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Articolo metodologico

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

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DOI:

10.3791/53846

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25 marzo 2016

 , 
1Immunity, Microenvironment, Virus, Cancer Research Center in Lyon

In questo articolo

Sommario

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. L'isolamento dei neutrofili dal sangue umano mediante il metodo di separazione del gradiente di densità e la differenziazione delle cellule promielocitiche umane (HL60) lungo la via granulocitaria sono descritti qui; testare il loro ruolo sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma.

Abstract

I neutrofili sono il tipo di globuli bianchi più abbondante (dal 40% al 75%) e tra le prime cellule infiammatorie a migrare verso il sito di infiammazione. Sono attori chiave nel sistema immunitario innato e svolgono un ruolo importante nella biologia del cancro. I neutrofili sono stati proposti come mediatori chiave della trasformazione maligna, della progressione tumorale, dell'angiogenesi e nella modulazione dell'immunità antitumorale; attraverso il loro rilascio di fattori solubili o la loro interazione con le cellule tumorali. Per caratterizzare le funzioni specifiche dei neutrofili, è necessario un metodo rapido e affidabile per l'isolamento in vitro dei neutrofili dal sangue umano. Qui, è stato dimostrato che un metodo di separazione a gradiente di densità isola i neutrofili e le cellule mononucleate dal sangue. La procedura consiste nella stratificazione della soluzione a gradiente di densità come Ficoll accuratamente sopra il sangue diluito ottenuto da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC), seguita da centrifugazione, isolamento dello strato mononucleato, separazione dei neutrofili dai globuli rossi mediante destrano e lisi degli eritrociti residui. È stato dimostrato che questo metodo isola i neutrofili ≥ di essere puri al 90 %. Per imitare il microambiente tumorale, sono stati eseguiti esperimenti tridimensionali (3D) utilizzando una matrice di membrana basale come Matrigel. Data la breve emivita dei neutrofili in vitro, non è possibile eseguire esperimenti 3D con neutrofili umani freschi. Per questo motivo, le cellule promielocitiche HL60 vengono differenziate lungo la via granulocitaria utilizzando gli induttori di differenziazione dimetilsolfossido (DMSO) e acido retinoico (RA). Lo scopo dei nostri esperimenti è quello di studiare il ruolo dei neutrofili sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma. Tuttavia, questi metodi possono essere generalizzati per studiare le interazioni dei neutrofili o delle cellule simili ai neutrofili con una vasta gamma di tipi di cellule in diverse situazioni.

Introduzione

Cellule immunitarie innate costituiscono una quota essenziale delle cellule all'interno del microambiente tumorale e sono stati associati con la malignità del tumore nei pazienti e modelli animali di cancro 1. Recentemente, è diventato più ampiamente apprezzati che le risposte immunitarie croniche giocano ruoli critici nella promozione progressione tumorale, metastasi e resistenza alle chemioterapie 2. I macrofagi sono importanti cellule immunitarie innate che hanno dimostrato di regolare direttamente la risposta delle cellule tumorali alla chemioterapia 3,4. Tuttavia, il ruolo dei neutrofili, i principali attori del sistema immunitario innato, nella regolazione della risposta del tumore alla terapia anti-cancro non è noto. Gli obiettivi di questi protocolli sono di utilizzare un metodo veloce e credibile per separare neutrofili da campioni di sangue CLL del paziente e di differenziare le cellule HL60 lungo il percorso granulocitica al fine di studiare il loro ruolo nel regolare la sensibilità delle cellule di linfoma di agenti anti-linfoma.

I neutrofili sono la componente cellulare più abbondante del sistema immunitario innato nel sangue 5 e ad agire come una prima linea di difesa contro i microrganismi invasori 6. I neutrofili hanno un ruolo essenziale nella nascente efficaci risposte immunitarie innate, oltre alle funzioni effettrici variabili in diverse condizioni patologiche 7. Pertanto, un metodo veloce e credibile isolare neutrofili dalle altre cellule del sangue, come metodo di separazione gradiente di densità, è necessaria per gli studi in vitro. Usando questo metodo per l'isolamento dei neutrofili faciliterà ulteriori ricerche sulle funzioni immunologiche neutrofilo-mediata in vivo ed ex vivo.

