Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete S. venezuelae Ciclo di vita Uso di un dispositivo a microfluidi

Streptomycetes sono batteri che vivono nel suolo che sono caratterizzati da un ciclo di sviluppo complesso che coinvolge la differenziazione morfologica da un multicellulare, nutriente-lavaggio micelio di dormienti, spore unigenomic ^1-3.

In condizioni di crescita favorevoli, una spora tipici Streptomyces comincia a germinare estrudendo uno o due tubi germinali (Figura 1). Questi tubi allungare per estensione punta e crescono in una rete ramificata ifale conosciuto come il micelio vegetativo. la crescita polare e ifale ramificazione è diretto dal DivIVA essenziale delle proteine. Questa proteina coiled-coil è parte di un grande complesso citoplasmatico chiamato polarisome, che è cruciale per l'inserimento di nuovo materiale dell'involucro cellulare sulla punta estendentesi ^4-7. Durante la crescita vegetativa, i filamenti ifali diventano compartimentato dalla formazione infrequente dei cosiddetti trasversali pareti ^8. La formazione di queste pareti trasversali ri quaderni FtsZ, la tubulina, come le proteine ​​del citoscheletro che è essenziale per la divisione cellulare nella maggior parte dei batteri ^9. In Streptomyces, tuttavia, questi vegetative trasversali pareti non portano ad costrizione e cellula-cellula separazione e quindi la massa miceliari rimane come una rete di compartimenti sinciziale interconnessi. In risposta alla limitazione di nutrienti e altri segnali che non sono ben compresi, ife aerea specializzata staccarsi dal micelio vegetativo e crescere in aria ^3. La costruzione di queste strutture avvia la fase riproduttiva dello sviluppo, durante la quale il lungo ife aeree multi-genomica diventare diviso in decine di uguali dimensioni compartimenti prespore unigenomic. Questo massiccio evento divisione cellulare è guidato dalla costrizione sincrono di anelli multipli FtsZ all'interno singolo ^2,10 ife sporigeni. differenziazione morfologica si completa con il rilascio di dormienti, spore, pigmentate spesse pareti.

I principali eventi di sviluppo del ciclo di vita Streptomyces sono ben caratterizzati ^1,3. Tuttavia, ciò che è ancora scarse sono studi sulle cellule biologiche che utilizzano la fluorescenza time-lapse microscopia a fornire una conoscenza dei processi alla base subcellulari differenziazione, come ad esempio le dinamiche di localizzazione della proteina, il movimento dei cromosomi e la divisione cellulare evolutivamente controllata. Live-cell imaging di sviluppo Streptomyces è difficile a causa della complessità del ciclo di vita e le caratteristiche fisiologiche dell'organismo. Precedenti studi sulla crescita vegetativa e le fasi iniziali di sporulazione septation hanno impiegato camere di imaging ossigeno-permeabile, o la crescita agarosio supportata di Streptomyces coelicolor su un palco microscopio ^11-15. Questi metodi, tuttavia, sono limitati da una serie di fattori. Alcuni sistemi consentono solo di imaging a breve termine di una crescita cellulareproteine ​​fluorescenti D Prima cellule soffrono di apporto di ossigeno insufficiente o crescere fuori del piano focale dovuta al modello tridimensionale di sviluppo ifale. Nei casi in cui l'imaging a lungo termine è possibile, coltivando le cellule sui rilievi agarosio limiti di flessibilità sperimentale perché le cellule non possono essere esposti a condizioni di crescita o di stress alternativi, e la fluorescenza di fondo dalla media delle pastiglie agarosio limita fortemente la possibilità di monitorare a fluorescenza più debole segnali.

