Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Sommario

Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.

Abstract

preferenze di integrazione firma retrovirus presentano su entrambi i scala locale e globale. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per (1) generazione di diverse librerie di siti di integrazione retrovirali che utilizzano amplificazione PCR legatura-mediata (LM-PCR) e di sequenziamento di prossima generazione (NGS), (2) la mappatura della posizione genomica di ogni virus- ospitare giunzione con BEDTools, e (3) analizzare i dati per rilevanza statistica. Il DNA genomico estratto da cellule infette è frammentata mediante digestione con enzimi di restrizione o mediante ultrasuoni. Dopo adatto DNA finale di riparazione, linker a doppio filamento sono legatura sul conclude il DNA, e semi-nested PCR è condotta utilizzando primer complementari sia per il long terminal repeat (LTR) fine del virus e il DNA linker legatura. I primer PCR portano sequenze necessarie per il clustering DNA durante NGS, negando la necessità di legatura adattatore separato. Il controllo di qualità (QC) è condotto per valutare il DNA di distribuzione dimensione del frammento e adattarsier l'incorporazione del DNA prima di NGS. file di output di sequenza vengono filtrati per LTR contenenti legge, e le sequenze che definiscono il LTR e il linker sono tagliate via. sequenze di cellule ospitanti rasata vengono mappati a un genoma di riferimento utilizzando BLAT e sono filtrati per minimo 97% di identità di un unico punto di riferimento nel genoma. siti di integrazione unici sono esaminati per adiacenti nucleotidi (nt) sequenza e di distribuzione relativi a varie caratteristiche genomiche. Usando questo protocollo, le biblioteche sito di integrazione di elevata complessità possono essere costruiti da DNA genomico in tre giorni. L'intero protocollo che comprende infezione virale esogena di cellule di coltura tissutale suscettibili di analisi sito di integrazione può quindi essere condotta in circa una o due settimane. Recenti applicazioni di questa tecnologia riguardano analisi longitudinale dei siti di integrazione da pazienti affetti da HIV.

Introduzione

L'integrazione del DNA virale (vDNA) nel genoma della cellula ospite è un passo essenziale nel ciclo di vita retrovirale. L'integrazione viene eseguita l'integrasi virale (IN), che svolge due processi catalitici distinti che portano alla creazione del provirus stabilmente inserita ^1. IN subunità impegnare le estremità della vDNA lineare che viene generato attraverso trascrizione inversa, formando la intasome ordine superiore con vDNA estremità tenuto insieme da un multimero IN ^2-4. IN unirà 'estremità del vDNA valle invarianti 5'-CA-3' del 3 sequenze in un processo noto come 3'-processing, lasciando incasso 3 'termina con gruppi ossidrile reattivi ad ogni vDNA capolinea ^5-8. Il intasome viene successivamente importato nel nucleo come parte di una grande assemblea di host e proteine ​​virali conosciuti come il complesso preintegrazione (PIC) ^9-11. Dopo aver incontrato bersaglio cellulare del DNA (tDNA), IN utilizza il vDNA 3'-idrossile group per fendere l'alto tDNA e fili di fondo in modo sfalsato e, contemporaneamente, si unisce la vDNA di tDNA 5 'gruppi fosfato attraverso il processo di trasferimento strand ^12,13.

preferenze del sito di integrazione mostra retrovirus sulle scale locale e globale. Localmente, siti di integrazione consenso consistono debolmente conservati sequenze palindromi tDNA che si estendono da circa 9:55 bp a monte ed a valle dei siti di inserzione vDNA ^14,15. A livello globale, i retrovirus bersaglio specifiche annotazioni della cromatina ^16. Ci sono sette diversi generi retrovirale - alpha attraverso epsilon, lenti, e spuma. I lentivirus, che comprendono l'HIV-1, favoriscono l'integrazione in seno agli organi di geni attivamente trascritti ^17, mentre i gammaretroviruses preferenzialmente si integrano all'interno di siti o di trascrizione di inizio (Tsss) e regioni enhancer attivi ^18-20. In netto contrasto, spumavirus è fortemente sbilanciata verso heterochromregioni ATIC, come ad esempio i domini lamina associata gene-poveri ^21. Preferenze di base tDNA locali sono in gran parte dettato da specifiche reti di contatti nucleoproteici tra IN e tDNA ^13,22,23. Per i lentivirus e gammaretroviruses, l'integrazione relativa alle annotazioni genomiche è in gran parte governato da interazioni tra IN e fattori cellulari affini ^24-27. Alterare le specifiche di interazione di rete IN-tDNA ^13,22,23,28 e interrompere o re-engineering IN-host interazioni tra fattori ^25-27,29-32 hanno dimostrato strategie per retarget l'integrazione a livello locale e globale, rispettivamente.

