Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell&#39;angiotensina II

Andrea Linares; Leena E. Couling; Eduardo J. Carrera; Robert C. Speth

doi:10.3791/53866

Articolo metodologico

Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell'angiotensina II

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DOI:

10.3791/53866

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7 giugno 2016

Andrea Linares¹ , Leena E. Couling² , Eduardo J. Carrera³ , Robert C. Speth²

¹Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, ²Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, ³School of Medicine, University of Colorado

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per descrivere la localizzazione dei recettori dell'angiotensina II di tipo 1 nel cervello di ratto mediante autoradiografia quantitativa, densitometrica, in vitro del recettore utilizzando un analogo marcato con iodio-125 dell'angiotensina II.

Abstract

Questo protocollo descrive recettore modelli vincolanti per angiotensina II (Ang II) nel cervello di ratto utilizzando un radiolegante specifico per i recettori Ang II per eseguire recettore mappatura autoradiografica.

campioni di tessuto sono raccolti e conservati a -80 ° C. Un criostato viene utilizzato per la sezione coronale del tessuto (cervello) e scongelare-montare le sezioni su vetrini cariche. Le sezioni di tessuto di diapositive montate sono incubati in ¹²⁵ I-SI-Ang II radiomarcato recettori Ang II. Diapositive adiacenti sono separati in due gruppi: (NSP) in presenza di un recettore saturare concentrazione di non-radiomarcata Ang II, o un 'binding non specifico' AT ₁ Ang II sottotipo recettoriale (AT ₁ R) antagonista selettivo del recettore Ang II , e 'totale vincolante' senza AT ₁ R antagonista. Una concentrazione di saturazione di AT ₂ Ang II sottotipo recettoriale (AT ₂ R) antagonista (PD123319, 10 micron) è presente anche nel incubatisul buffer di limitare ¹²⁵ I-SI-Ang legame alla AT ₁ R sottotipo II. Nel corso di un 30 minuti di pre-incubazione a ~ 22 ° C, scivoli NSP sono esposti a 10 micron PD123319 e losartan, mentre 'totale vincolante' diapositive sono esposti a 10 micron PD123319. I vetrini vengono poi incubate con ¹²⁵ I-SI-Ang II in presenza di PD123319 per 'legame totale', e PD123319 e losartan per NSP nel tampone di dosaggio, seguita da diversi lavaggi '' nel buffer e acqua per eliminare il sale e non specificamente, legato radioligand. Le diapositive sono asciugati con blow-essiccatori, poi esposti a pellicola autoradiografia utilizzando una pellicola specializzato e cassetta. Il film è stato sviluppato e le immagini vengono scansionati in un computer per densitometria visiva e quantitativa utilizzando un sistema di imaging di proprietà e un foglio di calcolo. Un ulteriore insieme di diapositive sono thionin-macchiato per i confronti istologici.

Il vantaggio di utilizzare autoradiografia del recettore è la capacità di visualizzareAng II recettori in situ, all'interno di una sezione di un campione di tessuto, e anatomicamente identificare la regione di tessuto confrontandolo con una sezione di riferimento istologica adiacente.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari continua ad essere la principale causa di morte e disabilità negli Stati Uniti, causando più del 30% dei decessi negli Stati Uniti nel 2011 ^1. Le più recenti statistiche dalla American Heart Association indicano che più di una persona su tre ha un o più tipi di malattie cardiovascolari. la ricerca cardiovascolare continua a fare passi avanti contro la comprensione di questa malattia, ma come le generazioni iniziano invecchiando è imperativo continuare questi sforzi. Il sistema renina-angiotensina (RAS) gioca un ruolo centrale nella regolazione del sistema cardiovascolare promuovendo innanzitutto aterosclerosi, infiammazione, vas....