Qui si descrive un protocollo per live-cell imaging del ciclo di vita completo Streptomyces con ottima precisione e sensibilità. Con crescente Streptomyces in un dispositivo microfluidica collegato ad un microscopio a fluorescenza widefield (figura 2), siamo ora in grado di monitorare la germinazione, crescita vegetativa e la sporulazione septation per un periodo di tempo fino a 30 ore. Questo è notevolmente facilitata dall'utilizzo dei nuovi Streptomyces organismo modello venezuelae perché sporulates al di completamento nella cultura sommersa e quindi supera la limitazione della specie modello classico S. coelicolor, che sporulates solo su terreni solidi ^16-20. Per aiutare a visualizzare la crescita vegetativa e la sporulazione, abbiamo co-Express fluorescente tagged versioni del marcatore DivIVA polarità cellulare e la chiave di proteine ​​divisione cellulare FtsZ.

Stiamo utilizzando un dispositivo di microfluidica disponibile in commercio che è stato impiegato con successo per micobatteri, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e lievito ^21-25. Il sistema intrappola cellule in un unico piano focale e permette il controllo di perfusione continua di terreno di coltura da diversi serbatoi. Nel protocollo dettagliato approfittiamo di questa funzione per esporre S. venezuelae micelio vegetativo ad una scalata nutrizionale per promuovere la sporulazione.

Il protocollo deScribed è per l'imaging dal vivo di cellule di tutto il ciclo di vita Streptomyces, ma le condizioni di media alternativi o le impostazioni del microscopio può essere scelto se specifici stadi di sviluppo sono di particolare interesse.

Figura 2: Schema che descrive il flusso di lavoro sperimentale. Vengono visualizzati i tre passaggi principali descritti nel protocollo. Innanzitutto, spore e mezzo trascorso sono preparati da una cultura fase stazionaria. In secondo luogo, le spore freschi vengono caricati in un sistema di microfluidica e S. venezuelae viene esposta in tutto il suo ciclo di vita di sviluppo utilizzando un microscopio invertito completamente automatica con camera di incubazione a mantenere una temperatura di crescita ottimale. In terzo luogo, la serie di time-lapse ottenuto viene analizzato ed elaborati utilizzando il software open-source Fiji.

1. Isolamento di Fresh S. venezuelae spore e Preparazione del terreno di coltura esaurito

1. Seminare 30 ml maltosio-Yeast Extract-estratto di malto (MYM) medio, integrato con 60 microlitri R2 soluzione oligoelemento (TE), con 10 microlitri spore di tensione SV60 [ATTB _{φ BT1} :: pSS209 (P _divIVA - divIVA-mCherry P _FtsZ -ftsZ-ypet)]. Per la crescita costante e sporulazione delle cellule, utilizzare un pallone confuso o un pallone che contiene una molla per consentire una sufficiente aerazione.
2. cellule di coltura per 35-40 ore a 30 ° C e 250 rpm.
3. Esaminare le cellule di liquido montato microscopio a contrasto di fase. A questo punto frammenti e spore micelio saranno visibili.
4. Centrifuga 1 ml cellule in una centrifuga da tavolo a 400 xg per 1 minuto per far sedimentare il micelio e frammenti di cellule più grandi.
5. Trasferire circa 300 microlitri surnatante containing una sospensione di spore in una nuova provetta da 1,5 ml e tenere in ghiaccio. Tenere il terreno di coltura per la restante fase 1.7.
6. Diluire spore 1:20 in MYM-TE (concentrazione finale: 0,5-5 x 10 ⁷ spore / ml) e tenere in ghiaccio fino al momento (vedi punto 2.3).
   Nota: Anche se le esatte condizioni che scatenano sporulazione in Streptomyces non sono compresi, utilizzando speso medio MYM-TE, comprese le eventuali segnali extracellulari sconosciuti da una cultura sporulanti, stimola la sporulazione.
7. Filtro-sterilizzare 10 ml di terreno di coltura residuo per ottenere speso MYM-TE che è libero di spore e frammenti di micelio. Utilizzare un filtro siringa da 0,22 micron sterile e trasferimento trascorso MYM-TE a una provetta sterile 15 ml.
8. Tenere il preparato speso MYM-TE per alcuni giorni a 4 ° C, se gli esperimenti aggiuntivi utilizzando le condizioni di crescita simili devono essere effettuate.

2. Preparazione del dispositivo a microfluidi

Nota: ogni pla microfluidicate permette fino a quattro esperimenti indipendenti da effettuare. Per evitare la contaminazione delle camere di flusso non utilizzati, usare soluzioni sterili e le condizioni di lavoro quando si imposta un esperimento.

