Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

Sommario

L'organo uditivo media l'udito. Qui presentiamo un metodo di micro-elettroporazione in ovo modificato ottimizzato per lo studio della proliferazione e della differenziazione delle cellule progenitrici uditive nell'organo uditivo del pollo in via di sviluppo.

Abstract

Embrioni di pollo sono sistemi modello ideale per lo studio dello sviluppo embrionale, come manipolazioni di funzione del gene possono essere svolte con relativa facilità in ovo. L'orecchio interno uditiva organo sensoriale è fondamentale per la nostra capacità di sentire. Ospita un epitelio altamente specializzato sensoriale che è costituito da cellule ciliate meccano-trasduzione (HC) e dintorni gliali-come le cellule di supporto (SCS). Nonostante le differenze strutturali negli organi uditivi, meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo dell'organo uditivo sono evolutivamente conservati tra mammiferi e aves In elettroporazione Ovo è in gran parte limitata alle prime fasi a E1 -. E3. A causa della relativa ritardato sviluppo dell'organo uditivo a E5, manipolazioni dell'organo uditivo di elettroporazione in ovo passato E3 sono difficili a causa dello sviluppo advanced dell'embrione di pollo in fasi successive. Il metodo qui presentato è un metodo di trasferimento genico transitoria per il targeting dei geni di interesse afase E4 - E4.5 in via di sviluppo pollo uditivo organo sensoriale via in ovo micro-elettroporazione. Questo metodo è applicabile per GAIN- e perdita di funzioni con plasmide convenzionale vettori di espressione basati sul DNA e può essere combinato con in saggio di proliferazione delle cellule ovo aggiungendo EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) per l'intero embrione allo tempo di elettroporazione. L'uso di proteina fluorescente verde o rosso (GFP o RFP) plasmidi di espressione consente allo sperimentatore di determinare rapidamente se l'elettroporazione di mira con successo la porzione uditiva del sviluppo dell'orecchio interno. In questo lavoro il metodo, esempi rappresentativi di esemplari GFP elettroporate sono illustrate; embrioni sono stati raccolti 18-96 ore dopo l'elettroporazione e il targeting della GFP per l'area pro-sensoriale dell'organo uditivo è stata confermata da RNA ibridazione in situ. Il documento metodo fornisce anche un protocollo ottimizzato per l'uso della timidina analogico EdU analizzare prolif cellulerazione; un esempio di un saggio di proliferazione cellulare basato EdU che combina immuno-etichettatura e cliccare EdU chimica è fornito.

Introduzione

Nonostante le differenze nella morfologia e patterning cellulare tra mammiferi e aviaria organo sensoriale uditivo, i fattori molecolari e dei percorsi responsabili dello sviluppo HC sensoriali sono pensati per essere evolutivamente conservato ^1-3. La papilla basilare, che ospita le HC uditive e le loro SC circostanti, si sviluppa come un outpocketing del otocyst dell'orecchio interno. Nella fase iniziale di un pool di progenitori HC e SC è specificato all'interno del / otic dominio competente tazza neurale-sensoriale otic placode (NSD). Fate dati di mappatura dimostrano che lignaggi neuronali e sensoriali sono collegati e nascono dalla NSD situato nella regione antero-ventrale della coppa otic o otocyst nei topi e pollo ^4,5. In primo luogo, neuroblasti delaminano dal NSD per dare origine ai neuroni del ganglio uditivo-vestibolare, che alla fine diviso in gangli uditivo e vestibolare. Questi neuroni innervano i HC sensoriali dell'orecchio interno e nuclei del tronco cerebrale. Le cellule Tha rimanere nel NSD si pensa di dare origine a varie patch sensoriali, tra cui l'organo sensoriale uditivo, costituito dai HC sensoriali meccano-trasduzione e le loro SC associati.

In entrambi il pulcino e murino, organo uditivo progenitrice sensoriale uscita del ciclo cellulare e la differenziazione HC si verificano in opposte gradienti. In pulcino, uditivo progenitrice uscita del ciclo cellulare inizia intorno ~ E5 e progredisce dalla base all'apice, e dal centro alla periferia ^6. Il giorno dopo, la differenziazione HC inizia nel vertice e progredisce alla base ^7. Studiando lo sviluppo dell'orecchio interno nei polli offre molti vantaggi tecnici meccanismi funzionali possono essere studiate con relativa facilità in ovo al contrario di manipolare embrioni in utero in altri sistemi modello, che richiede interventi complessi. Il metodo descritto qui utilizza in ovo micro-elettroporazione per indirizzare i geni di interesse nella Basila presuntivaR zona della papilla antero-ventrale nella vescicola otica specificamente a E4.

