Registrazione del mouse ultrasuoni Vocalizations per valutare Comunicazione Sociale

Sommario

Le vocalizzazioni ultrasoniche dei topi vengono utilizzate come proxy per modellare le basi genetiche dei deficit di comunicazione vocale nei modelli murini per i disturbi neuropsichiatrici. Il presente protocollo descrive tre contesti sperimentali che suscitano in modo affidabile vocalizzazioni ultrasoniche da cuccioli (durante lo sviluppo) e topi adulti (interazioni tra persone dello stesso sesso, interazioni maschio-estro).

Abstract

I topi emettono vocalizzazioni ultrasoniche in diversi contesti durante lo sviluppo e in età adulta. Questi segnali vocali sono attualmente utilizzati come proxy per modellare le basi genetiche dei deficit di comunicazione vocale. Caratterizzare il comportamento vocale di modelli murini portatori di mutazioni in geni associati a disturbi neuropsichiatrici come i disturbi dello spettro autistico aiuterà a comprendere i meccanismi che portano a deficit di comunicazione sociale. Forniamo qui protocolli per suscitare in modo affidabile vocalizzazioni ultrasoniche nei cuccioli e nei topi adulti. Questa standardizzazione aiuterà a ridurre la variabilità tra gli studi dovuta alle impostazioni sperimentali. I richiami di isolamento dei cuccioli vengono registrati durante lo sviluppo dai singoli cuccioli isolati dalla madre e dai compagni di cucciolata. In età adulta, le vocalizzazioni vengono registrate durante le interazioni tra persone dello stesso sesso (senza una componente sessuale) esponendo maschi o femmine socialmente motivati a un conspecifico dello stesso sesso sconosciuto. Forniamo anche un protocollo per registrare le vocalizzazioni di maschi adulti esposti a una femmina in estro. In questo contesto, c'è una componente sessuale nell'interazione. Questi protocolli sono stabiliti per suscitare una grande quantità di vocalizzazioni ultrasoniche nei topi di laboratorio. Tuttavia, sottolineiamo l'importante variabilità interindividuale nel comportamento vocale dei topi, che dovrebbe essere presa in considerazione registrando un numero minimo di individui (almeno 12 in ogni condizione). Queste registrazioni di vocalizzazioni ultrasoniche vengono utilizzate per valutare la frequenza dei richiami, il repertorio vocale e la struttura acustica dei richiami. I dati vengono combinati con l'analisi di registrazioni video sincrone per fornire una visione più completa della comunicazione sociale nei topi. Questi protocolli sono utilizzati per caratterizzare i deficit di comunicazione vocale nei topi privi di ProSAP1/Shank2, un gene associato ai disturbi dello spettro autistico. Altre registrazioni di vocalizzazioni ultrasoniche possono essere trovate anche sul database mouseTube, sviluppato per favorire lo scambio di tali dati.

Introduzione

I pazienti con disturbi neuropsichiatrici di solito mostrano deficit nella comunicazione sociale (ad esempio, i pazienti con disturbi dello spettro autistico, la schizofrenia, o morbo di Alzheimer) ^1. Geneticamente i topi sono sempre più spesso utilizzati per modellare le cause genetiche di questi disturbi ^2. Studiare la comunicazione sociale in questi modelli di topo è di grande interesse per la comprensione dei meccanismi delle mutazioni genetiche che portano a disfunzioni sociali atipici e per testare nuove terapie. Dal momento che i topi sono animali sociali e comunicano tra gli altri utilizzando olfattivi, tattili, segnali visivi e acustici, sono adatti modelli per valutare la comunicazione sociale.

Mouse vocalizzazioni ultrasoniche sono ora attualmente utilizzati come proxy per la modellazione delle basi genetiche di deficit di comunicazione vocale ^3,4 (ma l'esistenza di apprendimento vocale in questa specie è ancora dibattuto ^5,6, anche se la maggior parte degli studi recenti argomentie per l'assenza di apprendimento vocale ^7). Topi di laboratorio sono stati trovati per emettere vocalizzazioni ultrasoniche nelle relazioni madre-bambino, nelle interazioni socio-sessuale maschio-femmina, in dello stesso sesso interazioni sociali (rivisto in riferimento ⁸⁾ e nelle interazioni sociali giovanili-giovanile ^9. Cuccioli di topo emettono le chiamate di isolamento durante le prime due settimane di vita, quando isolati da diga e fratellini ^10. I maschi emettono vocalizzazioni ultrasoniche, quando in presenza di una femmina estro (o spunti urinari da lei) ^11,12. Maschi e femmine emettono ultrasuoni vocalizzazione quando interagisce con una conspecifico sconosciuta dello stesso sesso ^13,14. L'organizzazione e le funzioni di queste vocalizzazioni non sono del tutto chiare e necessitano di ulteriori indagini. Le attuali conoscenze sulla aspetto funzionale è limitata alla elicitazione di comportamento recupero nelle madri sentire le chiamate di isolamento cucciolo, la facilitazione della vicinanza di femmine adulte verso vocalizat maschio adultoioni ¹⁵ e l'aumento del comportamento esplorativo dei maschi adulti acustici adulti vocalizzazioni ¹⁶ femmine.

Che caratterizzano le anomalie della comunicazione vocale in modelli murini di disturbi neuropsichiatrici dovrebbe essere condotto in condizioni standardizzate per escludere importante contributo delle condizioni sperimentali. Tali caratterizzazioni, in combinazione con la valutazione delle interazioni sociali contemporanee e studi neurobiologici, in vari modelli genetici dovrebbero migliorare le nostre conoscenze sul contributo genetico per i diversi aspetti della comunicazione del mouse ad ultrasuoni. Nel corso di un lungo periodo, si dovrebbe dare ulteriore luce su alcune basi neurobiologiche di comunicazione sociale negli esseri umani. Noi attualmente puntiamo a fornire semplici protocolli di suscitare in modo affidabile vocalizzazioni ultrasoniche durante lo sviluppo e in età adulta sia per i topi maschi e femmine in laboratorio. Tali protocolli dovrebbero facilitare la standardizzazione delle registrazioni da confrontare in modo più affidabile ultrle emissioni di vocalizzazione Asonic tra i ceppi e laboratori. Essa dovrebbe inoltre facilitare la creazione di tali registrazioni in laboratori che non hanno precedenti esperienze con il mouse vocalizzazioni ultrasoniche registrazioni. Si segnala inoltre la possibilità di combinare i dati attuali vocalizzazioni ultrasoniche con i dati comportamentali dettagliati raccolti simultaneamente durante le interazioni sociali in topi adulti, di ottenere informazioni cruciali su disabilità sociale, nonché sul contesto di emissione di vocalizzazioni ultrasoniche. Tali analisi saranno gettare nuova luce sulla organizzazione e le funzioni di topo vocalizzazioni ultrasoniche. Infine, abbiamo anche pubblicizzare la possibilità di condividere le registrazioni ultrasuoni vocalizzazione con tutta la comunità scientifica sul database mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Aprire l'accesso ai dati di registrazione audio dovrebbe aumentare la conoscenza del mouse comunicazione ad ultrasuoni, consentendo agli scienziati di confrontare i propri dati con vocalizzazioni ultrasoniche registrati in altri Labolabo- (con simili o diversi ceppi / protocolli), e / o di sfidare i loro metodi di analisi con i file registrati in condizioni diverse.