Il potere delle procedure di sequenziamento del DNA utilizzate per catalogare i siti di integrazione retrovirali è aumentata enormemente negli ultimi decenni. Siti di integrazione sono stati recuperati in un lavoro pionieristico con la purificazione laborioso e tecniche di clonazione manuali per produrre solo una manciata di siti unici al ^33,34 studio.La combinazione di LM-PCR amplificazione del DNA giunzioni LTR-ospite con la possibilità di mappare singoli siti di integrazione a genomi progetti topo umani e trasformate campo, con il numero di siti recuperati da infezioni cellule di coltura tissutale esogeno aumentando a diverse centinaia di migliaia ^{17 , 18.} La recente fusione di più di LM-PCR con metodologia NGS ha inviato profondità biblioteca alle stelle. In particolare, pyrosequencing ha dato l'ordine di decine di migliaia di siti di integrazione unici ^30,35-38, mentre le librerie in sequenza attraverso l'uso di cluster DNA può produrre milioni di sequenze uniche ^19-21,39. Qui si descrive un protocollo ottimizzato LM-PCR per amplificare e sequenziare siti di integrazione retrovirali che utilizzano NGS di clustering DNA. Il metodo incorpora richiesto sequenze di adattamento nei primer PCR e, quindi, direttamente nelle molecole di DNA amplificati, precludendo in tal modo la necessità di un passaggio adattatore legatura aggiuntivo prima Sequencing ^40. L'analisi bioinformatica gasdotto, dalla analisi dei dati di sequenziamento prime per LTR-ospite DNA giunzioni alla mappatura dei siti di integrazione uniche osservazione a caratteristiche genomiche, è anche generalmente descritto. In conformità con la priorità stabilita da precedenti protocolli metodologici in questo campo ^36,38,41-43, script personalizzati possono essere sviluppati che contribuisca alla realizzazione di interventi specifici in cantiere bioinformatica. L'utilità e la sensibilità del protocollo è illustrato con dati rappresentativi amplificando, sequenziamento, e mappatura HIV-1 siti di integrazione da colture cellulari infettate alla molteplicità approssimativa di infezione (MOI) di 1,0, nonché una serie di titolazione di questo DNA diluita attraverso DNA cellulare non infetta in 5 volte procedura a una diluizione di 1: 15,625 per dare il approssimativa equivalente MOI di 6,4 x 10 ^-5.

Protocollo

1. Generare le riserve di virus

Nota: Un diagramma di flusso dell'aspetto panchina bagnata di questo protocollo è illustrato nella Figura 1 I dati di archivio di produzione virale e successiva infezione di cellule di coltura tissutale generalmente applicabile a diverse tipologie di retrovirus.. Per alcuni esperimenti, la cellula bersaglio non può esprimere il recettore virale endogena (s), e in tali casi la costruzione di particelle retrovirali pseudotyped ospitano eterologa glicoproteina virale, ad esempio la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), sarà necessaria per l'infezione ^44,45.

Nota: Precauzione dovrebbe essere presa quando si lavora con HIV-1. Anche se le linee guida specifiche variano da istituto ad istituto, tutti i lavori di virus a base dovrebbe essere condotto in una cappa di sicurezza biologica dedicato dell'operatore limitato (di solito indicato come una cappa coltura tissutale). dispositivi di protezione individuale correttache comprende la faccia, copriscarpe, un doppio strato guanto, e un abito tuta tutto il corpo deve essere indossato in ogni momento. Tutti i rifiuti liquidi derivanti da esperimenti legati ai virus deve essere inattivato con candeggina (concentrazione finale 10%), e tutti i rifiuti solidi tra cui dovrebbe essere autoclavato prima dello smaltimento.

1. Un giorno prima della trasfezione, piastra di 3,3 x 10 ⁶ cellule HEK293T in 10 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml magazzino) in ciascuna delle cinque 100 piatti mm.
   Nota: Integrato-DMEM è indicato come DMEM-FPS da questo punto in poi.
2. Nel giorno successivo, trasfezione le cellule con 10 microgrammi di plasmide portare full-length cloni molecolari retrovirali o 9 mg di vettori turno unico busta-cancellato con 1 mg di un'espressione costrutto VSV-G utilizzando reagenti di trasfezione disponibili in commercio o fosfato di calcio.
   1. Incubare la cells a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura cellulare con 5% di CO ₂ (questa condizione di seguito denominato "il tessuto cultura incubatore"). Dopo circa 48 ore, raccogliere il supporto delle cellule virus contenente con una pipetta volumetrica e farla passare attraverso un filtro da 0,45 micron dal flusso di gravità.
   2. Concentrare il virus ultracentrifugazione a 200.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Risospendere il pellet virus in 500 microlitri DMEM-FPS contenente 20 U DNasi, e incubare per 1 ora a 37 ° C.
      Nota: Il passo DNasi aiuta a ridurre il recupero di sequenze plasmide indesiderate eliminando il peso di DNA plasmidico che persiste dalla procedura di trasfezione.
3. Determinare la concentrazione p24 ⁴⁶ utilizzando un antigene p24 kit di cattura da HIV-1 come da istruzioni del produttore.
   Nota: la concentrazione di virus può essere determinato anche da attività di trascrittasi inversa test ^47,48. In alternativa, il livello del virus funzionale puòessere determinata misurando MOI. Questo è più facilmente fatto usando cellule fluorescenza-attivato l'ordinamento con i virus che esprimono geni reporter fluorescenti come la proteina fluorescente verde. determinazione MOI può essere particolarmente utile quando si lavora con le cellule primarie che potrebbero non supportare lo stesso livello di infezione da linee cellulari ottimizzate.