Elettroporazione in ovo è una tecnica che è ben consolidata e comunemente usato ^8-14. Il principio della tecnica elettroporazione si basa sul fatto che i nucleotidi (ad esempio, DNA plasmidico, DNA sintetico, o RNA oligonucleotidi) sono caricati negativamente. Il DNA viene iniettato nel tessuto di interesse. Quando una corrente elettrica viene inserito attraverso il tessuto, la corrente si apre pori transitori nelle pareti cellulari e permette l'assorbimento del DNA, come il DNA caricato negativamente fluisce verso l'elettrodo positivo (anodo). Per gli esperimenti di guadagno di funzione, i geni di interesse sono comunemente subclonati in plasmidi di espressione che contengono adeguate cassette di espressione per Green Fluorescent Protein (GFP) o proteina fluorescente rossa (RFP). Per la perdita di funzione esperimenti plasmide-based dominanti costrutti negativi repressori, o RNAi, o costrutti morpholino sono commonly usato ^15,16. Per inibire microRNA (miRNA) funzione miRNA costrutti spugna, che sono tipicamente plasmide base, può essere utilizzato ^17. Il metodo qui descritto permette di indagare i meccanismi molecolari che controllano la proliferazione e la differenziazione nell'organo uditivo, come nel metodo di micro-elettroporazione ovo possono essere facilmente combinati con in test di proliferazione cellulare ovo aggiungendo EdU a tutta dell'embrione.

L'elettroporazione e l'aggiunta di EdU viene eseguita a E4 nella vescicola otica, che è un giorno prima della comparsa di uscita del ciclo cellulare nell'organo uditivo. L'analisi dell'organo uditivo è in genere eseguita 18-96 ore dopo l'elettroporazione in E5 (insorgenza di uscita del ciclo cellulare progenitrici sensoriale), E6 (insorgenza di differenziazione HC), e E7 (durante la differenziazione HC); e poi fino a ~ E9 (fine differenziazione HC). Questo metodo elettroporazione del trasferimento genico è transitorio della durata di circa ~ 4 giorni, because i geni di interesse non si integrano nel genoma, ma il metodo è applicabile per l'uso con adeguato plasmide vettori di espressione basati sul DNA, che hanno la capacità di integrarsi nel genoma, come ad esempio il trasferimento genico mediato Tol2 ^11. Con questo metodo GFP robusto o espressione RFP dura ~ 4 giorni nella coclea, dopo che indicano i segnali di dissolvenza, ma forniscono una finestra di tempo sufficiente per studiare lo sviluppo intricato dell'organo uditivo. Questo metodo di trasferimento genico in ovo è nuovo e consente di indirizzare specificamente l'organo uditivo presuntiva in E4, che è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell'organo uditivo. Si tratta di una buona aggiunta ai metodi alternativi, che l'elettroporazione in molto più giovani stadi di sviluppo o ^11,12 rispetto all'uso di in vitro basilare papille culture espianto ^18.

Protocollo

Le uova non schiuse e gli embrioni sono curati e trattati eticamente e umanamente. Tutti i protocolli per l'uso degli embrioni unhatched sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Usa presso la Johns Hopkins School of Medicine, Baltimora, Maryland.

1. Le uova e la preparazione di costrutti di espressione

1. Uova:
   1. Incubare 3-4 dozzina di uova di gallina fecondate (Gallus gallus) disteso su un fianco a 37 ° C.
      1. Dopo 24 ore di incubazione, tirare 3 cc di albume con una siringa dal back-end round del uovo e sigillare il foro con nastro adesivo trasparente. Questo crea una camera d'aria tra l'embrione e il guscio, consentendo facilità di accesso all'embrione senza l'embrione attaccare allo scafo durante il taglio la finestra di accesso sulla parte superiore dell'uovo ^19.
      2. A 117 ore di tempo di incubazione, in scena gli embrioni in base alla Hamburger e Hamilton ²⁰ fasi di sviluppoa E4 (HH24-25) (Vedi Figura 1D).
2. Espressione crea:
   1. Preparare il DNA plasmide utilizzando reagenti e il protocollo fornito dal produttore di un kit di preparazione disponibile in commercio. Nella fase finale di preparazione, eluire il DNA in 500 microlitri TE (Tris-EDTA) tampone fornito nel kit in una provetta da 1,5 ml.
   2. Etanolo precipitare il DNA di concentrare aggiungendo 50 ml di 3 M acetato di sodio e 1 ml di etanolo al 100% al tubo. Posizionare il tubo a -20 ° CO / N.
   3. Centrifugare la provetta per 30 min a 14.000 rpm a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aria asciugare il pellet per 10 minuti a RT. Sciogliere il pellet in 15 microlitri di buffer TE, che dovrebbe ottenere una concentrazione di ~ 4 mg / mL.
      NOTA: Il controllo costrutti di espressione usati qui sono pMES-IRES-GFP ^10, che è guidato da un promotore di pollo β-actina, o PCI-H2B-IRES-RFP ^{10, che è guidato dal promotore CMV.}

