Method Article

Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

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La convalida delle attività enzimatiche coinvolte in processi biochimici può essere chiarita utilizzando l'analisi complementazione funzionale (FCA). Descritto in questo manoscritto è il saggio FCA dimostrare l'attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli amminoacidi, risposta stringente batterica e batterica biosintesi peptidoglicano.

Abstract

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Saggio complementazione funzionale (FCA) è un test in vivo che è ampiamente utilizzato per chiarire la funzione / ruolo dei geni / enzimi. Questa tecnica è molto comune in biochimica, genetica e molte altre discipline. Una panoramica completa della tecnica per integrare l'insegnamento delle vie biochimiche inerenti agli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta stringente batterica è riportato in questo manoscritto. Due cDNAs dalla pianta modello thaliana organismo Arabidopsis che sono coinvolti nel metabolismo della lisina (L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) e tirosina aminotransferasi (tyrB) coinvolti nel metabolismo di tirosina e fenilalanina sono evidenziate. Inoltre, il peptidoglicano batterico pathway anabolizzante è evidenziato attraverso l'analisi del -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (MURE) gene UDP N dal batterio Verrucomicrobium spinosum coinvolti nella croce-libreria di peptidoglicano. La risposta stringente batterica è riportato anche attraverso l'analisi del rsh (R ELA / s pot h Omolog) gene bifunzionale responsabile di un fenotipo iper-mucoide nel sp batterio Novosphingobium. Quattro esempi di FCA sono presentati. Nel video si concentrerà su tre di loro, vale a dire lisina, peptidoglicano e la risposta stringente.

Introduction

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complementazione funzionale nel contesto di chiarire la funzione (s) / ruolo (s) di un gene viene definita come la capacità di un particolare omologo o gene orthologous ripristinare un particolare mutante con un fenotipo osservabile allo stato wild-type quando l'omologa o gene orthologous è introdotto in cis o trans in secondo piano mutante. Questa tecnica è stata ampiamente usata per isolare e identificare la funzione (s) / ruolo (s) di molti geni. Un esempio particolare è l'isolamento e l'identificazione di orotidina-5-fosfato decarbossilasi da Candida albicans utilizzando il mutante URA3 di S. cerevisiae e i....

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Protocol

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NOTA: Gli autori sono disposti a fornire ceppi batterici e plasmidi ricombinanti per facilitare l'inserimento di analisi complementazione funzionale a scopo didattico per gli individui che sono interessati. I plasmidi che sono stati utilizzati per facilitare esperimenti di complementazione funzionali sono elencati nella Tabella 1.

1. Costruzione di plasmidi per complementazione funzionale

  1. Clonazione di Diaminopimelate aminotransferasi (dapL) per complementazione funzionale.
    1. Amplificare il quadro di lettura aperto dapL (ORF) dal V. spinoso e cDNAs da A. thaliana e C. reinha....

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Results

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I ceppi batterici che sono impiegati nelle varie analisi di complementazione funzionali sono riportati in Tabella 2.

Analisi Funzionale complementazione: L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL)

Il E. coli doppio mutante AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) ospita una mutazione nel gene Dape e una delezione completa del gene D.......

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Discussion

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Molti dei corsi che sono parte integrante del Biotecnologie e Bioscienze molecolare curriculum presso il Rochester Institute of Technology hanno una componente di laboratorio in aggiunta alla quota lezione del corso. Il piano di studi per l'anno accademico 2014-2015 contiene un totale di 48 corsi, 29 dei quali contengono una componente di laboratorio che rappresentano circa il 60%. Un tale corso è Fondamenti di piante Biochimica e Patologia (FPBP), una conferenza / corso di laboratorio miscelati e Bioseparations: pr.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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AOH e MAS riconosce il College of Science e Thomas H. Gosnell School of Life Sciences presso il Rochester Institute of Technology per il supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Stati Uniti National Science Foundation (NSF) premio a AOH MCB-1.120.541.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantiHudson/Savka lab o CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)Electroporator
Biorad-USA1652100
Cuvette per elettroporazioneBiorad-USA1652082
Incubatrice a temperatura controllataMicrocentrifuga Generica
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrodoThermofisher Scientific 12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Destrosio di Patate MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamicinaSigma-AldrichK1377
DiaminopimelatoSigma-Aldrich92591
TiminaSigma-AldrichT0376
CloramfenicoloSigma-AldrichC0378
TirosinaSigma-AldrichT3754
FenilalaninaSigma-AldrichP2126
AspartatoSigma-AldrichA9256
ValinaSigma-AldrichV0500
LeucinaSigma-AldrichL8000
IsoleucinaSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinosioSigma-AldrichA3256
TetraciclinaSigma-Aldrich87128
Taq DNA polimerasiThermofisher Scientific10342-020
Platino pfx DNA polimerasiThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligasiThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alfaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/vettore topograficoThermofisherScientific K100-01
pCR2.1 VettoreThermofisher ScientificK2030-01

References

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  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

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Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

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