purificazione QIAQuick PCR Kit | Qiagen | 28106 | Utilizzato per purificare il DNA durante la costruzione della libreria |
| End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Utilizzato per riparare le estremità del DNA di campioni di DNA sonicati |
| Frammento di Klenow (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Utilizzato con dATP a frammenti di DNA riparati con coda A |
| dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deossiadenosina trifosfato |
| MseI | NEB | R0525L | Endonucleasi di restrizione per la scissione genomica del DNA |
| BglII | NEB | R0144L | Endonucleasi di restrizione per sopprimere l'amplificazione della sequenza HIV-1 U5 a monte T4 |
| DNA Ligasi | NEB | M0202L/6218 | Enzima per l'unione covalente di estremità di DNA compatibili |
| Oligonucleotidi di DNA Tecnologie | di DNA integrate | su misura | Chiedi all'azienda di purificare gli oligo. La purificazione HPLC è sufficiente per i DNA < 30 nucleotidi; PAGE purifica i DNA più a lungo |
| Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Miscela commerciale contenente DNA polimerasi per PCR |
| dNTP (soluzioni da 100 mM) | Thermo Scientific | R0181 | Diluire le quattro sostanze chimiche su ghiaccio con acqua sterile per raggiungere le concentrazioni intermedie di 2,5 mM ciascuna dNTP |
| Spettrofotometro NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | per la determinazione della concentrazione |
| di DNAFluorimetro Qubit Life | Technologies | Qubit® 3.0 | utilizzato per confermare la concentrazione di DNA nella libreria del sito |
| di integrazione 2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Saggio basato su nastro per confermare la distribuzione dimensionale del DNA della libreria del sito di integrazione |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Utilizzato per NGS |
Riferimenti
- Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
- Hare, S., Gupta, S.....
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Ristampe e permessi
