Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell'endotelio vascolare

Il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) famiglia di fattori di crescita proteina secreta e le loro cognate recettori della superficie cellulare è un gruppo importante e diversificata di ligandi solubili e recettori di membrana-embedded, rispettivamente, tale funzione in trasduzione dei segnali attraverso le membrane cellulari. Essi funzionano principalmente nelle cellule endoteliali, ma anche in cellule di origine epiteliale e quelli del ^1,2 sistema immunitario. Vie di segnalazione impegnati dai recettori ligando-attivato VEGF (VEGFRs) sono fondamentali in importanti patologie, come la degenerazione maculare senile e il cancro, e terapeutica loro rivolte sono in uso clinico frequente (per esempio, il bevacizumab anticorpo monoclonale che ha come bersaglio il VEGF-A) ^3,4.

Una delle complessità della famiglia VEGF è la diversità di ligandi solubili presenti in natura (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, proteine ​​VEGF codificate dal ORF famiglia di virus parapox e veleno di serpente VEGF, più altri inibitorioisoforme di VEGF-A) ^2.

Questi ligandi interagiscono con tre membri della famiglia dei recettori tirosin-chinasi, cioè VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Questi recettori sono variabilmente espressi su differenti tipi cellulari, ma sono spesso co-espressi sulla superficie delle cellule endoteliali che rivestono sanguigni e linfatici navi di tutte le dimensioni ^5. VEGFR-2 può legare l'mammiferi ligandi VEGF-A ^6, VEGF-C ⁷ e VEGF-D ^8,9, così come virus orf VEGF ¹⁰ e veleno di serpente VEGF ^11. VEGFR-2 svolge un ruolo importante nel guidare l'angiogenesi (la crescita di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti) nello sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, il cancro e le malattie degli occhi. In questi contesti, leganti quali VEGF-A, -C e -D legano e attivano il recettore sulla sangue vascolare cellule endoteliali ^12-15. Sulle cellule endoteliali linfatiche, VEGFR-2 svolge un ruolo nella linfangiogenesi, la formazione di nuovi vasi linfatici ^16. VEGFR-2 può anche promuovere la dilatazione e l'espansione delle grandi arterie e vasi linfatici nei tessuti sani e malattie ^17. Una comprensione completa di VEGFR-2: interazioni ligando è quindi importante per lo sviluppo di inibitori per l'uso nel trattamento di malattie angiogenesi-dipendenti ^18. Mentre la maggior parte isoforme di VEGF-A si legano a VEGFR-2, taglio proteolitico di VEGF-C e VEGF-D è necessario per rilasciare un frammento consistente del dominio VEGF-omologia che presenta alta affinità di legame al VEGFR-2 ^19,20.

Abbiamo sviluppato un saggio biologico per monitorare ligandi di VEGFR-2 che è stato progettato per aggirare la necessità di cellule primarie endoteliali, che sono tecnicamente difficili da passare, costoso per l'acquisto e la cultura (che richiede media specializzati) ²¹ e di esprimere molteplici VEGFRs e co-associato recettori ^22. Eterodimerizzazione di VEGFR-2 con altri recettori del VEGF o co-recettori può causare complessità indesiderate quando si punta a pernointerazioni y binari recettore-ligando, valutando l'attività attribuibili a uno specifico recettore, o valutare l'effetto dei reagenti inibitori. ^23. Il saggio biologico mantiene la mobilità del recettore rilevante nella membrana cellulare e permette la valutazione della capacità di un ligando di legare e cross-link regione extracellulare VEGFR-2.

Il saggio biologico si basa sulla creazione di un recettore chimerico in cui la regione extracellulare di un recettore VEGF (in questo caso VEGFR-2) è fuso al transmembrana e regioni intracellulari del recettore dell'eritropoietina (EpoR), un membro della famiglia dei recettori delle citochine ^8,24. Questa proteina di fusione viene poi espressa nella linea cellulare pro-B fattore dipendente Ba / F3, su cui stimolazione con un ligando capace di legare e reticolare il dominio extracellulare del recettore provoca l'attivazione della regione effettore citoplasmatica, capace di trasduzione un segnale di sopravvivenza via Janus chinasi (JAK) per la promozione delle cellulesopravvivenza e / o proliferazione. In contrasto, l'espressione di full-length VEGFR-2 nello stesso tipo cellulare, e stimolazione con ligando, non promuovono la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, indicando che gli effettori segnalazione prossimali del pathway VEGFR-2 non sono disponibili in questo tipo cellulare.