1. Rimuovere soluzione di spedizione dalla piastra microfluidica e lavare i pozzetti con sterili MYM-TE.
2. Aggiungere 300 ml MYM-TE a presa bene 1 e 300 ml speso MYM-TE per pozzi da 2 a 6.
3. Caricare 40 ml diluiti spore dal punto 1.6 a carico delle cellule ben 8 di corsia "A" e sigillano il collettore alla piastra secondo le istruzioni produce.
4. Avviare il software di controllo microfluidica, selezionare il tipo di piatto appropriato e impostare un programma di flusso per innescare il canale di flusso e la camera di cultura da parte di media che scorre da pozzi di ingresso da 1 a 5 a 6 psi per 2 minuti per pozzetto.
5. Nel software di controllo microfluidica, creare un protocollo di flusso per l'esperimento: scorre MYM-TE dal bocchettone 1 per 6 ore per consentire la germinazione e la crescita vegetativa delle cellule. Interruttorepoi perfusione trascorso MYM-TE da ben 2 a 5 per il tempo rimanente dell'esperimento. Nel corso dell'esperimento mantenere costante la pressione di flusso a 6 psi (corrispondenti a circa 9 microlitri medio / hr). Avviare il programma di flusso dopo la fase 3.5.

3. Impostazione del microscopio e il protocollo Time-lapse

Nota: Questo metodo è stato implementato su un microscopio invertito widefield completamente motorizzato e automatizzato dotato di una fotocamera sCMOS, una lampada ad alogenuri metallici, una messa a fuoco automatica dell'hardware, un supporto palcoscenico per 96 pozzetti e una camera climatica.