La possibilità di ottenere popolazioni pure di neutrofili è un primo passo importante per lo studio di pazienti con malattie immunologiche 8. Densità metodo di separazione gradiente è una tecnica ideale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule. il method comporta l'aggiunta di soluzione gradiente di densità nella parte inferiore di un tubo contenente sangue umano diluito seguita da centrifugazione a 300 g per 35 min senza interruzione. L'anello delle cellule mononucleari appare a livello di interfaccia e neutrofili risiedere al di sotto del primo. Questo metodo ha vantaggi significativi rispetto ad altri metodi disponibili come kit di isolamento dei neutrofili che sono molto più costosi 9. Inoltre, isolando neutrofili dal sangue umano da kit commerciali utilizzando anticorpi diretti ad un marcatore di superficie specifico per neutrofili umani, aumentare il rischio di attivazione delle cellule o la differenziazione. Densità metodo di separazione gradiente consente l'isolamento dei neutrofili entro un breve periodo di tempo. Entro lo stesso passo, cellule mononucleari vengono separati e recuperati. E 'una tecnica fondamentale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule puri per conseguire integrità funzionale.

Al fine di simulare il microenv tumoreironment, sono stati effettuati esperimenti di 3D. Data la breve emivita dei neutrofili in vitro, gli esperimenti 3D con neutrofili umani freschi non sono conclusivi. Per questo motivo, promielocitica cellule (HL60) vengono indotte a differenziarsi in cellule neutrofili simili che utilizzano gli induttori di differenziazione dimetilsolfossido (DMSO) e l'acido retinoico (RA). Utilizzando cellule HL60 differenziate (HL60 diff) impedirà avere diverse risposte dei neutrofili a causa di isolamento da diversi donatori.

In 3D vitro modelli di coltura rappresentano una fase intermedia tra i modelli in 2D in vitro e in modelli in vivo. Nella cultura 2D, le cellule sparse sulla superficie di plastica formando allegati cellulari innaturali alle proteine ​​depositati che sono denaturate su questa superficie sintetica. Viceversa, le cellule allegati cellula-cellula naturale forma coltura 3D poiché le cellule e la matrice extracellulare sintetizzano sono il materiale naturale a cui sono attaccati.Per questo motivo, i modelli co-coltura 3D, in particolare tra le cellule tumorali e di altri tipi di cellule, sono stati molto utili per indicare il loro contributo alla crescita del tumore, l'angiogenesi, e le metastasi. Come risultato, culture 3D rendono la coltura cellulare mimare le condizioni fisiologiche che esistono in vivo 10.

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Protocollo

1. neutrofili Isolamento e co-coltura con cellule leucemiche primarie

NOTA: Le procedure sono state condotte sotto l'approvazione del comitato etico dell'ospedale di Lione, con tutti i pazienti che firmano un consenso informato.