2. Le cellule infettano con il virus

1. Piastra 3.0 x 10 ⁵ cellule HEK293T per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in 2,5 ml DMEM-FPS e incubare una notte in un incubatore di coltura tissutale.
   Nota: Il numero di siti di integrazione unici recuperati con questo protocollo è direttamente proporzionale al numero di cellule e la quantità di virus attivo utilizzati nella infezione.
2. Infettare le cellule con una concentrazione finale p24 virale di 500 ng / ml in un volume finale di 500 microlitri fresca DMEM-FPS per 2 ore in un tessuto culturale incubatore, quindi aggiungere 2 ml di DMEM-FPS pre-riscaldato a 37 ° C al bene e continuare l'incubazione.
3. A48 ore dopo l'infezione, rimuovere i media e lavare le cellule con 2 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA pre-riscaldato a 37 ° C, dopo un paio di secondi ispezionare visivamente i pozzetti per dislocazione delle cellule.
4. Aggiungere 2 ml di pre-riscaldato DMEM-FPS e risospendere le cellule di dolce su / giù pipettaggio con una pipetta volumetrica ~ 10 volte. Trasferire la soluzione a 75 cm pallone di coltura tissutale ² contenente 18 ml di pre-riscaldato DMEM-FPS, e incubare le cellule in un tessuto culturale incubatore.
5. Dopo minimamente cinque giorni dall'inizio dell'infezione, raccogliere le cellule rimuovendo il materiale, lavare con 5 ml di PBS, aggiungere 2 ml di pre-riscaldato tripsina-EDTA, e risospendere con 5 ml di pre-riscaldato DMEM-FPS pipettando. Centrifugare la soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente a 2.500 xg, e scartare il surnatante.
   Nota: Anche se l'integrazione in queste condizioni plateau a circa 48 ore dopo l'infezione ^49,50, gli altri 3 giorni di coltura sono tenuti a sufficiently diluire la concentrazione di molecole di DNA non integrati che derivano dalla cella basata ricombinazione DNA o autointegration virale-mediata.
6. Estrarre il DNA genomico dal pellet cellulare utilizzando un kit disponibile in commercio (ad esempio, vedere ^51). Eluire il DNA dalla colonna a scambio ionico fornito con 200 ml di 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.
   Nota: Una aliquota di cellule dovrebbe essere ripartita in 48 ore dopo l'infezione (passo 2,3) per una prova di infettività per garantire l'infezione da virus corretta prima di NGS.

3. Frammento DNA genomico mediante ultrasuoni o con enzima di restrizione Digest

Nota: frammenti sonicazione DNA genomico in modo sequenza-indipendente, praticamente ed è quindi preferibile la modalità di frammentazione quando i campioni sequenziamento con un basso tasso di recupero atteso (ad esempio, le cellule paziente infetto o infezioni avviate a relativamente basso MOI). Inoltre, sonicazione permette di distinguere duplicati PCR di partilare sequenza sito di integrazione da integrazioni unici nello stesso sito, che è fondamentale per distinguere l'espansione clonale delle cellule provirus contenenti in pazienti infetti (vedere il punto 11 di seguito) ^39,52-54.
Nota: Il DNA deve essere aperto immediatamente a valle dal monte LTR diminuire amplificazione di sequenze virali interni durante LM-PCR. L'enzima di restrizione BglII che giace 43 bp a valle della sequenza U5 monte e che è compatibile per la successiva legatura con DNA MseI generata termina funziona bene con molti ceppi HIV-1 (Figura 1B). Durante la preparazione del DNA per sonicazione, l'enzima di restrizione interna-scissione dovrebbe essere applicata dopo linker legatura (vedere Figura 1C - E e Step 4.3).