Protocollo

Etica dichiarazione: Procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comité d'Ethique en Expérimentation animale (CETEA) n ° 89 presso l'Institut Pasteur di Parigi.

1. Preparazione degli animali

1. Per registrare le chiamate di isolamento cucciolo, ottenere femmine gravide dal ceppo di topi di interesse. Nota: Razza maschi e femmine eterozigoti per ottenere almeno 10 cucciolate tra wild-type, eterozigoti e cuccioli knock-out per ottenere robusti animali di controllo.
2. Ottenere due categorie di topi adulti per registrare vocalizzazioni durante le interazioni tra persone dello stesso sesso.
   1. Ottenere almeno 12 maschi o femmine 12 di ciascun genotipo come topi di prova dal ceppo di interessi (per tenere conto della variabilità inter-individuale). Nota: Questo protocollo è ben adattata, per gli adulti, ma può essere regolato per i minori, con una ridotta tempo isolamento prima dell'esperimento ^9. Questo test funziona per i maschi o femmine. Tuttavia, evitare la sperimentazione di sesso maschiles da ceppi di topi che mostrano un chiaro fenotipo aggressivo nel test di interazione sociale maschio-maschio.
   2. Per massimizzare la quantità di interazioni affiliative, isolare gli animali di prova prima degli esperimenti. Casa maschi singolarmente per 3 settimane (per ridurre le interazioni aggressive al minimo ^14,17) e femmine per 3 giorni (E. Ey, dati non pubblicati) per aumentare la loro motivazione sociale.
   3. Ottenere maschi o femmine da ceppi rappresentante del background genetico del ceppo test per usarli come nuovi arrivati ​​(per esempio, come i topi che interagiscono, vedi 3.1.3). Per esempio, se il ceppo mutante essere studiati è stato generato sul / 6J sfondo C57BL, usare / 6J C57BL come nuovi venuti. Calcolare il numero di animali necessari in modo che ciascuno di questi topi non viene utilizzato più di 2 volte al giorno come nuovo arrivato. loro casa a gruppi.
3. Ottenere due categorie di topi adulti per registrare vocalizzazioni maschili in presenza di una femmina estro.
   1. Ottenere a lest 12 maschi sessualmente maturi da ciascun genotipo del ceppo di interesse (per tener conto della variabilità inter-individuale). Nota: se i maschi non hanno mai avuto esperienza con le femmine prima, metterli in gabbie individuali e lasciarle trascorrere una notte con una femmina di due giorni prima della prova per aumentare la loro motivazione a emettere vocalizzazioni ultrasoniche ^6.
   2. Ottenere femmine sessualmente maturi dallo sfondo ceppo dei maschi registrati. Per esempio, se i maschi mutanti oggetto di studio sono state generate sulla / 6J sfondo C57BL, usare C57BL / 6J femmine. Calcolare il numero di femmine necessari in modo che ciascuno di questi topi non viene utilizzato più di 3 volte al giorno. loro casa a gruppi.

2. chiede di isolamento Pup

1. pup di identificazione
   1. Tre giorni prima del giorno previsto di nascita, isolare le femmine gravide.
   2. Controllare le femmine per la nascita di ogni mattina e ogni sera. Si noti il ​​giorno della nascita come P0.
   3. Identificare i cuccioli in P1 con lunga durata tatuaggi zampa (iniezione sottocutanea di tatuaggio verde incollare con un 0,3 mm x 13 mm [30 G ½ "] ago). Creare un codice con uno, due, tre o quattro zampe segnati. Siate il più velocemente possibile, disturbare minimamente i cuccioli, e rimesso nel nido appena possibile.
2. Impostare la gabbia per registrare le chiamate Pup di isolamento.
   1. Utilizzare una camera di self-made insonorizzata (Figura 1A) o una semplice scatola di polistirolo. Inserire un termometro all'interno della scatola per monitorare la temperatura per ogni registrazione. Assicurarsi che la temperatura resti compresa tra 18 ° C e 22 ° C.
   2. Collocare un microfono in alto (attraverso un foro nella parte superiore della scatola). Regolare l'altezza del microfono in modo che la membrana del microfono è 12-15 cm sopra il fondo della scatola in cui il cucciolo giacerà. Collegare il microfono alla scheda audio, e la scheda audio al computer.
   3. Per regolare il guadagno del sound carta, condurre uno studio di registrazione con un cucciolo che non verrà utilizzato nell'esperimento. Mettere il cucciolo nelle stesse condizioni come nell'esperimento (vedi 2.3.1). Chiudi la porta. Regolare il guadagno sulla scheda audio, in modo che sia il valore massimo (per avere la massima ampiezza per le vocalizzazioni) ma senza sovraccaricare (controlla sul display spettrogramma vivo sul software di registrazione).
      Nota: Alcune chiamate potrebbero essere sovraccaricati se l'ampiezza della maggioranza delle chiamate viene mantenuta al livello più alto possibile.
   4. Registrare il livello di guadagno per ogni sessione di registrazione e non cambiarlo tra cuccioli / cucciolate / sessioni. Le variazioni nei livelli di guadagno porterebbe al rilevamento chiamata imprecise e variabili acustiche misure con le stesse soglie di analisi utilizzando il rilevamento e la misurazione (vedi 5.1 a 5.4) automatica.