  1. Isolamento di cellule leucemiche primarie e neutrofili
    1. Raccogliere tubi di sangue periferico in EDTA (1,8 mg EDTA per millilitro di sangue) da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC).
    2. Aggiungere ogni 15 ml di sangue in una provetta sterile 50 ml e diluire con 15 ml di RPMI (diluizione 1: 1), poi accuratamente e aggiungere lentamente 15 ml di soluzione di gradiente di densità al fondo del tubo senza mescolare le fasi. Assicurarsi che la soluzione gradiente di densità è a RT per la preparazione.
    3. Centrifugare a 300 xg per 35 minuti a temperatura ambiente e senza freno. Il sangue deve separare in quattro fasi distinte, come mostrato in figura 1A, dall'alto verso il basso: piastrine e plasma, cellule mononucleate (wanello Hite), soluzione gradiente di densità, i granulociti ed eritrociti.
    4. Raccogliere l'anello bianco che rappresenta le cellule leucemiche primarie con una pipetta di plastica Pasteur e trasferire in una nuova provetta da 50 ml.
      1. Riempire il tubo con PBS (contiene calcio e magnesio) fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 min a RT.
      2. Risospendere il pellet con 5 ml di PBS quindi aggiungere PBS fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 minuti a RT.
      3. Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI (RPMI 1640 addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), 2 mM glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina) per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare.
    5. Aspirare le fasi superiori lasciando la fase di granulociti e eritrociti e aggiungere PBS fino a 25 ml quindi aggiungere 3% di destrano a 0,9% NaClup a 50 ml in totale. Miscelare le provette 10 volte e tenerli per 30 min a temperatura ambiente senza mescolare.
    6. Raccogliere il superiore RBC-poveri uno strato neutrofilid metterli in una sterile tubo da 50 ml pulita e centrifugare le provette a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere ogni pellet con 5 ml di PBS poi aggiungere rosso tampone di lisi delle cellule fino a 50 ml in totale.
    7. Conservare le provette al buio per 15 minuti a RT quindi si centrifuga a 500 g per 10 minuti a RT. Lavare il pellet con PBS (PBS aggiungere fino a 50 ml in totale) centrifugare a 500 g per 10 minuti a RT.
    8. Risospendere il pellet con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. Mantenere 3 x 10 5 di ogni tipo di cellula in 50 microlitri di PBS-FBS (4%) in 5 ml tubi di plastica per determinare la purezza del loro isolamento mediante citometria a flusso.
  2. Analizzare Aspetti morfologici delle isolate popolazioni di cellule
    1. Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10 4 neutrofili e 3 x 10 4 cellule mononucleari in 150 ml completo RPMI. Montare i vetrini, carte di filtro, e le camere del campione nella centrifuga cytospin, assicurando che tegli centrifugare è ben equilibrato.
    2. Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 750 xg per 10 min a RT Rimuovere i vetrini, schede filtro e camere per campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione.
    3. Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X.
  3. Verificare la purezza di cellule isolate da FACS
    1. Etichettare le isolate cellule leucemiche primarie con anticorpi CD19 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Etichetta i neutrofili purificati con una miscela di anticorpi anti-umani elencati nella Tabella 1 (5 microlitri / 10 6 cellule). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C.
    2. Lavare le cellule con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) la centrifuga le provette a 300 g per 5 minuti a RT.
    3. Risospendere ogni pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%).
    4. Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore.
  4. Coculture di cellule leucemiche primari con autologo neutrofili
    1. Seed 2 x 10 5 cellule / ml di solo o con neutrofili autologhe al rapporto 1:10 in mezzo completo RPMI cellule leucemiche primarie. Per fare ciò, regolare il numero di cellule diluendo sospensioni cellulari e aggiungere 2 x 10 5 cellule / ml di cellule leucemiche primarie a 2 x 10 6 cellule / ml neutrofili. Mescolare con cura.
    2. Aggiungere 25 micron di tirosina chinasi (Btk) inibitore di Bruton (Ibrutinib) alle cellule. Incubare per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
  5. Cellulare Raccolta e analisi FACS
    1. Collect le cellule in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. Lavare il pellet con 1 ml di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. pellet Risospendere in annessina V e PI utilizzando kit commerciale e incubare le cellule nel buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la strategia di controllo dell'immagine figura 2A e la seguente configurazione ottica: laser a 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore.

2. differenziazione delle cellule HL60 lungo la granulocitica Pathway e la loro co-coltura con cellule RL linfoma B in 3D del modello

