Utilizzando assemblaggio DNA, vettori multipli CRISPR possono essere costruiti in parallelo in una singola reazione clonazione, rendendo la costruzione di un gran numero di CRISPR vettori un compito semplice. Pomodoro radici pelose sono un sistema eccellente modello per convalidare vettori CRISPR e generare materiali mutanti.
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Articolo metodologico
High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le mutazioni mirate del DNA generate da vettori con la tecnologia CRISPR/Cas9 si sono dimostrate utili per gli studi di genomica funzionale. Sebbene la maggior parte delle strategie di clonazione siano semplici da eseguire, generalmente utilizzano più passaggi e possono richiedere diversi giorni per generare i costrutti finali. Il metodo qui presentato si basa sull'assemblaggio del DNA e può produrre vettori CRISPR completamente funzionali in una singola reazione di clonazione. La costruzione vettoriale può anche essere messa in pool, aumentando ulteriormente l'efficienza e l'utilità del processo. Una modifica del metodo viene utilizzata per creare vettori CRISPR con più bersagli genici. I vettori CRISPR vengono quindi trasformati in radici pelose di pomodoro per generare materiali transgenici con modifiche mirate del DNA. Le radici pelose sono un sistema utile per testare la funzionalità dei vettori in quanto sono tecnicamente semplici da generare e suscettibili di produzione su larga scala. I metodi qui presentati avranno un'ampia applicazione in quanto possono essere utilizzati per generare una varietà di vettori CRISPR ed essere utilizzati in un'ampia gamma di specie vegetali.
Introduzione
La capacità di generare le modifiche del DNA mirati con CRISPR / Cas9 ha un grande potenziale per gli studi di genomica funzionale. Ci sono due componenti del sistema CRISPR / Cas9; la nucleasi Cas9, derivata da pyogenes Staphylococcus e una molecola di circa 100 nt guida RNA (gRNA) che dirige Cas9 al sito DNA bersaglio (s) 1. Obiettivo riconoscimento è conferito dal primo ~ 20-nt del gRNA, che consente la produzione di high-throughput di targeting vettori 2,3. La maggior parte degli organismi che possono essere progettati, già sono stati con CRISPR tecnologia / Cas9 4,5.
Nelle piante, promotori c....
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Protocollo
1. Guida RNA Progettazione e Costruzione di vettore
- Identificare sequenze bersaglio per i geni di interesse. Ci sono una varietà di programmi di destinazione conoscitiva CRISPR in linea adatte per questo passo 13,14.
NOTA: Qui usiamo il GG motivo bersaglio GN 20, ma altri disegni possono essere adatti a seconda del sistema di applicazione o il vettore utilizzato. - Progettazione 60-mer oligonucleotidi gRNA per includere la porzione GN 19 dei motivi di destinazione affiancato da 5 'e 3' sequenze di 20-nt che sono necessari per il montaggio del DNA. Il motivo finale 60-mer è: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT....
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Risultati
CRISPR vettore costruzione con assemblaggio DNA genera tipicamente decine a centinaia di cloni indipendenti. Lo screening mediante PCR Colony identifica facilmente cloni corretti e in grado di distinguere tra i plasmidi con e senza inserti (Figura 2a) che è utile per la risoluzione dei problemi. Tipicamente, tutti i cloni contengono un inserto e un utente può scegliere di ignorare i passaggi di screening colonia del tutto. Digest diagnostici (Figura 2b) .......
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Discussione
Poiché l'assemblaggio del DNA viene utilizzato per ricombinare qualsiasi sequenza di DNA sovrapposta, questo metodo di clonazione può essere applicato a qualsiasi costruzione di vettori CRISPR. La maggior parte degli schemi di clonazione CRISPR utilizza la sintesi genica del gRNA, gli enzimi di restrizione di tipo IIS17,18 o la PCR19 con estensione sovrapposta. Ognuna di queste tecniche presenta vantaggi e svantaggi intrinseci, ma in genere richiedono più passaggi pratici di clonazione. Il vantaggio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation concessione IOS-1.025.642 (GBM). Ringraziamo Maria Harrison per fornire il ceppo ARqua1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NEBuilder® (Miscela di assemblaggio HiFi DNA) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | Il plasmide p201H:Cas9 (59176) è anche compatibile con le sovrapposizioni e gli enzimi riportati. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean e purificazione a 5 colonne | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (preparazione plasmidi) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Sali + Gamborg Vitamine | Laboratori di fitotecnologia | M404 | |
| Phytagel™ (gomma di gellano) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Scatole | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore nastro chirurgico | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillina/Acido clavulanico) | Vari | 0029-6571-26 | |
| Inneschi 5' → 3'SwaI_MtU6F | |||
| GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG | |||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG Ponteggio AAGF | ||
| GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT | |||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG | Non può essere utilizzato per il sequenziamento Sanger poiché esiste un secondo sito di legame sul plasmide | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATTATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Le sequenze in grassetto denotano sovrapposizioni di 20 nt con p201N:Cas9 linearizzato. |
Riferimenti
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2....
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Ristampe e permessi