(A) Esempio di una camera a prova di suono self-made per registrare le chiamate di isolamento cucciolo.. (B) Spettrogrammi dei diversi tipi di chiamata usati nella presente classificazione tipo di chiamata; vedere la descrizione nella tabella 1. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Condurre la registrazione di isolamento cucciolo chiama ogni due giorni. Effettuare registrazioni di mattina per cuccioli nati nella notte, e nel pomeriggio per cuccioli nati durante il giorno per evitare di categorizzazione negli stessi cuccioli classe di età con una mezza giornata di differenza di età. Ciò è più evidente per i più piccoli stadi P2 e P4.
   1. Prendere un cucciolo nella lettiera. Posizionare il più rapidamente e delicatamente possibile in un recipiente di plastica lavato con etanolo 10% ed essiccato (diametro: 9centimetro; Altezza: 10 cm per evitare che i cuccioli più grandi di fuggire dalla zona di copertura del microfono). Mettere il destinatario appena sotto il microfono.
   2. Chiudere la finestra più rapidamente e silenziosamente possibile. Avviare la registrazione di cuccioli vocalizzazioni ultrasoniche nel software di registrazione (formato a 16 bit, 300 kHz frequenza di campionamento per catturare l'ampiezza del suono fino a 150 kHz con una qualità elevata).
   3. Dopo il tempo richiesto di registrazione è trascorso (fino a 5 min), interrompere la registrazione. Prendere il cucciolo fuori dalla scatola. Annotare i tatuaggi zampa del cucciolo.
   4. Prendere la temperatura ascellare del cucciolo con una sonda-termometro. Mark il cucciolo sul dorso con un piccolo punto con una penna odore-less (acqua inchiostro), per riconoscere più facilmente i cuccioli già registrate nel nido quando il prossimo viene scelto e per evitare la manipolazione di tutti i cuccioli ogni volta che un nuovo è scelto. Mettere il cucciolo di nuovo nel nido.
   5. Lavare il destinatario plastica e la plastica che copre il fondo con 10% etanolo e asciugare beneprima di mettere il prossimo cucciolo all'interno.
   6. Scegliere il prossimo cuccioli nella lettiera e ripetere 2.3.
4. Controllare il peso corporeo, la coordinazione motoria, geotassi negativi, e segni di sviluppo (per i dettagli della ridotta batteria di test si prega di consultare le sezioni dei metodi di Schmeisser et al. ¹⁸ e in Ey et al. ¹⁹⁾ dopo un periodo di riposo di 1 ora per consentire i cuccioli di recuperare dopo l'emissione faticosa di vocalizzazioni ultrasoniche. Utilizzare un altro coorte di animali, se è condotta la completa batteria di test di sviluppo, come in Chadman et al. ²⁰ e Scattoni et al. ^21.
5. Ripetere queste registrazioni ogni due giorni tra P2 e P12 per caratterizzare il comportamento vocale cucciolo e lo sviluppo in tutta le prime due settimane di vita.

3. ultrasuoni Vocalizations durante lo stesso sesso interazioni sociali

1. vocalizzazione Recordings
   1. Preparare una gabbia di prova (50 x 25 cm x 30 cm ^3; Plexiglas, 100 lux [a bassa intensità di luce bianca]) puliti con acqua e sapone, secchi e pieni di 2 cm di biancheria fresca nella camera insonorizzata.
      1. Posizionare il microfono in modo che le vocalizzazioni emesse da tutti gli angoli della gabbia possono essere registrate. Fissare il microfono in un angolo della gabbia di prova (o sulla gabbia o un cavalletto) e regolare l'angolazione del microfono gabbia inferiore a coprire tutta la superficie della gabbia.
         Nota: Gli ultrasuoni sono molto direzionale.
      2. Inserire un telecamera sulla sommità della camera insonorizzata per catturare tutta la superficie della gabbia di prova.
         Nota: Controllare che il microfono non si nasconde un angolo della gabbia di prova sul video.
      3. Prima della prova, regolare il guadagno della scheda audio con un maschio di ricambio e una femmina riserva che non saranno utilizzati nell'esperimento tardi. Mettere questi animali nella gabbia di prova nella camera di registrazione. Regolare il livello di guadagno sulla scheda audio per massimizzare l'ampiezza delle vocalizzazioni registrate but minimizzare sovraccarico come visto nella visualizzazione spettrogramma diretta sul software di registrazione.
         Nota: Il guadagno dipende dalla distanza tra il microfono e gli animali vocalizzi.
   2. Introdurre l'animale da testare (maschio o femmina, che verrà chiamato "dell'occupante") nella gabbia prova su lettiere fresche. Lascia abituano alla gabbia di prova nella camera insonorizzata per 20 minuti per massimizzare il suo interesse per il conspecifico sconosciuta introdotta nel 3.1.3.
   3. Trascorso questo tempo assuefazione, introdurre l'animale 2 ^° per l'interazione (maschile o femminile, dello stesso sesso come l'occupante, ma marchi auricolari differenti / zampa tatuaggio di individuare in un secondo momento, sarà chiamato il "nuovo arrivato").
      1. Avviare la registrazione le vocalizzazioni ultrasoniche (formato a 16 bit, frequenza di campionamento 300 kHz per catturare l'ampiezza del suono fino a 150 kHz con una qualità elevata) e il video per catturare l'introduzione del nuovo venuto nella gabbia di prova. Avviare la registrazione del uvocalizzazioni ltrasonic durante assuefazione (occupante solo) se è necessario un confronto tra il livello di base delle emissioni di vocalizzazione durante l'esplorazione della gabbia e l'interazione sociale.
      2. Sincronizzare manualmente / visivamente le registrazioni audio e video premendo sull'orologio tempo ( "bip" suono vicino al microfono) esattamente quando le zampe posteriori del mouse nuovo arrivato toccare il suolo.
      3. Lasciare i due animali interagiscono per il tempo desiderato (per esempio 4 min, una durata sufficiente a raccogliere abbastanza vocalizzazioni ultrasoniche).
   4. Mettere l'occupante e il nuovo venuto di nuovo nei loro rispettivi gabbie casa. Svuotare la biancheria usata dalla gabbia di prova, lavarlo con acqua e sapone e asciugare con carta assorbente. Mettere biancheria fresca e rimetterlo nella camera insonorizzata per il prossimo test.