1. Per sonicazione, miscelare 10 mg di DNA genomico in acqua priva di nucleasi ad un volume finale di 120 microlitri. Sonicare utilizzando i parametri per una dimensione media rottura di 500 bp (due gare del seguente parametri: Ciclo di lavoro: 5%; intensità: 3; cicli al raffica: 200; Durata: 80 sec).
2. Purificare DNA sonicato utilizzando un kit di purificazione PCR. Riparare il DNA si conclude con un DNA kit di fine-riparazione e purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR. A-coda il DNA utilizzando Klenow eso ^- enzima e purificare il DNA A-coda utilizzando un kit di purificazione PCR. Fare riferimento alle ^51,52 per ulteriori dettagli di utilizzo del kit.
3. Per endonucleasi di restrizione digestione, tagliare 10 mg di DNA genomico notte a 37 ° C in un volume di 100 pl con tampone fornite dal costruttore e un cocktail di enzimi (100 U ciascuno) che generano sovrasta 5'-TA, nonché un enzima incompatibili quali BglII che fende valle dal monte LTR virale. Purificare il DNA il giorno successivo utilizzando un kit di purificazione PCR.
   Nota: Nessuna delle enzimi di restrizione dovrebbe tagliare all'interno del terminal ~ 30 bp dell'estremità DNA virale che viene amplificato dal protocollo LM-PCR. Questo protocollo amplifica specificamente la U5fine di HIV-1 DNA.

4. ricottura Linker Oligonucleotidi e legare a Frammentato DNA genomico

Nota: Preparare un linker asimmetrica contenente una sporgenza che è compatibile con i frammenti di DNA di cui sopra (vedi Tabella 1 per le sequenze di oligonucleotidi utilizzati in questo protocollo). Il linker da utilizzare con DNA sonicato deve contenere un 'sbalzo T-3 compatibile, mentre il linker per DNA MseI digerito deve contenere una compatibili sbalzo 5'-TA (Figura 1). La breve strand linker deve inoltre contenere una modificazione chimica non estensibile, come 3'-ammina, per vincolare le successive reazioni di amplificazione verso il DNA di interesse.
Nota: Quando si prepara più librerie sito di integrazione diverse in parallelo e / o quando i campioni unici di multiplexing sulla stessa corsa di sequenziamento, si raccomanda di usare linkers unici per ogni campione di limitare il potenziale per il campione di cross-Contaminzione durante la PCR. Ciò comporta inoltre l'uso di primer linker unici per ciascun campione durante semi-nested PCR (descritto di seguito). Filoni linker unici e primer linker possono essere progettati da rimescolando le sequenze oligonucleotidiche del linker elencati nella tabella 1, pur mantenendo simile contenuto% GC generale e posizioni sbalzo applicabili.

1. Ricuocere i fili linker corte e lunghe in 35 ml di 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-0,1 mM EDTA (concentrazione finale di 10 pM di ogni oligonucleotide) mediante riscaldamento a 90 ° C e raffreddando lentamente a temperatura ambiente a passi di 1 ° C per min.
2. Preparare almeno quattro reazioni legatura parallele per campione di DNA genomico, che contengono 1,5 micron linker legatura, 1 mg DNA frammentato, e 800 U T4 DNA ligasi a 50 ml. Legare durante la notte a 12 ° C. Purificare il giorno dopo con un kit di purificazione PCR.
3. Per i campioni preparati da sonicazione, digerire la reazione legatura purificata con 100 U di una restrizioneenzima zione che fende a valle dal monte LTR (ad esempio, BglII per l'HIV-1) sotto il produttore di condizioni raccomandate durante la notte. Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR.

5. Amplify virali LTR-host DNA genomico degli incroci PCR semi-nested

Nota: Per garantire la diversità libreria ottimale, almeno 4-8 PCR parallele, a seconda della concentrazione di DNA della reazione legatura recuperato, deve essere preparato per ciascun campione per entrambi i turni PCR. concentrazione modello del DNA dovrebbe essere quantificata mediante spettrofotometria. In questo protocollo, primo e secondo cicli di PCR impiegano primer LTR-specifici nidificati, ma lo stesso primer specifico-linker viene utilizzato per entrambi i turni (Tabella 1). Il secondo fondo LTR-specifica rotonda e le sequenze di primer adattatore codificare specifiche linker per il clustering del DNA così come i siti di primer legame di sequenziamento. Il primer LTR-specifica nidificato codifica anche una sequenza di indice 6 nt, which può essere variato tra i diversi inneschi per le biblioteche di multiplexing all'interno dello stesso ciclo di sequenziamento.