1. Pre-riscaldare la camera ambientale di 30 ° C in anticipo per evitare problemi con l'autofocus dopo l'inizio dell'esperimento. Il tempo richiesto dipende dalla camera ambientale usato, il microscopio e il sistema di riscaldamento. Iniziare a riscaldare il sistema la notte prima dell'esperimento.
2. Accendere il microscopio e l'automazione e il controllo microscopio softwari. Utilizzare un'alta apertura numerica (NA) obiettivo ad immersione per la raccolta ottimale del segnale e risoluzione spaziale, come ad esempio un 100X, 1.46 olio NA obiettivo DIC. Selezionare filtri appropriati e specchi bicrome di acquisire differenziale di contrasto interferenze immagini (DIC) e le immagini di fusioni di proteine ​​di colore giallo-fluo e rosso-fluorescenti.
3. Mettere una goccia di olio di immersione sul oggettivo e aggiungere liquido di immersione al fondo della finestra di imaging sulla piastra microfluidica per migliorare cell-focus durante l'acquisizione dell'immagine. montare con attenzione il dispositivo di microfluidica sigillata (passo 2.5) sul palco del microscopio invertito. Assicurarsi che la piastra sia posizionato correttamente nel supporto fase e non si sposta nel corso dell'esperimento.
4. Portare la finestra di imaging della camera di cultura microfluidica a fuoco utilizzando gli indicatori di posizione integrati per l'orientamento. Primo sulla parte sinistra della prima camera di flusso (etichetta "A") con la dimensione trap 5, corrispondenti aun'altezza trappola di 0,7 micron.
5. Nel software microfluidica, celle di carico dal bocchettone 8 a 4 psi per 15 sec. Controllare la densità delle cellule nella camera di coltura spostando la fase attraverso la finestra di imaging. Se non spore sono stati intrappolati, ripetere la fase di caricamento delle cellule oppure aumentare la pressione e / o il tempo di caricamento fino a raggiungere la densità cellulare desiderato (1-10 spore per finestra di imaging con 2.048 x 2.048 pixel). Evitare di sovraccaricare la camera di cultura.
   Nota: normalmente si usa dimensioni trappola 5 per l'imaging Streptomyces, ma abbiamo anche ottenuto buoni risultati con la trappola grandezze 4 e 3. Consultare il manuale del fornitore per ulteriori suggerimenti su come ottimizzare il processo di caricamento delle cellule.
6. Avviare il programma di flusso nel software di controllo dal punto 2.5 e lasciare che la piastra microfluidica per riscaldare-stabilizzi per 1 ora in fase di microscopio prima di avviare l'acquisizione dell'immagine.
7. Nel software di controllo del microscopio, impostare una acquisizione multi-dimensionale di prendere muimmagini ltiple a più posizioni di scena nel corso del tempo:
   1. Per Salvataggio automatico: specificare la directory per il salvataggio automatico dei file di immagine.
   2. Per le impostazioni di illuminazione, determinare le impostazioni di illuminazione ottimali per ogni costrutto specifica in anticipo. Per l'esperimento descritto, utilizzare i seguenti tempi di esposizione: DIC 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec.
   3. Per Time-series: impostare una serie di tempo per acquisire le immagini in corrispondenza dei punti di tempo desiderato in sequenza. Per l'imaging del ciclo di vita di S. venezuelae, selezionare un intervallo di tempo di 40 minuti per un periodo di 24 ore.
   4. Per le posizioni di scena e messa a fuoco automatica: scansione della camera di cultura spostando le posizioni palco e palco negozio per ogni posizione di imaging di interesse. Assicurarsi che le singole posizioni stadio si trovano sufficientemente a parte per ridurre al minimo photobleaching e phototoxicity.Typically utilizzano fino a 12 posizioni. routine di messa a fuoco automatica Eseguire per ogni punto di tempo per correggere la deriva focale lento. Se disponibile nel software di controllo del microscopio, La strategia messa a fuoco automatica è impostato su "aggiornamento superficie locale messa a fuoco automatica dell'hardware". Una volta che le Z-coordinate delle posizioni stadio selezionato sono verificate, attivare la messa a fuoco automatica dell'hardware.
8. Avviare l'esperimento time-lapse nel software di controllo del microscopio.
9. Verificare che tutte le posizioni di scena sono ancora a fuoco nei punti successivi. Per gli esperimenti time-lapse in esecuzione su diverse ore, occasionalmente osserviamo una deriva palco anche quando si utilizza l'autofocus. Se le posizioni fase devono essere riorientato, interrompere l'esperimento in un punto momento opportuno, regolare il fuoco e riavviare l'esperimento entro l'intervallo di tempo di imaging definito (punto 3.7.3). Vedere il punto 4.3 per come concatenare le serie storiche.
10. Smettere di acquisizione delle immagini dopo 24-30 ore o quando le ife nella regione di interesse sono differenziate in spore (vedi DIC serie di immagini). Fermare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo a microfluidi.
11. Preparare piatto microfluidica utilizzato per sto a breve terminerabbia. Rimuovere restante MYM-TE e ha trascorso MYM-TE da ben 1 a 6, ben rifiuti vuoto 7 e il caricamento delle cellule ben 8. In condizioni sterili, ri-riempire pozzi di corsia "A" e pozzi di piste non utilizzati ( "B" utilizzato per "D") sulla piastra con sterile tampone fosfato (PBS). Sigillare la piastra con parafilm per evitare che si secchi e conservare a 4 ° C.

4. Generazione di Time-lapse film usando Fiji Software

Nota: Prendiamo atto che diversi pacchetti software commerciali e di connessione sono a disposizione per elaborare le immagini di microscopia time-lapse compreso ZenBlue, Metamorph, ICY, ImagePro o ImageJ. Qui ci concentriamo su Fiji, che è un programma di elaborazione delle immagini open-source basata su ImageJ, e che già fornisce una serie di utili plug-in preinstallati.