4. Vocalizations maschio durante l'interazione con un estro femminile

1. La mattina presto la giornata di prove dellamaschi, prendono striscio vaginale da ogni femmina di determinare il loro status sessuale all'interno del ciclo di estro.
   1. Tenere la femmina per la coda e mantenere la sua sulla griglia gabbia. Utilizzare una pipetta per sciacquare più volte vagina con 20 ml di PBS (cioè, iniettare e ricordare gli stessi 20 microlitri di PBS più volte). Ricordare il 20 microlitri di PBS con la stessa punta della pipetta. Usa PBS sterile, per evitare qualsiasi infezione se le femmine sono di essere testato per diversi giorni consecutivi.
   2. Distribuire il PBS contenente la sospensione di cellule vaginali su un vetrino. Mettere quattro campioni su un vetrino (identificare gli individui a lato della slitta con una matita). Lasciate che le diapositive asciugare prima di effettuare la colorazione.
   3. Lavorare sotto il cofano di laboratorio fumi.
      1. Preparare un bagno di puro maggio-Grünwald, un bagno di soluzione tampone fosfato (0,1 M) e un bagno di Giemsa R (1/20 in soluzione tampone fosfato).
      2. Mettere le diapositive nel bagno di puro maggio-Grünwald per 3 minuti, poisciacquare nel bagno di soluzione tampone fosfato per 1 min e infine trasferirli per 10 minuti in bagno di Giemsa R (1/20 in tampone fosfato).
      3. Dopo di che, lavare i vetrini di nuovo nel bagno di soluzione tampone fosfato per 10 sec e lasciate asciugare.
   4. Esaminare i vetrini colorati sotto il microscopio. Le femmine che possono essere utilizzati nel corso della giornata sono quelli la cui campioni presenti solo grandi cellule epiteliali cornified (senza nucleo, macchiato di blu, pieno estro).
2. Mettere i maschi nella camera di prova, almeno 30 minuti prima di testarli.
3. vocalizzazione Recordings
   1. Ripetere 3.1 se necessario.
   2. Introdurre il maschio da testare (su biancheria fresca). Lascia lo abituano alla gabbia di prova nella camera insonorizzata per 10 min.
   3. Trascorso questo tempo assuefazione, introdurre una femmina in estro (tra quelli selezionati dalla colorazione).
      1. Avviare la registrazione dei vocalizzazioni ultrasoniche e il videoper catturare l'introduzione della femmina nella gabbia di prova. Avviare la registrazione dei vocalizzazioni ultrasoniche durante assuefazione (maschio solo) se è necessario un confronto tra il livello di base delle emissioni di vocalizzazione durante l'esplorazione della gabbia e l'interazione sociale.
      2. Sincronizzare manualmente / visivamente le registrazioni audio e video premendo sull'orologio tempo ( "bip" suono vicino al microfono) esattamente quando le zampe posteriori del topo femmina toccano il suolo.
      3. Lasciare i due animali interagiscono per il tempo desiderato (per esempio 4 min, una durata sufficiente a raccogliere abbastanza vocalizzazioni ultrasoniche).
   4. Mettere il maschio e la femmina posteriore nelle rispettive gabbie a casa. Svuotare la biancheria usata dalla gabbia di prova, lavarlo con acqua e sapone e asciugare con carta assorbente. Mettere biancheria fresca e rimetterlo nella camera insonorizzata per il prossimo test.
      Nota: E 'ottimale per utilizzare ogni femmina estro una sola volta al giorno (ma, se necessario, si puòessere usato fino a 3 volte nello stesso giorno, ma non in una fila).

5. Le variabili da estrarre

1. Preparare i file audio per le analisi. Nota: La procedura che segue è specifico per un visoft SASLab Pro e può cambiare a seconda del software utilizzato.
   1. Tagliare i file in modo che iniziano esattamente al "bip" dell'orologio tempo, e alla fine, dopo la durata desiderata (5 min per le registrazioni dei cuccioli, 4 min per le registrazioni per adulti).
   2. Filtrare l'ampiezza under 30 kHz utilizzando un filtro passa-alto (Modifica> Filtro> Filtro FIR nel dominio del tempo, passa alto con frequenza di 30 kHz tagliato). Utilizzare l'elaborazione batch per filtrare tutti i file di interesse (Azioni> Elaborazione batch> filtro FIR).
   3. Identificare ogni ultrasuoni vocalizzazione da loro etichettatura con il software.
      1. Utilizzare il rilevamento automatico per le registrazioni Pup (Strumenti> Etichette> Crea etichette di sezione da eventi di forma d'onda). Regolare la soglia, il tempo di attesa e il margine fo il rilevamento più accurato. controllare manualmente il rilevamento e regolare le etichette, se necessario (consigliato).
      2. Utilizzare rilevazione visiva (inserimento manuale delle etichette) per le registrazioni adulti con rumore di fondo (selezionare le vocalizzazioni, cliccare a destra e inserire l'etichetta sezione dal marcatore).
   4. Creare lo spettrogramma. Attivare misure automatiche di parametri (Strumenti> misure di parametri automatici> misure di parametri automatici di set up).
   5. Controllare la "Enable misurazioni automatiche", i "parametri Calcola da tutta spettrogramma", e le scatole "aggiornamento automatico". Selezionare "separazione Element": in modo interattivo (etichette di sezione).
   6. Caselle di controllo per calcolare i parametri desiderati temporali (durata di elemento, intervallo, Start / ora di fine) e dei parametri dello spettro a base di (frequenza di picco), e la posizione delle misure (Start di elemento, End of elemento, medi, Max, Min) .
   7. Copiare le misure e incollare ilm in un foglio di calcolo.
      Nota: Per le registrazioni effettuate con gli adulti, le misurazioni dei parametri di spettro a base potrebbe essere impossibile a causa del rumore di fondo. Utilizzare misurazioni manuali di frequenza di picco cliccando sui diversi valori di frequenza direttamente sul spettrogramma e incollare manualmente i valori in una tabella.
2. Determinare call rate, vale a dire, il numero di chiamate al minuto dal primo determinare il numero di vocalizzazioni emesse (numero totale di etichette). Poi, calcolare il tasso di chiamata dividendo il numero totale di vocalizzazioni registrate per la durata (in minuti) del file.
3. Determinare organizzazione temporale, vale a dire, la distribuzione di intervalli di tempo tra le chiamate per determinare l'organizzazione sequenza.
   1. Calcolare gli intervalli di tempo tra la fine della vocalizzazione n e l'inizio della vocalizzazione n + 1 con l'ora di inizio / fine di ciascuna etichetta.
   2. Stabilire la densità di distribuzione degli intervalli di tempo tra ultrasonvocalizzazioni IC.
4. Determinare chiamata repertorio, vale a dire, definire i tipi di chiamata presenti nella registrazione. Utilizzare l'esempio della classificazione presentata nella Tabella 1 e Figura 1B.
   1. Quando si etichettano ogni vocalizzazione in 5.1.3, scrivere il nome del tipo di chiamata in etichetta.
   2. Calcolare il numero esatto e la percentuale di ogni tipo di chiamata per costruire il repertorio vocale.
5. Determinare caratteristiche acustiche per ogni vocalizzazione, cioè, durata, frequenza di picco (cioè, la frequenza con la massima ampiezza) all'inizio e alla fine della chiamata, le frequenze massima e minima di picco, e significa frequenze se misura automatica è possibile (Figura 1B) .
   1. Utilizzare la funzione automatica di misure di parametri nel software per misurare la durata automaticamente, caratteristiche di frequenza di picco (ad esempio, inizio, fine, media, massimo, minimo) nelle registrazioni cucciolo.
   Utilizzare la durata dell'etichetta come la durata della vocalizzazione per le registrazioni adulti. Misurare manualmente sulla finestra spettrogramma le caratteristiche di frequenza di picco (ad esempio, inizio, fine, massimo, minimo).