1. Preparare primi PCR rotonde che contengono gli ingredienti per tubo come elencato nella tabella 2.
   Nota: Il primer specifico linker ospita 22 nt di complementarità al linker, una temperatura di fusione di 53 ° C, un Contenuto GC del 45%, e la sua estremità 3 'in cui si trova 15-16 bp a monte del 3' capolinea i lunghi filamenti differenti linker (Tabella 1). Il primo turno 27 nt LTR iniettore ha una temperatura di fusione di 59 ° C, un Contenuto GC del 48%, e il suo 'estremità 3 si trova 34 bp a monte della HIV-1 U5 terminus. La regione del secondo turno iniettore 26 nt LTR che è complementare alla HIV-1 LTR ha una temperatura di fusione di 60 ° C, un Contenuto GC del 50%, e il suo 'estremità 3 si trova 18 bp a monte del U5 virale capolinea. Si raccomanda che la temperatura di fusione e oligonucleotide Contenuto GC dovrebbero imitare questi parametri se gli utentiprimer disegno di PCR con sequenze alterate (anche per l'uso con altri retrovirus) ^21.
2. Eseguire primo turno di PCR in presenza delle seguenti parametri Thermocycler: Un ciclo: 94 ° C per 2 min; 30 cicli: 94 ° C per 15 sec, 55 ° C per 30 sec, 68 ° C per 45 sec; un ciclo: 68 ° C per 10 min.
3. Pool reazioni e purificare utilizzando un kit di purificazione PCR. Preparare la seconda PCR rotonde che contengono gli ingredienti per tubo come da tabella 3. Eseguire il secondo round di PCR utilizzando i parametri Thermocycler descritti al punto 5.2. In comune le reazioni e purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale seguendo le istruzioni del produttore.
   Nota: Una varietà di sequenze indice raccomandati compatibili con NGS di clustering DNA sono disponibili ^71.

6. Eseguire QC e NGS (tipicamente completato da un sequenziamento strumento)

1. (QC test # 1) Conferma Passo 5.3 concentrazione di DNA biblioteca utilizzando un fluorometro ^55. Brevemente, preparare standard e campioni sperimentali in un volume finale di 200 acqua priva di nucleasi microlitri. Tubi vortex per 2-3 secondi, incubare a temperatura ambiente per 2 minuti, e poi leggere i campioni nel fluorimetro.
   Nota: I campioni devono contenere una concentrazione minima di 2 nM DNA libreria in un volume minimo di 15 microlitri.
2. (QC test # 2) Verificare distribuzione delle dimensioni frammento di DNA usando un test basato su nastro ^56.
   Nota: una distribuzione ideale è un relativamente ampio picco di DNA centratura circa 500 bp di lunghezza. Se una notevole quantità di materiale è maggiore di 1 kb, allora è consigliabile incorporare una procedura di selezione per taglia per eliminare le specie di DNA più lunghi, che impediranno amplificazione ponte durante clustering. Al contrario, se un picco significativo risulta circa 100 a 200 bp, un dimero di primer può essere formato durante la PCR. In questo caso la procedura deve essere ottimizzata per minimizzare la formazione di dimeri di primer.
3. (QC test # 3) Confirm corretta incorporazione di adattatori nella libreria di DNA mediante PCR quantitativa ^57.
4. Eseguire NGS seguente letteratura applicazione del produttore. Utilizzare un picco-in del 10% (w / w) ΦX174 DNA, che ottimizzerà metriche di qualità in tempo reale fornendo composizione di base equilibrata per la corsa di sequenziamento.
   Nota: esperimenti sito di integrazione di sequenziamento sono in genere sottoposti a sola fine 150 bp (SE150) o abbinato-end 150 bp sequenziamento (PE150). PE150 è particolarmente utile per catturare il punto di attacco linker su ogni molecola di DNA (ad esempio, in sede di esame siti di integrazione per la prova di cellula ospite espansione clonale).

7. Utilizzare una Python o Perl script su misura per analizzare Sequencing dati per LTR contenenti sequenze, Crop via LTR e il linker sequenze, e mappa di riferimento Genome con BLAT

1. file FASTA scansione per LTR contenenti sequenza di legge, delle colture LTR e le sequenze del linker via da host genomic sequenza di DNA, eesportare queste sequenze in un nuovo file FASTA. Mappa ritagliata legge sia un genoma di riferimento (ad esempio, le versioni del genoma umano hg19 o GRCh38) e il genoma virale utilizzando BLAT ^58, con il sito di integrazione uscita coordinate esportata in un file .txt separato, utilizzando le seguenti impostazioni:
   stepSize = 6, minIdentity = 97, e maxIntron = 0
2. Analizzare l'output BLAT txt, rimuovere autointegrations (cioè la prova che la fine LTR è integrato in una regione interna del genoma DNA virale) e altre sequenze mappatura per la HIV-1 genoma, e creare un'uscita separata txt file in cui tutti i siti di integrazione duplicati sono stati condensati in singoli, successi coordinate uniche.

8. Creare file .bed contenenti intervalli di 15 Nt circostanti integrazioni, convertire questi per FASTA file, e costruire Sequenza Logos per la visualizzazione delle preferenze Base circostante siti di integrazione