2. Pollo In Ovo Micro-elettroporazione e In Ovo Cell Proliferation Assay

1. In Ovo micro-iniezione di Construct espressione e Micro-elettroporazione:
   1. Tirare i tubi di vetro capillari in aghi sottili con un estrattore di micro-pipetta con i seguenti parametri ottimizzati per un x 2,5 mm Box Platinum riscaldamento filamento 2.5: Pressione = 500, Calore = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, e ora = 150 msec (vedi tabella 1).
   2. Impostare la sinistra e fasi di micro-manipolatore di mano destra che fiancheggiano il microscopio (vedi figura 1A). Il micro-manipolatore Destro tiene il capillare ago di vetro e la sinistra-handed micro-manipolatore mantiene gli elettrodi (Figura 1A).
   3. Preparare l'ago capillare di vetro finemente tirato per la micro-iniezione tagliandola punta dell'ago con una pinza mentre lavora sotto il microscopio.
   4. Riempire l'ago manualmente a mano con il micro-manipolatore con 2,5 ml di DNA plasmidico colorati con 0,1% veloce verde mentre lavora sotto il microscopio.
   5. Mettere l'uovo sdraiata su un fianco all'interno di un dispositivo di stampo / uovo partecipazione (vedi Figura 1A). Tagliare una finestrella sulla parte superiore dell'uovo con le forbici ¹⁹ (Figura 1A).
   6. Mentre si lavora sotto il microscopio, aprire con cautela le due membrane sovrapposte l'embrione con pinze.
   7. Lavorando al microscopio, fornire circa ~ 0,5 ml di DNA plasmidico per il giusto lume vescicola otic da micro-iniezione manualmente utilizzando la mano destra utilizzando micro-manipolatore e micro-elettroporazione.
      1. Per fare ciò, micro-iniettare la giusta lume vescicole otic con il DNA con la mano destra micro-manipolatore (Figura 1B-D), mentre allo stesso tempo con la mano sinistra Holdinga pinza per stabilizzare la testa dell'embrione, perché la testa dell'embrione immerge nella fase E4. Non micro-iniezione passato lume vescicole otic, perché questo potrebbe danneggiare la vescicola otica.
      2. Subito dopo micro-iniezione mentre lavora sotto il microscopio, utilizzare la mano sinistra micromanipolatore per posizionare il positivo (anodo) 2 millimetri elettrodo di platino antero-ventrale vescicola otica destra e 2 millimetri negativo elettrodo (catodo) in parallelo 1 mm l'uno dall'altro (vedi Figura 1 C). Invia 4 impulsi a 12 V con durata di 100 msec e 200 msec spaziatura. La vescicola otica sinistra serve come un controllo non trattato interno.
         NOTA: Pulire gli elettrodi tra electroporations con un batuffolo di cotone imbevuto con punta in 1x PBS.
2. In Ovo Cell Proliferation Assay:
   1. Subito dopo l'elettroporazione aggiungere 50 ml di 0,25 mg / ml EdU in 1x PBS facendo cadere manualmente la soluzione di 50 microlitri EdU su tuttaembrione in ovo con una pipetta. Sigillare le uova con nastro e tornare alla incubatore per 18-96 ore.
   2. Rimuovere con attenzione il nastro e verificare gli embrioni per la GFP fluorescenza o il segnale di richiesta di offerta all'interno della vescicola otica dopo 18 - 24 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza standard (vedi Figura 1 EE '). Se segnale fluorescente è presente, a questo punto, raccogliere gli embrioni per analisi o richiudere con nastro adesivo e restituirlo al incubatore per la raccolta ed analisi in fasi successive (vedi Figura 1 FP '').
      NOTA: L'espressione di segnale GFP con il costrutto pMES-IRES-GFP è evidente 6-7 ore dopo l'elettroporazione ^10.

