Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Summary

Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.

Abstract

preferenze di integrazione firma retrovirus presentano su entrambi i scala locale e globale. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per (1) generazione di diverse librerie di siti di integrazione retrovirali che utilizzano amplificazione PCR legatura-mediata (LM-PCR) e di sequenziamento di prossima generazione (NGS), (2) la mappatura della posizione genomica di ogni virus- ospitare giunzione con BEDTools, e (3) analizzare i dati per rilevanza statistica. Il DNA genomico estratto da cellule infette è frammentata mediante digestione con enzimi di restrizione o mediante ultrasuoni. Dopo adatto DNA finale di riparazione, linker a doppio filamento sono legatura sul conclude il DNA, e semi-nested PCR è condotta utilizzando primer complementari sia per il long terminal repeat (LTR) fine del virus e il DNA linker legatura. I primer PCR portano sequenze necessarie per il clustering DNA durante NGS, negando la necessità di legatura adattatore separato. Il controllo di qualità (QC) è condotto per valutare il DNA di distribuzione dimensione del frammento e adattarsier l'incorporazione del DNA prima di NGS. file di output di sequenza vengono filtrati per LTR contenenti legge, e le sequenze che definiscono il LTR e il linker sono tagliate via. sequenze di cellule ospitanti rasata vengono mappati a un genoma di riferimento utilizzando BLAT e sono filtrati per minimo 97% di identità di un unico punto di riferimento nel genoma. siti di integrazione unici sono esaminati per adiacenti nucleotidi (nt) sequenza e di distribuzione relativi a varie caratteristiche genomiche. Usando questo protocollo, le biblioteche sito di integrazione di elevata complessità possono essere costruiti da DNA genomico in tre giorni. L'intero protocollo che comprende infezione virale esogena di cellule di coltura tissutale suscettibili di analisi sito di integrazione può quindi essere condotta in circa una o due settimane. Recenti applicazioni di questa tecnologia riguardano analisi longitudinale dei siti di integrazione da pazienti affetti da HIV.

Introduction

L'integrazione del DNA virale (vDNA) nel genoma della cellula ospite è un passo essenziale nel ciclo di vita retrovirale. L'integrazione viene eseguita l'integrasi virale (IN), che svolge due processi catalitici distinti che portano alla creazione del provirus stabilmente inserita ^1. IN subunità impegnare le estremità della vDNA lineare che viene generato attraverso trascrizione inversa, formando la intasome ordine superiore con vDNA estremità tenuto insieme da un multimero IN ^2-4. IN unirà 'estremità del vDNA valle invarianti 5'-CA-3' del 3 sequenze in un processo noto come 3'-processing, lasciando incasso 3 'ter....

Protocol

1. Generare le riserve di virus

Nota: Un diagramma di flusso dell'aspetto panchina bagnata di questo protocollo è illustrato nella Figura 1 I dati di archivio di produzione virale e successiva infezione di cellule di coltura tissutale generalmente applicabile a diverse tipologie di retrovirus.. Per alcuni esperimenti, la cellula bersaglio non può esprimere il recettore virale endogena (s), e in tali casi la costruzione di particelle retrovirali pseudotyped ospitano eterologa glicoproteina virale, ad esempio la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), sarà necessaria per l'infezione

Results

Tabella 4 elenca i risultati di un esperimento rappresentativo per illustrare la sensibilità di NGS per il recupero di siti di integrazione da una coltura di cellule infette. DNA cellulare non infetti è stata utilizzata per diluire serialmente DNA genomico da una infezione, in cui ogni cellula in media conteneva un integrazione ^40. Le diluizioni sono stati preparati a passi di cinque a una diluizione massima di 1: 15.625. DNA genomico della serie titolazione è.......

Discussion

Un protocollo per l'analisi dei siti di integrazione retrovirali, dalla fase virus iniziale fino mappatura dei modelli di distribuzione genomici, è descritto. Questo protocollo è applicabile a qualsiasi retrovirus e qualsiasi tipo di cellula infettabili. Inoltre, la conduttura dosaggio è molto sensibile, con la possibilità di recuperare un numero soddisfacente di integrazione siti unici da diluizioni seriali di DNA genomico equivalente a quella di una infezione avviato con una MOI di 6,4 x 10 ^-5. Questa s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-084	Terreno di coltura cellulare standard, compatibile con cellule HEK293T
Siero fetale bovino	Thermo Scientific	SH 30088.03	Potrebbe essere necessario effettuare un pre-screening di diversi lotti di siero per una produzione virale ottimale
Penicillina/streptomicina	Corning	30-002-Cl	Antibiotici da aggiungere alla
soluzione salina tamponata con fosfato	Mediatech	21-040-CV	Utilizzato per lavare le cellule
Tripsina EDTA	Corning	25-053-CI	Utilizzato per staccare le cellule aderenti dalle piastre di coltura tissutale
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	Reagente di trasfezione del DNA
0,45 &; m Filtri	Thermo Scientific	09-740-35B	Utilizzato per filtrare terreni di coltura cellulare contenenti particelle virali
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Utilizzato per degradare il DNA plasmidico di carryover da stock virali
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay	ABL Inc.	5447	Utilizzato per quantificare la resa della produzione virale
DNeasy Blood & Kit di tessuti	Qiagen	69506	Utilizzato per purificare il DNA genomico dalle cellule
Sonicatore	Covaris	S2	Con questo modello di sonicatore si eseguono due cicli di ciclo di lavoro, 5%; intensità, 3; cicli per raffica, 200; tempo, 80 sec
Acqua priva di nucleasi	GeneMate	G-3250-125	consiglia di utilizzare l'acqua disponibile in commercio per ridurre la possibilità di contaminazione incrociata del campione
Purificazione QIAQuick PCR Kit	Qiagen	28106	Utilizzato per purificare il DNA durante la costruzione della libreria
End-It DNA End-Repair Kit	Epicentre	ER81050	Utilizzato per riparare le estremità del DNA di campioni di DNA sonicati
Frammento di Klenow (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Utilizzato con dATP a frammenti di DNA riparati con coda A
dATP	Thermo Scientific	R0141	Deossiadenosina trifosfato
MseI	NEB	R0525L	Endonucleasi di restrizione per la scissione genomica del DNA
BglII	NEB	R0144L	Endonucleasi di restrizione per sopprimere l'amplificazione della sequenza HIV-1 U5 a monte T4
DNA Ligasi	NEB	M0202L/6218	Enzima per l'unione covalente di estremità di DNA compatibili
Oligonucleotidi di DNA Tecnologie	di DNA integrate	su misura	Chiedi all'azienda di purificare gli oligo. La purificazione HPLC è sufficiente per i DNA < 30 nucleotidi; PAGE purifica i DNA più a lungo
Advantage 2 Polymerase Mix	Clontech	639202	Miscela commerciale contenente DNA polimerasi per PCR
dNTP (soluzioni da 100 mM)	Thermo Scientific	R0181	Diluire le quattro sostanze chimiche su ghiaccio con acqua sterile per raggiungere le concentrazioni intermedie di 2,5 mM ciascuna dNTP
Spettrofotometro NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	per la determinazione della concentrazione
di DNAFluorimetro Qubit Life	Technologies	Qubit® 3.0	utilizzato per confermare la concentrazione di DNA nella libreria del sito
di integrazione 2200 TapeStation System	Agilent	G2964AA	Saggio basato su nastro per confermare la distribuzione dimensionale del DNA della libreria del sito di integrazione
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Utilizzato per NGS