La convalida delle attività enzimatiche coinvolte in processi biochimici può essere chiarita utilizzando l'analisi complementazione funzionale (FCA). Descritto in questo manoscritto è il saggio FCA dimostrare l'attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli amminoacidi, risposta stringente batterica e batterica biosintesi peptidoglicano.
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Articolo metodologico
Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways
In questo articolo
Sommario
Abstract
Saggio complementazione funzionale (FCA) è un test in vivo che è ampiamente utilizzato per chiarire la funzione / ruolo dei geni / enzimi. Questa tecnica è molto comune in biochimica, genetica e molte altre discipline. Una panoramica completa della tecnica per integrare l'insegnamento delle vie biochimiche inerenti agli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta stringente batterica è riportato in questo manoscritto. Due cDNAs dalla pianta modello thaliana organismo Arabidopsis che sono coinvolti nel metabolismo della lisina (L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) e tirosina aminotransferasi (tyrB) coinvolti nel metabolismo di tirosina e fenilalanina sono evidenziate. Inoltre, il peptidoglicano batterico pathway anabolizzante è evidenziato attraverso l'analisi del -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (MURE) gene UDP N dal batterio Verrucomicrobium spinosum coinvolti nella croce-libreria di peptidoglicano. La risposta stringente batterica è riportato anche attraverso l'analisi del rsh (R ELA / s pot h Omolog) gene bifunzionale responsabile di un fenotipo iper-mucoide nel sp batterio Novosphingobium. Quattro esempi di FCA sono presentati. Nel video si concentrerà su tre di loro, vale a dire lisina, peptidoglicano e la risposta stringente.
Introduzione
complementazione funzionale nel contesto di chiarire la funzione (s) / ruolo (s) di un gene viene definita come la capacità di un particolare omologo o gene orthologous ripristinare un particolare mutante con un fenotipo osservabile allo stato wild-type quando l'omologa o gene orthologous è introdotto in cis o trans in secondo piano mutante. Questa tecnica è stata ampiamente usata per isolare e identificare la funzione (s) / ruolo (s) di molti geni. Un esempio particolare è l'isolamento e l'identificazione di orotidina-5-fosfato decarbossilasi da Candida albicans utilizzando il mutante URA3 di S. cerevisiae e i....
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Protocollo
NOTA: Gli autori sono disposti a fornire ceppi batterici e plasmidi ricombinanti per facilitare l'inserimento di analisi complementazione funzionale a scopo didattico per gli individui che sono interessati. I plasmidi che sono stati utilizzati per facilitare esperimenti di complementazione funzionali sono elencati nella Tabella 1.
1. Costruzione di plasmidi per complementazione funzionale
- Clonazione di Diaminopimelate aminotransferasi (dapL) per complementazione funzionale.
- Amplificare il quadro di lettura aperto dapL (ORF) dal V. spinoso e cDNAs da A. thaliana e C. reinha....
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Risultati
I ceppi batterici che sono impiegati nelle varie analisi di complementazione funzionali sono riportati in Tabella 2.
Analisi Funzionale complementazione: L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL)
Il E. coli doppio mutante AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) ospita una mutazione nel gene Dape e una delezione completa del gene D.......
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Discussione
Molti dei corsi che sono parte integrante del Biotecnologie e Bioscienze molecolare curriculum presso il Rochester Institute of Technology hanno una componente di laboratorio in aggiunta alla quota lezione del corso. Il piano di studi per l'anno accademico 2014-2015 contiene un totale di 48 corsi, 29 dei quali contengono una componente di laboratorio che rappresentano circa il 60%. Un tale corso è Fondamenti di piante Biochimica e Patologia (FPBP), una conferenza / corso di laboratorio miscelati e Bioseparations: pr.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
AOH e MAS riconosce il College of Science e Thomas H. Gosnell School of Life Sciences presso il Rochester Institute of Technology per il supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Stati Uniti National Science Foundation (NSF) premio a AOH MCB-1.120.541.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| E. coli mutanti | Hudson/Savka lab o CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)Electroporator | ||
| Biorad-USA | 1652100 | ||
| Cuvette per elettroporazione | Biorad-USA | 1652082 | |
| Incubatrice a temperatura controllata | Microcentrifuga Generica | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Brodo | Thermofisher Scientific 12795084 | ||
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Destrosio di Patate Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamicina | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelato | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Timina | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Cloramfenicolo | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tirosina | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Fenilalanina | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartato | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valina | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucina | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucina | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinosio | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetraciclina | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polimerasi | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platino pfx DNA polimerasi | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligasi | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alfa | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/vettore topografico | Thermofisher | Scientific K100-01 | |
| pCR2.1 Vettore | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
Riferimenti
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.
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Ristampe e permessi