Coppia dati ultrasuoni vocalizzazione e dati di interazione sociale (MiceProfiler plug dalla piattaforma ICY ^22).

1. Assicurati di sincronizzare il più precisamente possibile il le registrazioni video, come descritto nel protocollo audio e.
2. Codificare il video della interazione sociale con il Mice Profiler Tracker plug-in della piattaforma ICY come descritto in de Chaumont et al. ^22. Avviare il monitoraggio esattamente quando le zampe posteriori dell'animale introdotto toccano il suolo.
3. Carica il file video codificato e il suo corrispondente file xml (generata dai topi Profiler tracker) nei topi Profiler video Label Maker plug-in della piattaforma ICY come descritto in de Chaumont etal. ^22.
   Nota: Il Mice Profiler video Label Maker plug collegherà automaticamente il file video e il file di testo generato dall'analisi del file audio se hanno lo stesso nome (vedi: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker) .
4. Dopo aver verificato che la scala del mouse è corretto, cliccare su "Crea USV statistiche" per ogni file per ottenere il numero e la percentuale di vocalizzazioni emesse nel corso di ogni evento sociale in un file separato.

6. Caricare i file sul database mouseTube

1. Assicurarsi che i file si trovano su un server di archiviazione a cui si accede dall'esterno dell'istituzione.
   Nota: i server ospitati in alcuni istituti con alti livelli di sicurezza avranno bisogno di una configurazione specifica per essere accessibili da persone che si collegano al di fuori dell'istituzione.
2. Vai al sito mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Esegui il login (login unND password sono attribuiti ad ogni utente dagli amministratori).
3. Controllare se il ceppo di topi registrata già esiste nel database mouseTube facendo clic sul pulsante "Ceppi". In caso contrario, chiedere agli amministratori di creare esso.
4. Creare soggetti che utilizzano i "Soggetti> Crea" pulsante. Inserire i codici di identificazione degli animali registrati. li riuniscono in gruppi per facilitare il recupero dei dati in seguito.
5. Inserire la descrizione del protocollo utilizzato per registrare vocalizzazioni ultrasoniche utilizzando i "Protocolli> Crea" pulsante.
6. Creare un esperimento per ogni sessione di registrazione utilizzando i "Esperimenti> Crea" pulsante. Specificare il protocollo, il gruppo di individui che è stato registrato, l'hardware e il software utilizzati e le loro specificità.
   Nota: L'esperimento raccoglie tutti i metadati corrispondenti ai file di vocalizzazione.
7. Creare il collegamento ai file di vocalizzazione utilizzando le "vocalizzazioni> Crea & #34; pulsante. Selezionare l'esperimento all'interno della lista. Copia e incolla l'URL del file di vocalizzazione (questo link inizia con http: // ...) nel campo corrispondente del "File per collegare" colonna. Convalida le voci facendo clic sul pulsante "Crea un collegamento tra mouseTube ei file".
   Nota: Non è necessario riempire ogni casella per ogni file contemporaneamente.
8. Se necessario, modificare i link inseriti in ogni momento, e aggiungere i dettagli nella sezione "Note". Non esitate a scrivere le note di dare ulteriori dettagli. Per esempio, se è stato inserito un link verso un file video che è stato registrato in contemporanea con il file audio, questo può essere specificato nelle "Note".

Risultati

Con gli attuali protocolli, abbiamo caratterizzato il comportamento vocale dei topi privi ProSAP1 / Shank2, un gene associato con disturbi dello spettro autistico (ASD) ^23-25. ASD sono caratterizzati da deficit nella comunicazione sociale e dei comportamenti stereotipati ^1. I nostri Shank2 ^{- / -} mice visualizzati iperattività, una maggiore ansia e la comunicazione vocale atipico ^18,26. Infatti, abbiamo notato che Shank2 ^{- / -} mice visualizzato un profilo di sviluppo atipico del loro tasso di emissione di chiamate di isolamento cucciolo in confronto con il tipico rovesciata curva a forma di U nei loro fratelli di tipo selvatico Shank2 ^{-. / -} Mice visualizzato un tasso di chiamata aumento a P4 e diminuito tasso di chiamata a P6 rispetto ai loro fratelli di tipo selvatico (Figura 2). Abbiamo anche osservato un tasso di chiamata è diminuito nelle interazioni femminili che coinvolge un Shank2 ^{- / -} femminile in CONFRONTOn con interazioni che coinvolgono una wild-type littermate (Figura 2). Abbiamo esaminato il repertorio delle 5 diverse categorie di chiamata. Sembrava essere differente fra cuccioli (per esempio qui P2, P6 e P10) e adulti (Figura 3). differenze genotipo-correlati sono stati significativi per lo più in età adulta. Durante le interazioni sociali che coinvolgono adulti Shank2 ^{- / -} maschi o femmine con una femmina C57BL / 6N, chiamate più brevi e le chiamate non strutturati sono stati registrati in confronto con le interazioni che coinvolgono i loro fratelli di tipo selvatico (Figura 3D ed E). Chiamate e la frequenza meno complessi salti chiamate sono state registrate anche durante le interazioni con a / 6N femminile C57BL coinvolge Shank2 adulto ^{- / -} femmine in confronto con interazioni che coinvolgono Shank2 ^{+ / +} femmine (Figura 3E). Infine, abbiamo anche misurato variabili acustiche manualmente. Non c'era alcun significativo genotipo legati differenza dusviluppo anello. Al contrario, la durata delle chiamate registrate durante le interazioni che coinvolgono Shank2 adulto ^{- / -} femmine erano più brevi rispetto a quelli registrati durante le interazioni che coinvolgono i loro fratelli di tipo selvatico (figura 4a). Abbiamo inoltre evidenziato che la frequenza di picco di vocalizzazioni ultrasoniche è aumentata durante lo sviluppo dei cuccioli senza significative differenze genotipo-correlate ^26. Durante interazioni che coinvolgono Shank2 ^{- / -} maschi o femmine con una femmina C57BL / 6N, vocalizzazioni ultrasoniche avevano una frequenza di picco più bassa in confronto con le chiamate registrate durante le interazioni che coinvolgono i loro fratelli di tipo selvatico (Figura 4B).