Abbiamo usato il test in una varietà di contesti di esplorare vincolante di nuove VEGFR-2 ligandi ^{10,19,20,24-29.} In combinazione con un saggio / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, abbiamo confrontato le relative attività di VEGF-C e fattori di crescita VEGF-D per legare e reticolazione VEGFR-2 e VEGFR-3 ^30. Il test è stato utilizzato per caratterizzare l'attività inibitoria di anticorpi neutralizzanti monoclonali di VEGFR-2 o VEGF-D, solubili VEGFR-2 trappola e peptidomimetici rivolte alla famiglia del VEGF ^31. Il dosaggio è stato utilizzato anche per mostrare la capacità di VEGF da diversi ceppi di virus orf di legare e cross-link VEGFR-2 prima della prova in cellule endoteliali primarie 25 o quando i protocolli valutare per la crescita purificante fattori ^27.

Il test che descriviamo è facile da eseguire, e la versione semi-quantitativa permette determinazioni veloci che a volte sono necessari quando il monitoraggio della produzione o purificazione di fattori di crescita, anticorpi o domini recettore solubile per altri esperimenti. La facilità d'uso del test lo rende un complemento ideale per studi ulteriori e più complete eseguite con le cellule endoteliali primarie derivate da sangue o vasi linfatici da specifici tessuti o organi.

Media Fonte di IL-3 e preparazione di WEHI-3D-condizionata

Nota: La linea cellulare di leucemia granulocitica topo WEHI-3D ​​è coltura per generare un mezzo condizionato contenente IL-3.

1. Culture WEHI-3D ​​in Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% supplemento glutamina lunga durata, 50 ug / ml di gentamicina. Inoculare 5 × 10 ⁶ celle in fase di log di una crescita in 50 ml di terreno di coltura fresco in un T175 cm pallone di coltura ³ tessuti e crescere per circa 7 giorni o fino a quando le cellule hanno passato la loro fase di log di una crescita di circa il 24 - 48 ore (evitare un'eccessiva morte cellulare nella cultura). mezzi condizionati è in grado di essere conservati per diversi anni a -20 ° C, in modo da lotti di 200 - 500 ml possono essere prodotti in una sola volta.
2. Decantare il fluido e le cellule dai fiaschi e far girare a 1000 x g per 15 minuti per rimuovere le cellule e detriti cellulari. Rimuovere la parte superiore del 90% di supernatant. Filtrare attraverso una unità di 0,22 micron filtro.
3. Aliquota WEHI-3D ​​terreno condizionato (CM) in 1 ml, 50 ml e 200 ml di volume per la conservazione a -20 ° C o -70 ° C. aliquote più piccole sono utili per la preparazione del test, i volumi intermedi per la preparazione di terreni di coltura per il passaggio di linee cellulari fattore-dipendente, e grandi volumi per la conservazione a lungo termine. IL-3 è relativamente stabile a 4 ° C di media in modo scongelato può essere conservato per un paio di settimane se usato in condizioni sterili.
4. In alternativa, utilizzare il mouse ricombinante IL-3 a livelli di 50 ng / ml diluito in terreno di coltura, dopo essere stata filtrata attraverso un'unità filtro 0,22 micron.