3. Embrione la raccolta e la lavorazione dei tessuti per l'RNA ibridazione in situ e immunoistochimica

1. Raccogliere gli embrioni con pinze. Lavare l'embrione in 1x PBS freddo. Rimuovere le teste degli embrioni, tagliando la testa per il collousando pinze, e posizionare le teste in paraformaldeide al 4% O / N a 4 ° C. Perforare il cervello utilizzando una pinza per consentire la penetrazione del paraformaldeide 4% all'interno della testa.
2. Disidratare le teste di 30% di saccarosio (in 1x PBS) O / N a 4 ° C.
3. Montare le teste a medio crioprotettiva da congelamento rapido in un impasto di ghiaccio secco e metilbutano (2-metilbutano). In alternativa, rapida congelare le testine in media crioprotettiva con azoto liquido. Conservare le teste montate a -80 ° C.
4. Cryosection le teste in 12 sezioni micron di tessuto di spessore e raccogliere tutte le sezioni di tessuto dell'orecchio contenenti interno su vetrini da microscopio superfrosted.
5. Eseguire RNA standard di ibridazione in situ e immunoistochimica come precedentemente descritto ^4,21, e analizzare per la proliferazione cellulare EdU seguendo il protocollo fornito dal produttore del kit.
   NOTA: le cellule dei capelli possono essere identificati utilizzando il coniglio policlonali α-MyosinVIIa (MYO7A) untibody (1: 1.000, Proteus Biosciences) e anticorpo secondario fluorescenza marcata (1: 250, di capra anti-coniglio AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Acquisizione Immagine e lavorazione

1. Prendere le immagini con apparecchiature di imaging digitale. Risultati Immagine immunoistochimica con un microscopio a fluorescenza standard ed i risultati dei controlli in loco utilizzando un microscopio a livello di campo standard (che vanno da 5x a 40x in un ingrandimento).
2. Elaborare le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini.

Risultati

In questo DNA metodo della carta plasmide composto di proteina fluorescente verde (GFP) cassette di espressione è stata mirata al pollo in via di sviluppo papilla basilare (BP) con parametri ottimizzati da 12 V e 4 impulsi con 100 durata degli impulsi msec e gli intervalli di 200 msec, ottenendo un ~ tasso di sopravvivenza del 50% degli embrioni e l'efficienza del plasmide-DNA mira alla BP. Imaging fluorescente di espressione GFP nativa in embrioni di mostrato questo metodo di elettr...

Discussione

Il metodo qui descritto di in ovo micro-elettroporazione è ottimizzato per il trasferimento genico in via di sviluppo dell'organo uditivo. E 'compatibile con il plasmide vettori di espressione basati sul DNA tipicamente utilizzati per manipolare la funzione del gene / espressione. I tempi di elettroporazione in E4 è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell'organo uditivo. Le fasi più critiche sono micro-iniezione del DNA nel lume vescicola otic senza andare troppo in profon...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sterile 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTX Harvard Apparatus
Banana a Micrograbber Kit di cavi	BTX Harvard Apparatus	45-0216
per destrimani e Micromanipolatori per mancini World	Precision Instruments Inc.	M3301R & M3301L
Due stadi per dispositivi di tenuta magnetici da 12 mm con montanti verticali da 7 pollici	World Precision Instruments Inc.	M10
12x24 pollici	World Precision Instruments Inc.	5479
Forbici per Uova lunghe 12 cm curve, lame extrafini da 12 mm; Forbici a molla	World Precision Instruments Inc.	14120
Estrattore Micropippette per aghi da tiro	Sutter Instrument Co.	P-97
2,5x2,5 mm Scatola Filamento di riscaldamento al platino	Sutter Instrument Co.
Tubi capillari in vetro/Aghi/Senza fibra/Borosil 1 mm	FHC	27-30-0
Siringa in vetro Hamilton 100 μ l	Hamilton	80601 Modello 710LT
Olio minerale (pesante) per siringa in vetro Hamilton	Fisher Scientific	O122-1
Tubo in polietilene per il collegamento della siringa in vetro e degli aghi pillari del tappo in vetro/ Non tossico	Becton Dickinson and Company (BD)	427420 Siringhe monouso da 3 cc Intramedic Clay Adams Becton
	Dickinson and Company (BD)	309657
Aghi monouso calibro 21	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
Un paio di elettrodi in platino da 2 mm	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
Portaelettrodo	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
Un paio di pinze fini Dumont numero 5	Fine Science Tools (FST)Nastro
invisibile con finitura opaca per sigillare le uova	Office Depot	520-928
Tamponi con punta in cotone	Fisher Scientific	23-400-101
Puntali

Piastra di base in acciaio metallico con filtro sterile