Method Article

Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell'angiotensina II

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per descrivere la localizzazione dei recettori dell'angiotensina II di tipo 1 nel cervello di ratto mediante autoradiografia quantitativa, densitometrica, in vitro del recettore utilizzando un analogo marcato con iodio-125 dell'angiotensina II.

Abstract

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Questo protocollo descrive recettore modelli vincolanti per angiotensina II (Ang II) nel cervello di ratto utilizzando un radiolegante specifico per i recettori Ang II per eseguire recettore mappatura autoradiografica.

campioni di tessuto sono raccolti e conservati a -80 ° C. Un criostato viene utilizzato per la sezione coronale del tessuto (cervello) e scongelare-montare le sezioni su vetrini cariche. Le sezioni di tessuto di diapositive montate sono incubati in 125 I-SI-Ang II radiomarcato recettori Ang II. Diapositive adiacenti sono separati in due gruppi: (NSP) in presenza di un recettore saturare concentrazione di non-radiomarcata Ang II, o un 'binding non specifico' AT 1 Ang II sottotipo recettoriale (AT 1 R) antagonista selettivo del recettore Ang II , e 'totale vincolante' senza AT 1 R antagonista. Una concentrazione di saturazione di AT 2 Ang II sottotipo recettoriale (AT 2 R) antagonista (PD123319, 10 micron) è presente anche nel incubatisul buffer di limitare 125 I-SI-Ang legame alla AT 1 R sottotipo II. Nel corso di un 30 minuti di pre-incubazione a ~ 22 ° C, scivoli NSP sono esposti a 10 micron PD123319 e losartan, mentre 'totale vincolante' diapositive sono esposti a 10 micron PD123319. I vetrini vengono poi incubate con 125 I-SI-Ang II in presenza di PD123319 per 'legame totale', e PD123319 e losartan per NSP nel tampone di dosaggio, seguita da diversi lavaggi '' nel buffer e acqua per eliminare il sale e non specificamente, legato radioligand. Le diapositive sono asciugati con blow-essiccatori, poi esposti a pellicola autoradiografia utilizzando una pellicola specializzato e cassetta. Il film è stato sviluppato e le immagini vengono scansionati in un computer per densitometria visiva e quantitativa utilizzando un sistema di imaging di proprietà e un foglio di calcolo. Un ulteriore insieme di diapositive sono thionin-macchiato per i confronti istologici.

Il vantaggio di utilizzare autoradiografia del recettore è la capacità di visualizzareAng II recettori in situ, all'interno di una sezione di un campione di tessuto, e anatomicamente identificare la regione di tessuto confrontandolo con una sezione di riferimento istologica adiacente.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie cardiovascolari continua ad essere la principale causa di morte e disabilità negli Stati Uniti, causando più del 30% dei decessi negli Stati Uniti nel 2011 1. Le più recenti statistiche dalla American Heart Association indicano che più di una persona su tre ha un o più tipi di malattie cardiovascolari. la ricerca cardiovascolare continua a fare passi avanti contro la comprensione di questa malattia, ma come le generazioni iniziano invecchiando è imperativo continuare questi sforzi. Il sistema renina-angiotensina (RAS) gioca un ruolo centrale nella regolazione del sistema cardiovascolare promuovendo innanzitutto aterosclerosi, infiammazione, vasocostrizione sistemica, e l'attivazione del sistema nervoso simpatico (Figura 1) 2-8.

La RAS è un sistema ormonale che si attiva quando le cellule del rene iuxtaglomerulari secernono renina nel sangue in risposta alla diminuzione della pressione arteriosa, aumento sympatstimolazione hetic, o diminuito il flusso di sodio dal macula densa. Renina metabolizza angiotensinogen (sintetizzata nel fegato) per formare angiotensina I (Ang I). Ang I è poi metabolizzato dal dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE), un ectoenzima sul lato luminale delle cellule endoteliali vascolari, principalmente nei polmoni e reni, per formare angiotensina II (Ang II), il principale effettore peptide della RAS. Ang II è in grado di attivare due sottotipi recettoriali; il recettore di tipo 1 (AT 1 R) e il recettore di tipo 2 (AT 2 R), sia che regolano il sistema cardiovascolare, mantenere l'omeostasi idro-elettrolitico e sono ormai considerati di influenzare le funzioni cognitive e malattie neurodegenerative processi 8,9. Un locale, RAS specifica del cervello è segnalato per sintetizzare in modo indipendente Ang II. Nel cervello, il angiotensinogen proteina precursore viene sintetizzato in astrociti 10 convertito Ang I da un enzima renina-like 3, eventualmente prorenin legato al recettore prorenin11, e successivamente convertito in Ang II enzima di conversione che è abbondantemente espresso sulla superficie extracellulare dei neuroni nel cervello 12. Questo intrabrain generato Ang II è l'agonista per il cervello AT 1 e AT 2 recettori che sono isolate da sangue-borne Ang II.