2. Cultura e valutazione di VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 e Controllo Ba / F3 linee cellulari

1. controllo Cultura cellule Ba / F3 in DMEM, 10% FBS, 50 mg / ml gentamicina o la penicillina / integratori streptomicina, 1% stabilizzato L-glutammina e il 10% WEHI-3D-CM. cellule Passage alle 1:15 diluizioni circa ogni tre giorni a partire da cellulein crescita in fase di log.
2. Culture cellule VEGFR2-EpoR-Ba / F3 in DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml di gentamicina, 1% stabilizzata L-glutammina e 10% WEHI-3D-CM e 1 mg / ml G418. cellule Passage alle 1:15 diluizioni di cellule in crescita in fase di log. Vedere ²⁴ per maggiori dettagli circa la costruzione e l'espressione del recettore chimerico.
3. Controllo Harvest Ba / F3 o cellule / F3 VEGFR2-EpoR-Ba da culture metà log-fase. Delicatamente pipetta per rimuovere le cellule non aderenti dal fondo del pallone. Lavare tre volte in topo tonicità tampone fosfato salino, pH 7,3 (PBS), (10 ml, centrifugare a 750 g per 5 minuti per recuperare pellet cellulare) per rimuovere terreno contenente IL-3.
4. Lavare le cellule una volta con DMEM e additivi, senza la WEHI-3D-CM o ricombinante IL-3, quindi risospendere in questo mezzo ad una concentrazione di 7,4 × 10 ⁴ cellule / ml (cioè 1.000 cellule per 13,5 ml; 10.000 cellule per 135 microlitri come determinato contando utilizzando un emocitometro) perutilizzare nelle versioni semiquantitative o quantitative rispettivamente del saggio.
5. Valutare cellule per la vitalità di Trypan Blue esclusione (ATTENZIONE). Mescolare Trypan blu in PBS (0,4%) 1: 1 con la popolazione cellulare e contare almeno 100 cellule su un emocitometro. Le cellule che occupano il colorante sono considerati morti o moribondi. È necessario vitalità delle superiore al 98% per eseguire il test.

3. Assay semi-quantitativa

1. Aggiungere cellule lavate (1.000 celle) contenute in 13,5 ml di medio IL-3-carente ai pozzetti di una micropiastra 72-bene a temperatura ambiente. Fare attenzione a miscelare la sospensione cellulare durante aliquotting per garantire sedimentazione delle cellule per gravità non lo fa concentrazione cellulare bias. Utilizzare un P20 automatizzato pipetta ben calibrato, e suggerimenti in autoclave.
2. Aggiungere campioni e controlli ai pozzetti a 10 volumi% (1,5 ml, per un volume finale di 15 ml contenenti 1.000 cellule per pozzetto) usando una pipetta P20 calibrato, preferibilmente, P2 pipetta. prendere care per garantire che i campioni siano compatibili con le condizioni di coltura per le cellule Ba / F3 in termini di pH, sale e altre sostanze potenzialmente citotossici / citostatici. Dove possibile, utilizzare un supporto compatibile o tampone (per esempio, DMEM o PBS, rispettivamente) o diluite in tale mezzo o buffer. Triturazione con la stessa punta assicurerà miscelazione.
3. Per i campioni di controllo, comprendente (i) Medium sola, non contenente IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM aggiunto al mezzo da solo al volume finale del 10%; e / o (iii) VEGF-A diluito a 100 ng / ml nel solo mezzo, non contenente IL-3.
4. Riempire i pozzetti non utilizzati della piastra pozzetto con acqua sterile, PBS o mezzo e mettere il piatto all'interno di un contenitore umidificato (con acqua imbevuto carta velina) che consente lo scambio di gas. Incubare le cellule all'interno dei contenitori in atmosfera umidificata del 10% CO _2. Questo test può essere comodamente installato in 3 ore da una sola persona, se sono disponibili campioni di prova e componenti multimediali.
5. Valutare le piastre in genere dopo 16 ore diincubazione a cui la discriminazione tempo tra campioni positivi e negativi è evidente. Vedere la Figura 3 per gli esempi di come le cellule appaiono in cultura. Analizzare le piastre utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito serie a 40 - 100 × ingrandimento.
   Nota: Wells contenenti fattori di crescita di supporto come IL-3 o VEGF-A conterrà cellule che appaiono rotondi e traslucido. Wells senza fattori di crescita di supporto o con il solo supporto saranno hanno ridotto il numero di cellule rotonde, così come le cellule morte o morenti e detriti cellulari (ad esempio, la Figura 3C). La valutazione del test a 24-48 ore dopo l'incubazione è l'optimum per la sensibilità.