1. dati di imaging trasferimento dal vostro esperimento time-lapse a un computer che ha installato Fiji.
2. Avviare il programma e importare il file di immagini utilizzando &# 34; File> Importa> Bio-formati ". O semplicemente trascinando il file di immagini in Fiji In"-Formati Bio opzioni di importazione ", spuntare la casella" canali Split "per ottenere una pila di un'immagine separata per ogni canale illuminazione (DIC , RFP, YFP).
3. Opzionale: Per unire serie temporale separata risultante da una pausa nel nella acquisizione delle immagini a causa della rifocalizzazione (passo 3.9), aprire rispettive pile di immagini ed eseguire "Immagine> Stack> Strumenti> concatenare" per ciascun canale (DIC, RFP, YFP ).
4. Valutare la qualità dei dati time-lapse scorrendo le pile di immagini. Cercare ife che rimase a fuoco nel corso del tempo, spettacolo crescita del micelio e, infine, formare spore (DIC stack). Esaminare la localizzazione subcellulare prevista per DivIVA-mCherry a punte ifali (stack RFP) e FtsZ-YPet formando anelli singoli o multipli, strutture scala simili a vegetativa o sporigeni ife (stack YFP), rispettivamente.
5. Isolare una regione di interesse per i Processi a valleng delle immagini. Time-lapse microscopia spesso produce file di grandi dimensioni, che possono rallentare l'elaborazione da parte Fiji. Si raccomanda pertanto di identificare e isolare una regione di interesse (ROI) e per eseguire ulteriori fasi di elaborazione dell'immagine in questa versione più piccola della serie di immagini.
   1. Selezionare lo strumento "rettangolare Selezione" nel menu e disegnare una ROI rettangolare nella serie di immagini DIC in modo tale che le ife sviluppo sono racchiusi dalla ROI tutta la serie di immagini.
   2. Duplicate ROI-stack con "Ctrl" + "Shift" + "D".
   3. Fare clic sulla barra nome della pila di immagini YFP e selezionare "Modifica> Selezione> Ripristina Selezione" nel menu per ripristinare la precedente selezione rettangolare dall'originale DIC impilare allo stesso positon nello stack YFP e duplicare il ROI con "Ctrl" + "shift" + "D".
   4. Ripetere questo processo per lo stack RFP.
6. Allineare le immagini nell'immagine tre pile to rimuovere le derive di scena nel piano xy nel corso del tempo. Scorrere fino all'ultimo fotogramma nella pila DIC e selezionare "Plugin> Registrazione> StackReg> RigedBody" dal menu. Ripetere questo passaggio per la richiesta di offerta e la serie di immagini YFP. Se necessario, ritagliare il ROI ripetendo il passaggio 4.5.1-4.5.3.
7. Optional: Regolare la luminosità e il contrasto manualmente per ogni pila di immagini con il "regolare luminosità e contrasto Tool" ( "Ctrl" + "Shift" + "C"), oppure selezionare "Processo> Migliora contrasto" dal menu e applicare il "normalizzare" comando per tutte le immagini nella pila. Va osservato che quest'ultimo comando alterare i valori di pixel e può quindi influenzare analisi dell'immagine valle.
8. Opzionale: Combinare le singole pile (convertiti nel formato di file RGB, vedi 4.11) orizzontalmente o verticalmente utilizzando il plug-in "Immagine> Stack> Strumenti> Combine".
9. Aggiungere una barra di scala ( "Analizza> Strumenti> Scala Bar") e una matrice di tempo (&# 34; immagine> Stack> Tempo Stamper ").
10. Salva pile di immagine modificati come una sequenza di immagini nel formato ".tiff". Per produrre un film, salva come ".avi". In alternativa, serie di immagini di esportazione in formato QuickTime con il "Bio-Formati> Bio-Formati Exporter" plug-in e selezionare il tipo di file ".mov".
11. Per ottenere immagini da singoli fotogrammi, selezionare il frame di interesse e duplicare l'immagine "Ctrl" + "Shift" + "D". Cambiare il tipo di immagine risultante in "RGB" o "8-bit" sotto "Immagine> Tipo> colore RGB o 8-bit" e salvare l'immagine come ".tiff".
    Nota: Fiji offre una serie di funzioni aggiuntive per annotare ulteriormente o serie processo di time-lapse. Vai a supporto online Fiji per informazioni dettagliate (http://fiji.sc/Fiji).