Mentre l'AT 1 R svolge un importante ruolo fisiologico, è meglio conosciuto per i suoi effetti patofisiologici in tutto il corpo, soprattutto a carico del sistema cardiovascolare e dei reni (Figura 2). Quando Ang II si lega al AT 1 R, provoca vasocostrizione; aumentando la resistenza al flusso sanguigno e aumentare la pressione sanguigna. Inoltre promuove la sintesi e la secrezione di aldosterone e vasopressina, che porta ad un aumento della ritenzione di sodio e acqua. Questi effetti possono anche indurre danno ischemico cerebrale e disturbi cognitivi ed è collegata al morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, e diabetes, oltre ad essere recentemente identificato incidere apprendimento e memoria 13-15. C'è un ciclo di feedback nel RAS dal fatto che 1 R sulle cellule iuxtaglomerulari nel rene inibisce la secrezione di renina. È interessante notare che la AT 2 R generalmente contro-regola l'azione di AT 1 R, causando vasodilatazione, crescita dei neuriti, la rigenerazione assonale, anti-proliferazione, e cerebroprotection tra molti altri 16-20. L'AT 2 R è stato inoltre individuato come obiettivo per l'anti-ipertensione e di recente, farmaci anti-cancro 21. Determinazione della localizzazione e densità dei recettori Ang II all'interno di vari tessuti e come essi sono influenzati da vari trattamenti e stati di malattia utilizzando quantitativa autoradiografia del recettore densitometrica aiuterà a scoprire il ruolo della RAS gioca a malattie specifiche.

Autoradiografia del recettore è stato usato per oltre 30 anni come un metodo efficace per indicare la presenza di angiotensina II recettori e gli altri componenti dei RAS nel cervello e altri tessuti del ratto, topo, cavia, cane e umana sotto una varietà di condizioni sperimentali 22-34. L'importanza di localizzare recettori Ang II nel cervello è che si può applicare neuroanatomia funzionale alle azioni di Ang II nel cervello, ad esempio, la presenza di AT 1 R nel nucleo paraventricolare dell'ipotalamo (PVN) suggerisce una funzione di Ang II nel cervello per stimolare vasopressina, ossitocina o il rilascio della corticotropina releasing hormone (CRH), o l'attivazione del sistema nervoso simpatico. Pertanto, i farmaci che bloccano l'AT 1 R potrebbero diminuire alcuni di questi effetti PVN-mediati associati sull'attività delle RAS cerebrali. Lavori in corso suggeriscono che l'uso di AT 1 antagonisti R può diminuire disturbo post-traumatico da stress (PTSD) rilascio indotta di CRH e migliorare i sintomi di PTSD (Hurt et al., Inviato per la pubblicazione). PVN, subfornicaleorgano (SFO), e l'amigdala sono noti per la regolazione dell'omeostasi, l'appetito / la sete, il sonno, la memoria, le reazioni emotive, e sono le aree di destinazione di questo studio dimostrazione. Queste regioni sono stati esaminati attraverso la raccolta di sezioni coronali di cervello su vetrini da microscopio, e il trattamento delle sezioni con inibitori specifici insieme a un radiolegante specifica per i recettori Ang II. In questo studio, tutti i materiali e reagenti insieme con i fornitori suggeriti sono elencati, iodio-125 è stato utilizzato per radiomarcato un antagonista Ang II recettore, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), che è stato poi purificato come mono 125 I -SI Ang II usando metodi HPLC come descritto in precedenza 35. L'utilizzo di questa specifica elevata radiolegante attività consente la visualizzazione di aree di bassa, moderata e alta densità recettoriale dopo esposizione delle sezioni radiomarcati alla pellicola a raggi x. Per calibrare il film con standard pasta cerebrali contenenti quantità note di iodio-125, la quantità specificadel recettore Ang II vincolante in una zona può essere quantificato. In studi sperimentali, il recettore Ang II vincolante nel cervello dei soggetti sperimentali può essere paragonata a quella nel cervello dei soggetti di controllo. Questo può indicare se le azioni di Ang II sono alterati in risposta ad una condizione genetica, anomalia fenotipica, stato di malattia o trattamento farmacologico. Questa conoscenza può essere applicata allo sviluppo di terapie per il trattamento di malattie associate con disregolazione del RAS. Tecniche alternative che identificano il recettore siti di legame, ma con ridotta risoluzione anatomica, sono test che utilizzano preparazioni di membrane di tessuto derivati ​​da omogenati di tessuti, che vengono incubate con radiolegante in un range di concentrazioni per valutare radioligand affinità di legame come la costante di dissociazione (K D vincolanti ) e massima capacità legante (B max) del tessuto di interesse.