4. Quantitative Bioassay

1. Aggiungere cellule lavate (10.000 cellule in 135 ml) di IL-3 con deficit medio ai pozzetti della micropiastra a 96 pozzetti di serie a temperatura ambiente. Fare attenzione a miscelare la sospensione cellulare durante aliquotting per garantire sedimentazione delle cellule per gravità non influenza cela concentrazione ll.
2. Aggiungere campioni e controlli ai pozzetti a 10 volumi% (15 microlitri) con una pipetta calibrata (P20). Fare attenzione al fine di garantire che i campioni siano compatibili con le condizioni di coltura per cellule Ba / F3 in termini di pH, sale o altre sostanze potenzialmente citotossici / citostatici. Se possibile, utilizzare un supporto compatibile o tampone (ad es., DMEM o PBS) o diluite in tale mezzo o buffer. Filtro sterilizzare piccoli volumi con un acetato di cellulosa unità filtrante provetta 0,22 micron pori.
3. Incubare la miscela di cellule, fattori di crescita e / o agenti inibitori in atmosfera umidificata del 10% CO ₂ per 48 ore. Eseguire il test all'interno di un contenitore umidificato che ha la carta velina imbevuta di acqua e consente scambi gassosi. Al termine del periodo di incubazione, valutare il dosaggio con uno dei metodi alternativi elencati di seguito, che sono indicatori surrogati del numero di cellule vitali nel pozzo.
4. Alternativa # 1: ³ H-thymidine incorporazione
   Nota: Questa quantificazione è stata progettata per il formato piastra a 96 pozzetti.
   1. Dopo incubazione delle piastre test per 48 ore a 37 ° C (da 150 microlitri per pozzetto), aggiungere ³ H-timidina in un volume di 50 ml di terreno di coltura (Ba / F3 mezzo di coltura senza IL-3 / WEHI-3D ​​CM) per pozzetto ad una concentrazione di 20 pCi / ml, dando una dose finale di 1 pCi per pozzetto.
   2. Incubare le piastre per altre 4 ore a 37 ° C prima della raccolta cellule utilizzando una mietitrice cellulare. Estrarre singoli campioni mettendo i filtri in scintillante e quantificare con un contatore a scintillazione liquida.
5. Alternativa # 2: bioluminescenza Detection of Cellular ATP
   Nota: Questo metodo utilizza un reagente monitoraggio ATP che, quando combinato con lisato cellulare può generare un segnale di bioluminescenza che riflette le cellule vitali nella popolazione.
   1. cellule Lisare per estrarre ATP e utilizzano un reagente Monitoring ATP per generare unsegnali luminescenti secondo le istruzioni del produttore. Leggere luminescenza usando un luminometro compatibili con un formato a 96 pozzetti.
6. Alternativa # 3: Riduzione enzimatica di un colorante indicatore da cellule vitali
   Nota: test basati resazurina mostrano una buona correlazione con la vitalità cellulare.
   1. Combinare cellule in coltura con il colorante a base resazurina e quantificare le analisi usando un lettore di piastre a fluorescenza in base alle istruzioni del produttore.

In questa sezione, mostriamo i risultati di un esperimento che dimostrano le caratteristiche essenziali di un saggio biologico VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (vedere Figura 1 dei principi del saggio). Altri studi pubblicati dimostrano le applicazioni più ampie del saggio per alternative VEGFR-2 ligandi, molecole VEGF mutanti e gli anticorpi monoclonali inibitori 8,10,19,24-30.

I dati presentati qui rappresentano un saggio in cui il / F3 saggio biologico VEGFR-2-EpoR-Ba viene utilizzato per quantificare l'attività dei tre ligandi umane ricombinanti (VEGF-A165, VEGF-C e VEGF-D) con specificità per VEGFR -2 in presenza di un anticorpo monoclonale inibitorio (bevacizumab) di VEGF-a 165. I dati sono stati normalizzati rispetto alla risposta a VEGF-a 165 alone (Figura 2). Come previsto, bevacizumab bloccato l'effetto di VEGF-A 165 nel saggio, maavuto alcun effetto sull'attività di VEGF-C e VEGF-D.