Il live-cell imaging di successo di tutta la S. venezuelae ciclo di vita produce una serie temporale continuo, compresa la chiave fasi di sviluppo di germinazione, crescita vegetativa e sporulazione (Figura 3, Film 1). Visualizzazione della progressione attraverso il ciclo di vita viene ulteriormente rafforzata dalla localizzazione subcellulare distinto di DivIVA-mCherry e FtsZ-YPet. Durante la germinazione e la crescita vegetativa, DivIVA-mCherry accumula esclusivamente alle punte ifali crescita o marchi di nuova formazione punti di diramazione (Figura 4A). Questi risultati sono in linea con il posizionamento subcellulare precedentemente riportato di DivIVA 12,26. Al contrario, FtsZ-YPet forma singole strutture ad anello simile a intervalli irregolari nel crescente micelio (Figura 4B). Queste strutture forniscono l'impalcatura per la sintesi di non costrittiva vegetative incrociati pareti, portando alla formazione di interconnette scomparti ifali 8. La differenziazione cellulare di crescere ife in ife sporigeni diventa visibile dalla scomparsa polare foci DivIVA-mCherry, l'arresto della crescita polare e l'aumento concomitante di FtsZ-YPet fluorescenza (Figura 4C). In sporulanti ife, il modello di localizzazione di FtsZ-YPet cambia radicalmente; primi elicoidale filamenti FtsZ-YPet cadere lungo la ifa e poi, in un improvviso evento, quasi sincrono, queste eliche si fondono in una scala di anelli FtsZ-YPet intervalli regolari. Nelle condizioni sperimentali qui descritte, queste scale FtsZ-YPet uniformemente distribuiti persistono per circa 2 ore. Infine, la sporulazione setti diventare visibile nelle contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini (Figura 4D) e, infine, le nuove spore vengono rilasciati.

Il successivo protocollo che descrive l'elaborazione delle immagini utilizzando il software Fiji fornisce come TEP-by-step spiegazione di come produrre un film per la pubblicazione della serie time-lapse acquisita (Film 1).

Figura 3: Istantanee da un rappresentante di fluorescenza time-lapse serie di microscopia di S. venezuelae producendo fluorescente FtsZ (verde) e DivIVA (rosso) sono riportati fotogrammi selezionati delle immagini fuse (pannello superiore: RFP-YFP-DIC, pannello inferiore: DIC). visualizzazione del ciclo di vita Streptomyces tra cui la germinazione, crescita vegetativa e la sporulazione. Le immagini sono state prese da film 1. Il tempo è in h: min. Scala bar = 5 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Risultati rappresentativi per una serie time-lapse con successo il ciclo di vita Streptomyces (A) Localizzazione di DivIVA-mCherry.. vengono riportati istantanee di due successivi punti temporali da Film 1 con immagini unite della richiesta di offerta e canali DIC. DivIVA-mCherry segna nuovi siti filiali ifale (testa freccia piena) e localizza sulla punta ifale per dirigere la crescita polare (aperto punta di freccia). Barra di scala = 10 micron (B) FtsZ-YPet localizzazione durante la crescita vegetativa (punta di freccia). FtsZ-YPet forma strutture ad anello-come singoli (pannello superiore) che non restringono (DIC, pannello inferiore). (C) FtsZ-YPet (verde) di localizzazione durante la sporulazione septation. foci DivIVA-mCherry sono mostrati in rosso, con il tempo trascorso illustrato di seguito (h: min). barra della scala: 5 micron. (D) corrispondenti immagini DIC della ife sporulanti da (C) che mostra la formazione di compartimenti prespore con setti sporulazione visibile (immagine a sinistra), che alla fine maturano in una catena di spore (immagine a destra). Il tempo è in h: min. Scala bar = 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Film 1: Time-lapse serie microscopia a fluorescenza delle Streptomyces venezuelae ciclo di vita Il film è composto da immagini unite RFP-YFP (a sinistra) e le immagini corrispondenti contrasto interferenziale differenziale (DIC) (a destra).. DivIVA-mCherry è mostrato in rosso e FtsZ-YPet in verde. L'intervallo di tempo tra singoli fotogrammi è di 40 min. Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere This film.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.