Il protocollo qui descritto può essere suddiviso in 5 principali components: Preparazione del tessuto Sezioni per autoradiografia del recettore; Autoradiografia del recettore; Esposizione Film e sviluppo; Istologia; e densitometrica Image Analysis.

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Protocol

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Tutte le procedure sugli animali effettuati per questo studio sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della Nova Southeastern University in accordo con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8 ° edizione (The National Academies Press, Washington, DC 2011 ).

1. Preparazione sezioni di tessuto per autoradiografia del recettore

  1. Dopo il sacrificio, raccolto tessuti cerebrali freschi, e avvolgerlo in carta stagnola e posto in un -20 ° C freezer appena possibile. Per mantenere la forma corretta, posizionare il cervello in uno stampo cervello che simula l'interno del cranio, avvolgerlo in carta stagnola e posto in un - 20 ° C freezer. Dopo 30 minuti, posto tessuti in un sacchetto di immagazzinaggio congelatore sigillato e passare a un C congelatore -80 ° per la conservazione a lungo termine.
    1. Ottenere il campione di tessuto congelato fresco di interesse dal scongelamento -80 ° C freezer, e trasferimento in un criostato impostata su un minimo di -10 ° C e massimo di -18 ° C, per evitare.
    2. Posizionare il campione sul tessuto montare con un glicole e mezzo di inclusione a base di resina, solo incorporando una piccola parte del campione nel mezzo. Per il cervello, il cervello è montato verticalmente per consentire sezionamento nel piano coronale.
  2. Posizionare il supporto del tessuto sul microtomo all'interno del criostato e bloccare in posizione. Assicurarsi che il lato destro e sinistro del cervello sono nelle stesse coordinate antero-postero, e che l'asse dorso-ventrale è atlanti cerebrali perpendicolare usati comunemente.
  3. Iniziare taglio allo spessore desiderato (20 micron consigliati) e scongelare montare le sezioni su vetrini da microscopio in direzione verticale per avere una maggiore superficie di spazio nella slitta. Raccogliere sezioni su vetrini in gruppi sequenziali di cinque, cioè la prima serie di vetrini sono etichettati 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5 (Figura 3).
  4. Dopo aver riempito una serie di diapositive con le sezioni, i vetrini per asciugare all'aria per un massimo di 1 ora, quindi inserire il slides in una scatola di plastica scivolo in un sacchetto di immagazzinaggio congelatore autosigillante, e conservare a -20 ° C.

2. autoradiografia del recettore

ATTENZIONE: La radioattività. Utilizzare un abbigliamento protettivo per gestire la radioattività. Lo smaltimento è dipendeva stabilimento, e deve seguire le linee guida a decadere correttamente (tempo di dimezzamento di 60 giorni) o essere raccolti da una società certificata.

