Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

Lale Evsen; Angelika Doetzlhofer

doi:10.3791/53864

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Articolo metodologico

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ

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DOI:

10.3791/53864

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17 aprile 2016

Lale Evsen¹ , Angelika Doetzlhofer¹

¹The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

In questo articolo

Sommario

L'organo uditivo media l'udito. Qui presentiamo un metodo di micro-elettroporazione in ovo modificato ottimizzato per lo studio della proliferazione e della differenziazione delle cellule progenitrici uditive nell'organo uditivo del pollo in via di sviluppo.

Abstract

Embrioni di pollo sono sistemi modello ideale per lo studio dello sviluppo embrionale, come manipolazioni di funzione del gene possono essere svolte con relativa facilità in ovo. L'orecchio interno uditiva organo sensoriale è fondamentale per la nostra capacità di sentire. Ospita un epitelio altamente specializzato sensoriale che è costituito da cellule ciliate meccano-trasduzione (HC) e dintorni gliali-come le cellule di supporto (SCS). Nonostante le differenze strutturali negli organi uditivi, meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo dell'organo uditivo sono evolutivamente conservati tra mammiferi e aves In elettroporazione Ovo è in gran parte limitata alle prime fasi a E1 -. E3. A causa della relativa ritardato sviluppo dell'organo uditivo a E5, manipolazioni dell'organo uditivo di elettroporazione in ovo passato E3 sono difficili a causa dello sviluppo advanced dell'embrione di pollo in fasi successive. Il metodo qui presentato è un metodo di trasferimento genico transitoria per il targeting dei geni di interesse afase E4 - E4.5 in via di sviluppo pollo uditivo organo sensoriale via in ovo micro-elettroporazione. Questo metodo è applicabile per GAIN- e perdita di funzioni con plasmide convenzionale vettori di espressione basati sul DNA e può essere combinato con in saggio di proliferazione delle cellule ovo aggiungendo EdU (5-etinil-2'-deossiuridina) per l'intero embrione allo tempo di elettroporazione. L'uso di proteina fluorescente verde o rosso (GFP o RFP) plasmidi di espressione consente allo sperimentatore di determinare rapidamente se l'elettroporazione di mira con successo la porzione uditiva del sviluppo dell'orecchio interno. In questo lavoro il metodo, esempi rappresentativi di esemplari GFP elettroporate sono illustrate; embrioni sono stati raccolti 18-96 ore dopo l'elettroporazione e il targeting della GFP per l'area pro-sensoriale dell'organo uditivo è stata confermata da RNA ibridazione in situ. Il documento metodo fornisce anche un protocollo ottimizzato per l'uso della timidina analogico EdU analizzare prolif cellulerazione; un esempio di un saggio di proliferazione cellulare basato EdU che combina immuno-etichettatura e cliccare EdU chimica è fornito.

Introduzione

Nonostante le differenze nella morfologia e patterning cellulare tra mammiferi e aviaria organo sensoriale uditivo, i fattori molecolari e dei percorsi responsabili dello sviluppo HC sensoriali sono pensati per essere evolutivamente conservato ^1-3. La papilla basilare, che ospita le HC uditive e le loro SC circostanti, si sviluppa come un outpocketing del otocyst dell'orecchio interno. Nella fase iniziale di un pool di progenitori HC e SC è specificato all'interno del / otic dominio competente tazza neurale-sensoriale otic placode (NSD). Fate dati di mappatura dimostrano che lignaggi neuronali e sensoriali sono collegati e nascono dalla NSD situato....