  1. Differenziazione delle promielocitica umana (HL60), le cellule in cellule simil-neutrofili
    1. Regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml quindi aggiungere 1 mM acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO per indurre la loro differenziazione. Seed ogni 3 x 10 5 cellule HL60 per pozzetto in lamiera 48-bene poi incubare per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
    2. Successivamente, raccogliere le cellule e centrifugare a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare.
    3. Poi diluire sospensione di cellule in mezzo completo RPMI per regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml e indurre nuovamente la loro differenziazione aggiungendo 1 mM di acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO. Seme ogni 3 x 10 5 HL60 cellule per pozzetto nella piastra a 48 pozzetti e incubare per altri 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
  2. Analisi di differenziazione HL60 (HL60 diff)
    1. Raccogliere le cellule e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare.
    2. Per analizzare i cambiamenti nell'espressione marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso. Posizionare ogni 3 x 10 5 cellule indifferenziate HL60 (da colture cellulari) e 3 x 10 5 cellule HL60 diff in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT.
    3. Risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS-FBS (4%). Etichettare le cellule con CD11b anti-umano coniugati con AF700 o CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C.
    4. Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%).
    5. Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 3A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
    6. Per testare i cambiamenti morfologici a HL60 diff, immobilizzare le cellule su vetrini per l'esame microscopico.
      1. Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10 4 cellule indifferenziate HL60 (da colture cellulari) e 3 x 10 4 HL60 diff in 150 ml completa medie RPMI. Montare i vetrini, carte di filtro, e le camere del campione nella centrifuga cytospin, assicurando che la centrifuga è equilibrata.
      2. Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 1500 rpm per 10 minuti a RT. Rimuovere le diapositive, le carte di filtro, e le camere di campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione.
      3. Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X.
  3. 3 dimensioni (3D) Cultura
    NOTA: Assicurarsi che i materiali utilizzati in questo esperimento sono freddi e l'esperimento sta prendendo posto sul ghiaccio.
    1. Risospendere ogni 5 x 10 4 cellule RL, da solo o in miscela con HL60 diff Al rapporto RL: HL60 diff 01:10, con matrice di membrana basale di 300 ml con 1 ml di punta della pipetta tagliata con una forbice sterile, al fine di ampliare l'apertura di circa 2 a 3 mm. Evitare le bolle durante questa fase.
    2. Seed ogni 300 ml di sospensione cellulare / bene in 24-pozzetti. Evitare le bolle durante questa fase. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C con 5% di CO 2 si aggiunge 1 ml completare terreno RPMI per ciascun pozzetto ed incubare per 7 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. Cambiare la media ogni due giorni. Aggiungere 10 nM vincristina al giorno 5.
  4. Analisi FACS
    1. Dopo 7 giorni di coltura, aspirare il terreno e lavare i pozzetti con 1 ml di PBS ghiacciata due volte. Aggiungere 3 ml / pozzetto di PBS ghiacciato-EDTA (5 mm). Rimuovere il gel dal fondo del pozzo raschiando utilizzando il fondo di 200 microlitri punta della pipetta. Agitare delicatamente la piastra in ghiaccio per 30 min.
    2. Trasferire sospensione cellulare in sterile tubo da 15 ml e agitare i tubi delicatamente ice per altri 30 min. Controllare l'aspetto di sospensione omogenea. (Se non è il caso, quindi agitare le cellule per un tempo più lungo o aggiungere più PBS-EDTA).
    3. Centrifugare le provette a 300 xg per 10 min a RT. Lavare il pellet con PBS poi centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
    4. Risospendere con PBS-FBS (4%) e l'etichetta con l'anticorpo CD19 anti-umano coniugato con PE-Cy7 e anticorpi CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare al buio per 30 minuti a 4 ° C.
    5. Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) poi provette per centrifuga a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule con annessina V e PI utilizzando il kit commerciale.
    6. Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 4A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore.

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Risultati

Densità metodo di separazione gradiente qui descritto fornisce cellule leucemiche primarie e neutrofili non stimolate isolate dal sangue di pazienti affetti da LLC figura 1A rappresenta i diversi livelli di sangue ottenuti dopo gradiente di densità centrifugazione (dall'alto verso il basso:. Piastrine e plasma, anello bianco rappresenta le cellule mononucleate, gradiente di densità soluzione, granulociti e eritrociti). Figura 1B e 1C mostrano le diff...

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Discussione

Descritto qui, un protocollo efficace, semplice, veloce ed economico per l'isolamento dei neutrofili dal sangue umano con elevata purezza mediante centrifugazione in gradiente di densità approccio ed entro le stesse cellule mononucleate passo vengono separati e recuperati. Le popolazioni di cellule isolate sono puri ≥90%.

Sono disponibili diversi metodi per l'isolamento dei neutrofili dal sangue umano. Questi includono metodi simili utilizzando gradienti discontinui 11,12,...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dall'Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMI 1640 Gibco Invitrogen21875-034
Siero fetale bovino (FBS)Gibco Invitrogen10270-106
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS contiene calcio e magnesio)Gibco Invitrogen14040-091
N-acetil-L-alanil-L-glutammina (L-Glutammina)Tecnologie per la vita25030-024
Penicillina streptomicina (Pen Strep)Tecnologie per la vita15140-122
Inibitore della tirosin-chinasi di Bruton (Btk) (Ibrutinib) CliniSciencesA3001
Vincristina EG labo
BD Matrigel matrice della membrana basaleBD Biosciences354234Messo a 4 oC durante la notte (O/N) prima del giorno dell'esperimento
Tampone di lisi dei globuli rossi BD Biosciences555899
Ficoll (Pancoll)PAN BiotechP04-60500
Dextran Sigma-AldrichD8906
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Acido retinoicoSigma-AldrichR2625
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA7906
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Cloruro di sodio (NaCl)EuromedexS3014
Kit di colorazione V-FLOUS di annessione Roche11  988  549  001
Kit RAL 555 Kit di colorazione Giemsa modificataCosmos BiomedicalCB361550-0000
Citometria a flusso LSRIIBD Biosciences
CitocentrifugaThermo Scientific
Microscopio Leica DMR-XALeica Microsystems
Auto T4 Cell Viability CounterNexcelom  Bioscience
Cellometro

Riferimenti

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