  1. Rimuovere il "-1" e "-2" diapositive di interesse dal -20 ° C freezer e montare in prese di scorrimento (Figura 5). Montare i "-1" scivoli insieme per il trattamento 'non specifica', e le "-2" scivoli per il trattamento 'totale'. Vasetti 'non specifici "conterrà 10 micron concentrazioni finali di PD123319 un AT 2 antagonisti R, e losartan un AT 1 antagonista R, in un tampone medio dosaggio (AM5) (Tabella 1), il' totale 'vasi vincolanti potranno contenere solo 10 micron PD123319 in AM5.
  2. Invertire la slittagrip per posizionare le diapositive nelle vaschette Coplin pre-incubazione pieni di 35-40 ml di AM5, e le rispettive inibitori per 30 minuti a temperatura ambiente. Inizia set successivi nella loro vasca di pre-incubazione a 4 intervalli min.
  3. Trasferire immediatamente i vetrini dalla soluzione di incubazione pre ai bollettini incubazione diapositive, contenente 10 ml di AM5, oltre a una concentrazione predeterminata di 125 I-SI-Ang II (calcolato in figura 4) con i rispettivi inibitori, per 60-90 min at room temperatura. Se non vi è sufficiente radioligand, 10 vetrini possono essere posizionati (back to back) in prese di diapositive modificati e incubate con 125 I-SI-Ang II in vaschette Coplin.
  4. Collocare i vetrini nuovamente dentro le impugnature di scorrimento (se necessario), macchia, e risciacquare delicatamente agitando per 1-2 secondi in 400 ml di acqua distillata in due contenitori separati.
  5. Trasferire i vetrini in sequenza in quattro vaschette Coplin contenenti 35-40 ml di AM5 esattamente per 1 min ciascuna (come illustrato in figura 4 </ Strong>).
  6. Dopo l'ultimo 1 min risciacquo, agitare delicatamente sezioni per 1-2 secondi in quattro cambi di acqua distillata fredda ghiaccio.
  7. Asciugarsi i vetrini con aria fresca (Attenzione: l'aria calda volatilizza il composto radioattivo) utilizzando quattro asciugacapelli impostati da diverse angolazioni per 4 min (Figura 5), fino a quando tutte le sezioni sono a secco, poi posto su un tovagliolo di carta.
  8. Montare i vetrini con i tessuti rivolta verso l'alto su un cartone per apposizione di pellicola a raggi X utilizzando nastro biadesivo.
  9. Mount almeno uno, 125 calibrazione Iodio vetrino standard su ogni cartone (Figura 6).
    Nota: Gli standard di calibrazione consistono di pasta cervello accuratamente mescolata con 125 iodio legato ad un composto contenente un anello di fenolo, compattato mediante centrifugazione in una siringa da 1 ml tubercolina, che sono criostato sezionata Allo stesso spessore delle sezioni di cervello e disgelo montato sul microscopio diapositive. In alternativa, 125 standard di calibrazione I aresina plastica sezionati a spessore 20 micron può essere ottenuta commercialmente. La resina plastica in questi standard protegge parzialmente la pellicola dal irraggiamento tale che una equivalenza tessuto ~ 40% dovrebbe essere incorporati nella calibrazione.

3. Film di esposizione e sviluppo

  1. Avanti a una camera oscura con una cinghia-back cassetta a raggi X e la pellicola autoradiografia. Aprire il cassetto e posizionare il cartone con scorre all'interno (Figura 6).
    1. Spegnere le luci e accendere la luce di sicurezza. Aprire con cautela la scatola della pellicola a raggi X, rimuovere un film, e posizionare il lato lucido pellicola up (con il bordo frastagliato nell'angolo in basso a destra) sulla parte superiore delle diapositive nella cassetta. Chiudere con cura la cassetta, e ruotare le barre di chiusura per sigillare la luce (Figura 6). Esporre le diapositive per diversi giorni a diverse settimane a -20 ° C.
  2. Nella camera oscura, aprire la cassetta e procedere con il proc pellicola in via di sviluppoess.
    1. Porre i vetrini in vassoi consecutivamente; sviluppatore per 2 min, acqua contenente 5% di acido acetico glaciale per 30 sec, e fissatore per 5 min. I film sono il collocati in un vassoio con acqua corrente per 20 minuti, poi messi in Photoflo per non più di 10 secondi e appesi.
      Nota: Il tempo di esposizione viene determinata empiricamente e può coinvolgere più film con diversi tempi di esposizione: il tempo necessario per ottenere segnali misurabili da aree a bassa vincolante, ma non è così lungo da saturare il film di aree con elevato legame. Una volta che l'esposizione accettabili si ottengono, quindi procedere alla fase successiva.

4. Istologia

  1. Preparare la macchia thionin e reagenti di colorazione (Tabella 2, Figura 7).
    1. Porre i vetrini "-3" nel rack scorrevole, e il trasferimento in ordine sequenziale iniziando con acqua deionizzata per 1 minuto, poi thionin soluzione macchia per 10 minuti seguito da tre tuffi in deionacque ized, e un lavaggio 30 sec in acqua deionizzata.
    2. Dopo l'acqua, posizionare il rack diapositiva in lavaggi etanolo come segue; 50%, 70% e 90% per 30 sec, seguito da due lavaggi etanolo al 100% per 1 min ciascuno. Infine, la cremagliera scorrevole in xilene per 3 min, quindi trasferire oltre ad una seconda soluzione xilene per 5 min.
  2. Rimuovere uno alla volta dall'ultimo bagno di xilene, e coprire il bordo superiore della slitta a base di resine in solvente organico mezzo di montaggio e posizionare 24 mm x 60 mm coprioggetto sul vetrino. Lasciare i vetrini per sufficientemente asciutto per ~ 48 ore e quindi eseguire la scansione al computer a 2.400 dpi in scala di grigi.