1. Creare file .bed che elencano un intervallo di basi perogni sito di integrazione. Almeno 15 basi (5 a monte ea valle) 10 sono suggeriti per la generazione di sequenze logo. Generare un file FASTA da questi file .bed utilizzando la funzione fastaFromBed da BEDTools ⁵⁹ e questo comando:
   -fi / directory fastaFromBed / a / riferimento / genoma / -name -s -bed 15_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
   Nota: Il virale 5'-CA-3 'dinucleotide invariante è unita ad ospitare DNA durante l'integrazione e la verifica dello svincolo della capolinea LTR al DNA cellulare è un importante filtro iniziale per identificare in buona fede siti di integrazione. Abbiamo inoltre compiliamo loghi sequenza da questo host sequenza di DNA della popolazione per verificare i risultati sperimentali. Come retrovirus visualizzare le preferenze di base firma che circondano i loro siti di integrazione ^14,15, i loghi sequenza servono a verificare che i siti genomici mappati sono sorti attraverso l'integrazione IN-mediata rispetto ad altri meccanismi di ricombinazione come il DNA non omologaterminare unendo ^60,61.
2. Utilizzare WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) per creare loghi sequenza dal file FASTA. Fare clic su 'Scegli file' caricare il file FASTA, e utilizzare le seguenti impostazioni: Formato di visualizzazione, PDF (vettoriale); dimensione logo, di grandi dimensioni; In primo numero di posizione, -5; Logo gamma, -5 a 5; scala dell'asse Y, 0.1, asse Y spaziatura tic, 0.5, combinazione di colori classica (NA).

9. Creare centrale paia di basi .bed file, Controllare per il campione cross-contaminazione, e mappare la distribuzione di unici siti di integrazione relativa ai tratti pertinenti genomiche

1. Dal momento che l'integrazione retrovirale si verifica in modo sfalsato tra i fili tDNA, regolare le coordinate precise dei siti di integrazione in modo da riflettere la bp centrale del sito di destinazione di duplicazione per una corretta mappatura della distribuzione genomica relativa alle caratteristiche genomiche.
   1. Pertanto, per 5 bp duplicazione di virus come l'HIV-1, creare un file .bed con il bp centrale offset dal Isito ntegrazione da due basi a valle per le integrazioni mappatura al più filo, e due basi a monte per le integrazioni mappatura al filamento meno.
2. Per verificare la presenza di campioni la contaminazione incrociata, calcolare il numero di siti di integrazione comuni tra le diverse librerie utilizzando le BEDTools funzione si intersecano ad intersecare bp centrale .bed file per due campioni diversi e seguendo il seguente comando:
   bedtools intersecano -a -b central_basepair_1.bed central_basepair_2.bed -f 1,00 -r -s> overlap1v2.txt
3. Contare il numero di righe all'interno del file di output overlap1v2.txt al fine di quantificare il numero esatto dei siti comuni tra le due librerie utilizzando il seguente comando:
   wc -l overlap1v2.txt
4. Scaricare il file .bed RefSeq annotazione per la versione di genoma di riferimento che è stato utilizzato per la mappatura del sito di integrazione dal database UCSC Genome Annotazione (ad es http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database) ^62.
   1. Calcolare il numero di siti di integrazione che rientrano geni RefSeq utilizzando le BEDTools funzione si intersecano ad intersecare il file .bed coppia di base centrale che è stato generato per il campione con il RefSeq .bed di file seguendo questo comando:
      bedtools intersecano -a -b central_basepair_1.bed RefSeq_hg38.bed -u> RefSeq_sample1.bed
5. Contare il numero di righe all'interno del file di output RefSeq_sample1.bed al fine di quantificare il numero esatto dei siti rientranti nei geni RefSeq utilizzando il seguente comando:
   wc -l RefSeq_sample1.bed
6. Ripetere i punti 9.3 e 9.4 per i siti di integrazione mappatura a qualsiasi altra annotazione di interesse per i quali un intervallo .bed file è disponibile. Scaricare il file .bed più recente CpG isola annotazione per il genoma di interesse di riferimento dal database UCSC Genome annotazione come indicato al punto 9.4.
   1. Calcolare il numero di siti di integrazione rientrano entro un certo diposizione (illustrata in questo esempio è una finestra 5 kb) delle isole CpG utilizzando la funzione finestra BEDTools e seguendo questo comando:
      finestra bedtools -w 2500 central_basepair_1.bed -b CpG_hg38.bed -u> CpG_sample1.bed
7. Contare il numero di righe all'interno del file di output CpG_sample1.bed al fine di quantificare il numero esatto dei siti che rientrano nel 2,5 kb a monte oa valle di isole CpG utilizzando il seguente comando:
   wc -l CpG_sample1.bed
8. Ripetere i punti 9.6 e 9.7 per i siti di integrazione mappatura vicina TSSS. Generare una versione alternativa del file RefSeq.bed, dove coordina genomica mappatura per più di un gene sono state aggiustate per riflettere solo un singolo gene presente in quella posizione. Questo impedisce sovrastima della densità genica circostante siti di integrazione. Calcolare la densità gene nella regione 1 Mb circonda ciascun sito di integrazione utilizzando la funzione finestra BEDTools e seguendo questo comando:
   Finestra bedtools -w 500000 central_basepair_1.bed -b RefSeq_hg38_NonRedundant.bed -u> GeneDensity_sample1.bed
9. Calcolare la densità media gene per tutte le integrazioni nel set di dati seguendo questo comando:
   awk '(somma + = $ 7) END (stampa "= Average", somma / NR)' GeneDensity_sample1.bed