Inoltre, la presente protocollo anche permesso di studiare il contesto di emissione di vocalizzazioni ultrasoniche combinando i dati di registrazioni audio ai dati comportamentali estratti da MiceProfiler (software ICY, Institut passatoeur, Parigi). Per esempio, nelle interazioni femmina-femmina, la maggior parte delle vocalizzazioni ultrasoniche sono stati emessi quando gli animali erano in contatto e più precisamente l'occupante annusando regione anogenitale del nuovo venuto, o almeno l'occupante essere dietro il nuovo venuto. I topi anche emesso molte vocalizzazioni ultrasoniche quando l'occupante è avvicinato il nuovo venuto (Figura 5, pannello superiore). Meno vocalizzazioni sono stati registrati quando l'occupante Shank2 ^{- / -} mice erano in contatto fisico con il nuovo venuto (ad esempio, annusando la regione ano-genitale del nuovo venuto) rispetto a quando l'occupante era una wild-type del mouse. Meno vocalizzazioni sono stati attivati ​​quando l'occupante dietro il nuovo arrivato è stato un Shank2 ^{- / -} topo rispetto a quando era una wild-type del mouse. Più vocalizzazioni stati registrati anche quando il nuovo venuto era nel campo visivo del mouse occupante, e più nei wild-tipi che nei mutanti (figura 5, pannello inferiore).

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Figura 2:. Portata di emissione di vocalizzazioni ultrasoniche durante lo sviluppo e nel maschio adulto e Shank2 femmina ^{- / -} mice e wild-type cucciolata chiamata tasso di cuccioli (ogni due giorni da P2 a P12, n = 18-19 Shank2 ^{+ / +,} n = 15-16 Shank2 ^{- / -)} e adulti durante maschio-estro interazioni femminile (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -)} e le interazioni femmina-femmina (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^{- / -)} in topi wild-type (pannello di sinistra) e Shank2 ^{- / -} mice (pannello di destra). I dati sono presentati come media +/- SEM e singoli punti (non accoppiati Wilcoxon test: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).ge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Repertorio vocale di Shank2 ^{- / -} mice e wild-type cucciolata proporzioni dei cinque diversi tipi di chiamate emesse da cuccioli P2 (A; n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} cuccioli P6 (B; n = 19 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} cuccioli P10 (C; n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} i maschi adulti con una femmina estro (D ; n = 16 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -)} e adulti femmine con un'altra femmina (e; n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 - / -) in topi wild-type (pannelli a sinistra) e Shank2 ^{- / -} mice (pannelli a destra). I dati sono presentati come media +/- SEM e singoli punti (test chi-quadrato: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Variabili acustiche estratti dalle vocalizzazioni ultrasoniche in Shank2 ^{- / -} mice e wild-type cucciolata (A) Durata di tutti i tipi di chiamata confusi emessa da cuccioli P2 (n = 20 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -} ), cuccioli P6 (n = 19 Shank2 ^{+ / +,} n = 18 Shank2 ^{- / -),} cuccioli P10 (n = 20 Shank2 ^{+ / +} Shank2 ^{- / -),} i maschi adulti con una femmina estro (n = 16 Shank2 ^{+ / +,} n = 16 Shank2 ^{- / -)} e adulti femmine con un'altra femmina (n = 15 Shank2 ^{+ / +,} n = 13 Shank2 ^{- / -)} in topi wild-type (pannello di sinistra) e Shank2 ^{- / -} mice (pannello di destra). (B) frequenza di picco massima misurata su tutti i tipi di chiamata confuso in cuccioli P2, cuccioli, cuccioli P6 P10, i maschi adulti con una femmina estro e femmina adulta con un'altra femmina (stessi Ns come sopra). I dati sono presentati come media +/- SEM e singoli punti (non accoppiati Wilcoxon test: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Contesto. s di emissione di topo vocalizzazioni ultrasoniche in adulti femmina-femmina sociale interazioni Percentuale di vocalizzazioni ultrasoniche emesse da coppie che coinvolgono un Shank2 ^{+ / +} con un / mouse 6N C57BL (n = 16, A) e le coppie che coinvolgono un Shank2 ^{- / -} con un / mouse 6N C57BL (n = 13, B) durante i seguenti tipi di eventi comportamentali (rosso: occupanti, verde: nuovo venuto): contatti sociali, oro-orale contatto, ano-genitale sniffing dal mouse occupante, ano- genitale sniffing dal mouse nuovo arrivato, occupante dietro nuovo arrivato, nuovo arrivato alle spalle degli occupanti, l'immobilità dell'occupante, immobilità del nuovo venuto, l'approccio dall'occupante e uscire dal nuovo arrivato, l'approccio dal nuovo arrivato & fuggire dalla occupante, approccio e fuggire dal occupante, approccio e fuggire dal nuovo arrivato, occupante a seguito del nuovo arrivato, nuovo arrivato nel campo visivo dell'occupante, degli occupanti nel campo visivo del nuovo arrivato. I dati sono prisentito come media +/- SEM e singoli punti (test non accoppiato Wilcoxon: * p <0.05, ** p <0.01). Dati non pubblicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

tipi di chiamata	Descrizione
breve	la durata e la frequenza ≤5 msec gamma ≤6.25 kHz
semplice	durata> 5 msec e frequenza gamma ≤6.25 kHz (flat) o modulazione di frequenza in una sola direzione (verso l'alto o verso il basso) con frequenza gamma> 6,25 kHz
complesso	modulazioni di frequenza in più di una direzione e gamma di frequenza> 6,25 kHz (modulato), o inclusione di uno o più ulteriori frequenza component (fenomeni armonici o non lineari, ma senza saturazione) ma nessun vincolo sulla gamma di frequenza (complessa)
salti di frequenza	inserimento di un salto (un salto di frequenza) o più salti di frequenza (salti, altri) in frequenza senza intervallo di tempo tra le componenti di frequenza consecutivi, con (misto) o senza alcuna parte rumorosa all'interno della chiamata tono puro
non strutturati	Nessun componente tono identificabile puro; chiamate "rumorosi"