5. densitometrica Image Analysis

  1. Posizionare il lato lucido pellicola verso il basso, con il bordo frastagliato nell'angolo in basso a sinistra e la scansione utilizzando uno scanner proprietaria in grado di trasmettere le informazioni di densità di film senza alcuna distorsione nel computer sistema di imaging.
  2. Aprire le SYS di imaging proprietarieTEM e utilizzare le barre di calibrazione per stabilire standard di calibrazione per il futuro analisi densitometrica delle immagini sulla pellicola (figure 9 - 12).
  3. Misurare aree di interesse da entrambe stabilire un modello o empiricamente che illustra le aree di interesse. I dati sono la raccolta e separato sulla base di pellicola, sia di controllo o wild type (sezione), e della regione. Assicurati di includere densità (fmol / g), area di scansione e area di destinazione totale nelle misurazioni (Figura 9).
    1. Regolare bar area di scansione assicurando che regione di interesse è compreso tra i parametri di evidenziare (Figura 10).
    2. Esportare i dati in un foglio di calcolo (Tabella 4). Moltiplicare i tempi densità dell'area di destinazione totale, poi dividere per l'area di scansione in modo da ottenere il valore per il legame di quella zona specifica. Una volta che questo è fatto per tutti i valori misurati, substrato non specifico stabilito dal totale da rendere il p legame specificorisentirsi di. Medie possono essere eseguite anche per questi valori.

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Results

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La panoramica della via metabolica del sistema renina-angiotensina è mostrata in Figura 1 e la messa a fuoco diretto sui sottotipi recettoriali dell'angiotensina II (AT 1 R e AT 2 R) è descritto in Figura 2. Figura 3 visualizza il trasferimento di cervello coronale sezioni su vetrini da microscopio, che vengono poi attraverso una procedura di autoradiografia del recettore con una predeterminata concentrazione di

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Discussion

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Il protocollo descritto identifica la visualizzazione del 'totale' e 'non specifico' legame del radioligando in sezioni adiacenti di sezioni coronali di cervello di roditori precedentemente raccolti e conservati a -80 ° C, e può essere facilmente applicabile a virtualmente ogni tessuto che è anatomicamente risolto sottostrutture che presentano importi differenziali di recettori o siti di legame radioligando. Le procedure descritte all'interno del protocollo sono semplici e l'analisi è fondamental...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Robert Speth ha concesso in licenza gli anticorpi contro i recettori dell'angiotensina II a un venditore commerciale e riceve royalties dalla vendita di detti anticorpi. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant HL-113905

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bicchieri di plastica da 500 mlFisher02-591-30
24 mm x 60 mm Vetrini coprioggettiFisher22-050-25
Pellicola per imaging per autoradiografia 24 mm x 30 cmCarestream-Biomax MR Film891-2560
Bacitracin (da Bacillus licheniformis)SigmaB-0125
Foglio di cartone 8 x 11Pannello illustrativo a mezzaluna #201201
barattoli CoplinFisher ScientificE94
Asciugacapelli commercialiConairmodello SD6X
Provette di coltura monousoFisher14-961-26
EDTA (sale disodico, diidrato)USB Corporation15-699
EtanoloFisher16-100-210 
Sostituto del formulario per D-19 DeveloperPhotographers Formulary, Inc.01-0036
Acido acetico glacialeFisherA38 SI-212
Histoprep/OCTFisherSH75-125D
Fissatore di pellicoleKodak5160320
Foto floKodak1464502
LosartanFisher/Tocris37-985-0
MCID™ Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Peel-A-Way slitteVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
Vetrini caricati di alta qualità,vetrini per microscopio Premiere9308W
125I LigandiPerkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II George Washington UniversityRadioiodato dal Dr. Speth
Slide MailersFisher ScientificHS15986
Sodio bibasico fosfato anidro (Na2PO4)FisherRDCS0750500
Sodio Acetato (anidro)FisherBP333-500
Tionina FisherT409-25
Casette a raggi X (10 x 12)Spectronics CorporationQuattro quadrati
XileneFisherX3P-1GAL
con bordo rettificato fine

References

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