10. Statisticamente Confronto integrazione del sito distribuzioni tra i campioni utilizzando due code test esatto di Fisher e due code Wilcoxon della somma dei ranghi di prova in R

Nota: test esatto di Fisher Usa per confrontare la percentuale di siti di integrazione all'interno dei geni RefSeq o all'interno di una finestra di isole CpG o Tsss, ma utilizzare il test somma dei ranghi di Wilcoxon per comparare la distribuzione di densità genica che circonda i siti di integrazione. Il programma di ricerca è disponibile presso http://www.r-project.org/.
Due code test esatto di Fisher:

1. Utilizzando i numeri calcolati come indicato ai punti 9.4 e 9.7, crEATE matrici per ogni confronto in R di eventi osservati (integrazioni all'interno di un'annotazione o all'interno di una finestra circostante un'annotazione) contro siti rimanenti seguendo questo comando:
   (Annotation_of_interest <- matrice (c (SampleA # a, SampleA # rimanente, SampleB # a, SampleB # rimanente), nrow = 2, dimnames = lista (c ( 'Centro', 'Resto'), c ( 'SampleA', 'SampleB'))))
2. Calcolare il valore P per il confronto con due code test esatto di Fisher con il seguente comando:
   fisher.test (annotation_of_interest, alternativa = 'two.sided') $ p.value
   Due code Wilcoxon rank test sum:
3. Creare un file txt delimitato da tabulazioni in cui ogni colonna contiene il nome del campione nella cella in alto, seguita al di sotto dei valori di densità genica per tutti i siti di integrazione in quella libreria (ottenuto dal file .bed generato al punto 9.9). Importare questo file txt delimitato da tabulazioni in R utilizzando il seguente comando e navigating alla directory file corretto:
   FILENAME <- as.data.frame (read.delim (file.choose (), intestazione = T, check.names = FALSE, riempire = TRUE, Settembre = ' t'))
4. Calcolare il valore P per il confronto con due code Wilcoxon rank test somma con il seguente comando:
   wilcox.test (FILENAME $ SampleA, FILENAME $ SampleB, = alternative 'two.sided', in coppia = F, esatto = T) $ p.value
   Nota: i valori P possono essere calcolati solo fino a un certo limite (estremamente bassa) in R, dopo di che azzerare saranno restituiti dal programma. Per i campioni in maniera massiccia diverse che producono un P = 0 in R, stimare il valore di P come <2,2 x 10 ^-308.

11. Esaminate Raw sequenziamento dei dati per la prova di espansione clonale di cellule contenenti integrato Viral DNA

Nota: esiste un potenziale piccolo per più di una integrazione nello stesso preciso nt nel genoma di riferimento. In alternativa, un singolo inevento tegrazione può diventare ridondante presente nei dati di sequenziamento a causa dell'uso di PCR durante la preparazione biblioteca e / o duplicazione cellulare prima della preparazione del DNA. Recenti analisi di DNA genomico da pazienti con infezione da HIV hanno contraddistinto queste possibilità, individuando punti punti ultrasuoni taglio / attacco linker unici (che può derivare solo prima PCR) all'interno di sequenze di DNA che contengono siti di integrazione identici ^52-54. Attualmente vi è un dibattito sul fatto provirus albergano all'interno delle cellule espanse clonale contribuiscono al serbatoio virale latente, e quindi è di particolare interesse per caratterizzare il loro livello di espansione quando si studia siti di integrazione nei pazienti umani.

1. Simile alla procedura di cui al punto 8.1, generare file .bed sfogliare un intervallo di basi che si estendono, in questo caso, 25 nt a valle di ogni sito di integrazione unico (basi a monte non sono necessari qui). Generare un file FASTA da questi file .bed (come indicato nellaPasso 8.1) utilizzando la funzione fastaFromBed da BEDTools e seguendo questo comando:
   -fi / directory fastaFromBed / a / riferimento / genoma / -name -s -bed 25_base_pair_file.bed -fo output_file.fasta
   Nota: Per migliorare la specificità di ogni ricerca si raccomanda di estrarre almeno 25 nt a valle di ciascun sito di integrazione per le analisi espansione clonale.
2. Preferibilmente utilizzando uno script personalizzato, cercare il file di dati di sequenza FASTA prima per tutte le stringhe che contengono una corrispondenza esatta al 25 nt a valle di ogni sito di integrazione unico e depositare queste sequenze in un nuovo file. Trim LTR e le sequenze del linker dalle corde prime. Unire sequenza PE legge convertendo legge per il complemento inverso, rifilatura LTR e linker sequenze, e quindi l'assegnazione di stringhe READ2 alla loro coppia READ1 se le stringhe condividono almeno 20 sovrapposizione nt.
3. Scansione i punti di fissaggio linker di ogni blocco sito di integrazione. Classificare ogni integrazione come "clonale ampliato &# 34; se punti di attacco linker sono ≥3 bp a parte.
   Nota: Un protocollo per l'analisi espansione clonale senza fusione sequenza si legge è stata descritta ^52.
   Nota: La frammentazione del genoma presso la stessa identica posizione mediante ultrasuoni porta ad una sottostima della misura di espansione clonale, e metodi per correggere la distorsione sperimentale risultante sono state descritte ^63,64.