Tabella 1:. Caratteristiche dei cinque tipi di topo vocalizzazioni ultrasoniche Esempi di criteri di durata, gamma di frequenza, modulazioni di frequenza e salti di frequenza utilizzate per determinare 5 diversi tipi di chiamate all'interno del mouse vocalizzazioni ultrasoniche.

Discussione

Il protocollo qui presentato fornisce metodi standardizzati e affidabili per raccogliere topo vocalizzazioni ultrasoniche in laboratorio. Queste situazioni molto vincolati presentano il vantaggio di normalizzazione. Essi sono utilizzati con successo per confrontare ceppi o genotipi all'interno ceppi ^18,19,26,27. Come illustrato nei risultati rappresentativi, questi metodi consentono l'individuazione di comunicazione sociale atipico nei topi mutati per Shank2, un gene associato con disturbi dello spettro autistico. I confronti tra ceppi di topi, tra contesti diversi o anche tra laboratori saranno attivati ​​dalla disponibilità di set di dati più grandi sul database mouseTube. Questo strumento dovrebbe incrementare gli studi su topi vocalizzazioni ultrasoniche, consentendo analisi multivariata.

I protocolli descritti qui sono ottimizzati per testare topi di differenti genotipi all'interno di un ceppo, come avviene nella maggior parte degli studi modellazione del c geneticaontributo di disturbi neuropsichiatrici. Si consiglia di progettare sperimentalmente ogni studio per avere i migliori controlli possibili. Infatti, gli effetti del disordine potrebbero mascherare o gonfiare artificialmente effetti genetici ^28,29. È quindi opportuno includere controlli littermate per ogni genotipo. Allevamento eterozigoti genitori devono pertanto essere favorite, in quanto consentirà il corretto abbinamento dei topi mutanti e di controllo all'interno di una cucciolata. Ciò giustifica la marcatura di tutti i cuccioli tatuaggio zampa (cieco al genotipo) per monitorare gli individui in tutte le registrazioni ogni due giorni. La genotipizzazione è fatto allo svezzamento, per il prelievo di campioni di coda. Durante la registrazione di chiamate di isolamento cucciolo da P2 in poi, non consigliamo il prelievo di campioni di coda già nei cuccioli, dal momento che questa operazione include la manipolazione e lo stress supplementare molto vicino nel tempo per una sessione di registrazione.

I protocolli proposti qui per suscitare vocalizzazioni ultrasoniche negli adulti non consente una chiara identificazione del emitter delle vocalizzazioni. Questo spiega il motivo per cui manipoliamo la motivazione del test animali. Infatti, i topi di prova sono isolati e non il nuovo venuto e le cavie abituare per lungo tempo alla gabbia di prova durante le interazioni omosessuali. In interazioni maschio-femmina, la femmina introdotto non è isolato e il maschio di prova abitua per il tempo più breve dal momento che la motivazione potrebbe essere più elevato in questo contesto sessuale. Queste manipolazioni di motivazione devono massimizzare la probabilità del mouse di prova emettono le vocalizzazioni e non quello introdotto. Per registrare vocalizzazioni ultrasoniche maschile in un contesto sessuale, un semplice tampone di cotone con fresco (cioè, non congelato) nelle urine di una femmina estro può anche essere introdotto nella gabbia ^30. Questo metodo consente l'assegnazione di vocalizzazioni ultrasoniche per il maschio prova con certezza al 100% ma impedisce la raccolta di tutte le informazioni specifiche sul contesto sociale attuale di emissioni di queste vocalizzazioni. Pertanto, privilegiamo la protocol qui descritto (con una femmina di estro liberamente in movimento). Si consiglia anche utilizzare sempre topi introdotto dallo stesso ceppo durante il test i topi da un ceppo mutante e di analizzare i dati come una coppia di topi vocalizzi. Uno studio recente promuove l'uso della triangolazione per localizzare l'emettitore ^31. In questo studio, le femmine sono stati trovati per emettere anche vocalizzazioni ultrasoniche durante incontri con un maschio. Ciò può essere spiegato dal fatto che sono stati isolati per almeno due settimane prima della sessione di registrazione. La generalizzazione dell'uso di triangolazione proposta in questo studio dovrebbe anche permettere l'identificazione dell'emettitore delle vocalizzazioni nella maggior parte dei casi, se registrazioni video siano correttamente sincronizzati.

Le chiamate di isolamento da cuccioli registrati durante lo sviluppo non sono disturbati dal rumore di fondo della biancheria da letto. Solitamente l'analisi automatica funziona molto bene per estrarre le variabili principali. Al contrario, le vocalizzazioni registrate dagli adulti sono disturbed dal rumore di fondo dagli animali si muovono nella lettiera. analisi automatica potrebbe non riuscire, e, pertanto, l'analisi manuale deve essere usato. Tuttavia, l'aggiunta di biancheria da letto nella gabbia prova deve fornire le condizioni che sono meno stressante per gli animali di suolo nudo (che i topi non piace). Ulteriori sforzi della comunità sono concentrati sul miglioramento del rilevamento automatico delle vocalizzazioni ultrasoniche in varie condizioni, anche quelle che implicano rumori di fondo. Ad esempio, il software Voice consente di analizzare vocalizzazioni che erano stati selezionati manualmente per l'assenza di rumore di fondo ^32. In questo software, l'estrazione delle variabili acustiche è automatico ma necessita della selezione manuale iniziale.