Nella versione semi-quantitativa del dosaggio o quando osservando il dosaggio durante il suo sviluppo, la visualizzazione del test utilizzando un microscopio invertito trifase standard possono fornire informazioni preziose sullo stato di avanzamento del dosaggio. L'analisi di un test (Figura 3) mostra la buona vitalità di VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellule biodosaggio quando incubate con terreno contenente IL-3 o ligando per VEGFR-2, ad esempio, VEGF-A. Queste cellule sono grandi e traslucido, e non vi è nessuna o minima evidenza di granularità nel citoplasma cellulare o detriti cellulari in coltura. Nel pozzo senza fattori di crescita aggiuntivi vi è già la prova di numero di cellule ridotti e poche cellule sane. Le cellule presenti hanno una significativa granularità nel loro citoplasma e detriti cellulari è una caratteristica costante della cultura. Dopo 48 ore non vi è alcun segno di cellule vitali.

Figura 1. Schema Descrivendo i principi del VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 Bioassay. (A) cellule Ba / F3 sono fattore-dipendente e richiedono un fattore di crescita esogena, come IL-3 per stimolare la crescita delle cellule / la vitalità via endogeni iL-3 recettori e il percorso di segnalazione JAK. Se EpoR è espresso in queste cellule salvataggio può avvenire anche attraverso la via JAK. L'espressione di un full-length del recettore tirosin-chinasi, come VEGFR-2 risultati in segnalazione minima come bersagli a valle di VEGFR-2 di attivazione non impegnano la via JAK. Un recettore chimerico con la regione extracellulare di VEGFR-2 fuse alle transmembrana e citoplasmatici regioni EpoR, quando trasfettati in cellule Ba / F3 e stimolate con specifici VEGFR-2 ligandi, è in grado di attivare il pathway JAK e cellule di guidala sopravvivenza e la proliferazione. (B), le cellule / F3 VEGFR-2-EpoR-Ba esprimono livelli significativi del recettore chimerico VEGFR-2-EpoR che può essere quantificata mediante citometria a flusso. Una volta lavato su IL-3 terreno contenente le cellule sono posti in una varietà di condizioni di coltura che guidano sia la sopravvivenza / proliferazione delle cellule. Cellule Ba / F3 untransfected o VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 cellule senza specifici fattori di crescita non riescono a crescere / sopravvivere. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. La valutazione di VEGFR-2 ligandi nella / F3 analisi biologico. IL-3-dipendente cellule / F3 VEGFR-2-EpoR-Ba Ba che esprimono un mouse VEGFR-2-EpoR chimera sono state seminate in mezzo senza IL-3 (ad eccezione perl'+ IL-3 sottoinsieme, come indicato) più VEGF-A umana 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (questa è una forma di VEGF-C che consiste nella regione centrale ed esclude le N e C-terminali propeptidi), o VEGF-DΔNΔC (questa è una forma di VEGF-D che comprende la regione centrale ed esclude le N e C-terminali propeptidi (VD)) a 100 neutralizzazione anticorpo monoclonale bevacizumab ng / ml e umanizzato (che lega e inibisce VEGF-a, ma non VEGF-C o VEGF-D), o controllare non-anticorpi neutralizzanti trastuzumab, come indicato in 0,75 mM. NF = medio che non contiene fattori di crescita aggiuntivi. Quarantotto ore dopo, relativo numero di cellulare dal vivo è stata quantificata mediante il rilevamento bioluminescenza di ATP cellulare. Le barre verticali rappresentano mezzi (normalizzato rispetto alla risposta al VEGF-A 165 da solo, prima barra) e l'errore standard della media di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Cellule VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 sono dipendenti da fattori di crescita esterna per la sopravvivenza. Esempi di VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 prova biologica in cui IL-3-dipendente cellule Ba / F3 esprimono un mouse VEGFR- 2-EpoR chimera sono state seminate in terreno (a) contenente 10% WEHI-3D ​​mezzo che fornisce IL-3, (B) 100 ng / a VEGF-(senza IL-3), o (C) medium ml umana 165 con condizionato no IL-3 o fattori di crescita aggiuntivi. La cultura è raffigurato 24 ore nel test mostra cellule altamente vitali in presenza di IL-3 (A) o VEGF-A 165 (B), mentre nella cultura senza (C) morte cellulare IL-3 o fattori di crescita addizionali e rossouced vitalità sono chiaramente evidenti. Bilance bar sono 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Steven A. Stacker e Marc M. Achen sono azionisti di circadiano Technologies Ltd., una società di sviluppo di terapie di mira la famiglia dei fattori di crescita VEGF.