Risultati

Tabella 4 elenca i risultati di un esperimento rappresentativo per illustrare la sensibilità di NGS per il recupero di siti di integrazione da una coltura di cellule infette. DNA cellulare non infetti è stata utilizzata per diluire serialmente DNA genomico da una infezione, in cui ogni cellula in media conteneva un integrazione ^40. Le diluizioni sono stati preparati a passi di cinque a una diluizione massima di 1: 15.625. DNA genomico della serie titolazione è...

Discussione

Un protocollo per l'analisi dei siti di integrazione retrovirali, dalla fase virus iniziale fino mappatura dei modelli di distribuzione genomici, è descritto. Questo protocollo è applicabile a qualsiasi retrovirus e qualsiasi tipo di cellula infettabili. Inoltre, la conduttura dosaggio è molto sensibile, con la possibilità di recuperare un numero soddisfacente di integrazione siti unici da diluizioni seriali di DNA genomico equivalente a quella di una infezione avviato con una MOI di 6,4 x 10 ^-5. Questa s...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Gibco	11965-084	Terreno di coltura cellulare standard, compatibile con cellule HEK293T
Siero fetale bovino	Thermo Scientific	SH 30088.03	Potrebbe essere necessario effettuare un pre-screening di diversi lotti di siero per una produzione virale ottimale
Penicillina/streptomicina	Corning	30-002-Cl	Antibiotici da aggiungere alla
soluzione salina tamponata con fosfato	Mediatech	21-040-CV	Utilizzato per lavare le cellule
Tripsina EDTA	Corning	25-053-CI	Utilizzato per staccare le cellule aderenti dalle piastre di coltura tissutale
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	Reagente di trasfezione del DNA
0,45 &; m Filtri	Thermo Scientific	09-740-35B	Utilizzato per filtrare terreni di coltura cellulare contenenti particelle virali
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Utilizzato per degradare il DNA plasmidico di carryover da stock virali
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay	ABL Inc.	5447	Utilizzato per quantificare la resa della produzione virale
DNeasy Blood & Kit di tessuti	Qiagen	69506	Utilizzato per purificare il DNA genomico dalle cellule
Sonicatore	Covaris	S2	Con questo modello di sonicatore si eseguono due cicli di ciclo di lavoro, 5%; intensità, 3; cicli per raffica, 200; tempo, 80 sec
Acqua priva di nucleasi	GeneMate	G-3250-125	consiglia di utilizzare l'acqua disponibile in commercio per ridurre la possibilità di contaminazione incrociata del campione
Purificazione QIAQuick PCR Kit	Qiagen	28106	Utilizzato per purificare il DNA durante la costruzione della libreria
End-It DNA End-Repair Kit	Epicentre	ER81050	Utilizzato per riparare le estremità del DNA di campioni di DNA sonicati
Frammento di Klenow (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Utilizzato con dATP a frammenti di DNA riparati con coda A
dATP	Thermo Scientific	R0141	Deossiadenosina trifosfato
MseI	NEB	R0525L	Endonucleasi di restrizione per la scissione genomica del DNA
BglII	NEB	R0144L	Endonucleasi di restrizione per sopprimere l'amplificazione della sequenza HIV-1 U5 a monte T4
DNA Ligasi	NEB	M0202L/6218	Enzima per l'unione covalente di estremità di DNA compatibili
Oligonucleotidi di DNA Tecnologie	di DNA integrate	su misura	Chiedi all'azienda di purificare gli oligo. La purificazione HPLC è sufficiente per i DNA < 30 nucleotidi; PAGE purifica i DNA più a lungo
Advantage 2 Polymerase Mix	Clontech	639202	Miscela commerciale contenente DNA polimerasi per PCR
dNTP (soluzioni da 100 mM)	Thermo Scientific	R0181	Diluire le quattro sostanze chimiche su ghiaccio con acqua sterile per raggiungere le concentrazioni intermedie di 2,5 mM ciascuna dNTP
Spettrofotometro NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	per la determinazione della concentrazione
di DNAFluorimetro Qubit Life	Technologies	Qubit® 3.0	utilizzato per confermare la concentrazione di DNA nella libreria del sito
di integrazione 2200 TapeStation System	Agilent	G2964AA	Saggio basato su nastro per confermare la distribuzione dimensionale del DNA della libreria del sito di integrazione
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Utilizzato per NGS