Va notato che la variabilità inter-individuale è molto importante nel comportamento vocale dei topi. Per esempio, il tasso di chiamata di maschi adulti in presenza di una femmina estro è molto distribuito (Figura 1). noi suggest questi protocolli standardizzati per suscitare vocalizzazioni ultrasoniche già a limitare la variabilità correlata al contesto sperimentale. Tuttavia, vorremmo sottolineare l'importanza di presentare non solo la media e SEM per i dati, ma soprattutto i singoli punti in campioni di piccole dimensioni ^33. E 'anche molto importante - se non necessario - per registrare almeno 12 individui di ogni gruppo / genotipo per raccogliere dati rappresentativi. In molti casi, la variabilità inter-individuale non deve essere nascosta (di solito non può essere), e potrebbe essere di grande importanza per identificare gli individui portatori della mutazione genetica studiata, ma non espongono alcun fenotipo atipico. Tali individui potrebbero fornire indizi su compensazioni, che potrebbero aprire nuovi percorsi per le terapie di malattie genetiche.

Nella maggior parte delle caratterizzazioni del comportamento di modelli murini per i disturbi neuropsichiatrici, comportamento vocale e contatti sociali sono considerareEd a parte (ad esempio, ^{19,27,34,35).} Metodi di analisi recenti ora fornire una caratterizzazione dettagliata semi-automatica degli eventi sociali e sequenze di eventi durante un'interazione (utilizzando MiceProfiler per esempio) ^36, nonché la possibilità di abbinare questa analisi con i dati di registrazioni audio. Il principale vantaggio di questo metodo è quello di fornire una visione completa della comunicazione sociale in modelli murini di ASD, per individuare con maggiore precisione quali aspetti della comunicazione sociale sono interessati. Nel protocollo di sincronizzazione è ancora manuale, ma questo può essere migliorato attivando la registrazione video tramite il software di registrazione audio. Questo tipo di analisi dovrebbe diventare lo standard per fornire una visione più completa dei deficit di comunicazione sociale, in modelli murini di disturbi neuropsichiatrici. Inoltre, fino ad oggi, i segnali vocali sono principalmente analizzati dal lato emettitore (cioè, i test sono costruiti per favorire l'emissione di vosegnali cal dal mouse testato, come nel presente protocolli). L'attenzione dovrebbe essere impostato sul ricevitore di questi segnali, per identificare meglio le funzioni di questi segnali acustici. Questo dovrebbe essere fatto valutando anche il comportamento dei topi nuovo venuto negli attuali protocolli adulti (utilizzando MiceProfiler per esempio) ^36, utilizzando esperimenti di riproduzione ^16, o la creazione di nuovi protocolli. Infatti, gli attuali protocolli prevedono situazioni molto vincolati che potrebbero non riflettere esattamente le condizioni etologiche di emissione di vocalizzazione nei topi. L'emissione spontanea di vocalizzazioni ultrasoniche dovrà essere meglio caratterizzati mediante registrazioni audio e video continui a far luce sul comportamento vocale spontanea dei topi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
aghi 0,3 mm x 13 mm [30  G 1/2"]	BD Microlance	304000-pasta
per tatuaggi verde	Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada	329AA-termometro
	Fisherbrand, Waltham, USA	4126 (W255NA)	-
camera insonorizzata autocostruita (cuccioli)	Institut Pasteur,	Parigi-schiuma	acustica + plexiglas; dimensioni interne (L x A x P): 32 cm x 33 cm x 32 cm
termister di piccola superficie + termocoppia a sonda singola	Harvard Apparatus	599814 + penna	601956-inodore
	per esempio: Giotto-ink		fatto con acqua, lavabile: queste penne sono progettate per i bambini
Etanolo assoluto (100%)	Sigma Aldrich,  Saint-Quentin Fallavier, Francia	24103	diluito 1/10
Microfono a ultrasuoni a condensatore Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA	Avisoft Bioacoustics, Berlino, Germania#	40011	fornito con cavi di prolunga dalla società Avisoft
Ultrasound Gate 416H	Avisoft Bioacoustics, Berlino, Germania	#34163	scheda audio
Avisoft Recorder USGH	Avisoft Bioacoustics, Berlino, Germania	#10301; #10302	software di registrazione per Windows Vista, 7 e 8
Avisoft SASLab Pro	Avisoft Bioacoustics, Berlino, Germania#	10101, 10111; #10102, 10112;	Windows 10, 8.1, 8, 7 o Vista, incluso Apple Macintosh basato su Intel con Boot Camp, Parallels o software di virtualizzazione simili.
Laptop o Apple Macintosh con Boot Camp	:		Windows 10, 8.1, 8, 7 o Vista; per Apple Macintosh, Boot Camp è preferito ai software di virtualizzazione come Parallels a causa dei limiti di memoria
del destinatario in plastica (registrazioni PUP)	Lock, Chatswood, Stati Uniti	HPL932D	Lock & Serratura Contenitore Ermetico Impilabile Rotondo 700  Ml; utilizzare senza coperchio; Dimensioni: 9  cm di diametro, 10 cm di altezza
PBS 1x (pH = 7,4)	Gibco (Life Technologies)	10010-023-vetrini
	Menzel-Glä ser, Thermo Scientific	J1800AMNZ	Superfrost Plus
May-Grü nwald soluzione 500 ml	RAL Ré actifs, Martillac, Francia	320070-0500-Giemsa
R 500 ml	RAL Ré actifs, Martillac, Francia	720-1107	diluito 1/20 in soluzione tampone fosfato
soluzione tampone fosfato (autoprodotto)	-	-	pH = 7, 0,1 M: 39 ml NaH2PO4 0,2 M + 61 ml Na2HPO4 0,2 M + 100  ml H2O (volume finale: 200  ml)
gabbia per test	Institut Pasteur,	Parigi-50	x  25  cm, 30  altezza cm; Camera
insonorizzata autocostruita in plexiglas (registrazioni per adulti)	Institut Pasteur,	Parigi-schiuma	acustica + PVC; dimensioni interne (L x A x P): 66 cm x 90 cm x 46 cm
videocamera	da Noldus Information Technologies, Wageningen, Paesi Bassi-videocamera		CamTech Super-Hi-Res ad alta risoluzione; 25 fps
EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, Paesi Bassi	http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt	il software di acquisizione video
Mice Profiler Tracker plugin della piattaforma	ICY Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris	http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker	il software di tracciamento per analizzare gli eventi comportamentali durante le interazioni sociali