Misura di fluttuazioni calcio all'interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Sommario

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Abstract

Il mantenimento dei livelli di calcio (Ca²⁺) allo stato stazionario nel reticolo sarcoplasmatico (SR) delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) è vitale per la loro salute generale. Una parte significativa del contenuto intracellulare di Ca²⁺ si trova all'interno dei depositi SR nelle VSMC. Essendo l'unico organello intracellulare con una stretta associazione con lo spazio extracellulare circostante attraverso le giunzioni membrana plasmatica-SR, si può considerare che la SR costituisca la prima linea di risposta a qualsiasi irregolarità nei transitori di Ca²⁺ o stress sperimentato dalla cellula. Tra le sue numerose funzioni, una delle più importanti è il suo ruolo nella trasmissione di segnali regolati dal Ca²⁺ in tutta la cellula per indurre ulteriori reazioni a valle a livello cellulare. L'uso più comune di indicatori citoplasmatici di Ca²⁺ a questo proposito è nel complesso insufficiente per la ricerca sui cambiamenti altamente dinamici della riserva intraluminale di Ca²⁺ SR che devono ancora essere completamente caratterizzati. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la misurazione diretta e chiara di SR luminale Ca²⁺. Questo strumento è utile per indagare sui cambiamenti sfumati in SR Ca²⁺ che hanno effetti successivi significativi sulla normale funzione e sulla salute della cellula. Le fluttuazioni del contenuto di SR Ca²⁺ in particolare possono fornirci una quantità significativa di informazioni relative alle risposte cellulari alla malattia o alle condizioni di stress vissute dalla cellula. In questo metodo, una versione modificata di un indicatore di Ca²⁺ mirato a SR, D1SR, viene utilizzata per rilevare le fluttuazioni di Ca²⁺ in risposta all'introduzione di agenti in cellule muscolari lisce (SMC) dell'aorta di ratto in coltura. Dopo l'incubazione con l'indicatore D1SR, la microscopia a fluorescenza confocale e l'imaging basato sul trasferimento di energia per risonanza a fluorescenza (FRET) vengono utilizzate per osservare direttamente le variazioni dei livelli intraluminali di SR Ca²⁺ in condizioni di controllo e con l'aggiunta di agenti agonisti che funzionano per indurre il movimento intracellulare del Ca²⁺.

Introduzione

Ca ²⁺ è uno ione molto importante si trova in abbondanza all'interno di ogni singola cellula del corpo. Ha ruoli significativi in molte funzioni cellulari diverse, tra cui la crescita, la proliferazione, la migrazione e l'apoptosi ^1-4. E 'ben noto che la Ca ²⁺ può influenzare questi processi attraverso azioni dirette e indirette, e di conseguenza, le modifiche ai normali concentrazioni intracellulari di questo ione può facilmente portare a risultati negativi per le cellule colpite. Il SR è considerato come il più grande intracellulare Ca ²⁺ negozio all'interno della cella ^5. I livelli di stato sta....

Protocollo

dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti e le procedure sono state condotte in accordo con le linee guida Laboratory Biosafety della University of British Columbia, Vancouver, Canada.

1. Preparazione di 35 mm con fondo di vetro piatti della cultura per FRET-based Microscopia confocale

1. Preparare piatti utilizzando la hr seguente procedura 36-48 prima di esperimenti.
2. Recupera miscela proteica gelatinosa scelto e lo 0,25% tripsina-EDTA da -20 ° C di stoccaggio e tenerli in bagno di ghiaccio mobili fino al momento dell'uso.
   NOTA: La miscela di proteine ​​di rivestimento deve essere esposto al RT per un breve periodo di tempo per ....

Risultati

Questa sezione fornisce esempi dei risultati che si possono ottenere con il metodo descritto per acquisire dati di concentrazione SR luminali di Ca ^2+, rispetto al modo comunemente impiegato per misurare indirettamente modifiche organelli concentrazioni negozio Ca ²⁺ osservando fluttuazioni citoplasmatica di Ca ²⁺ .

La figura 1A mostra un'istantanea di una regione di intere.......

Discussione

Questo protocollo descrive la transfezione di VSMCs con l'adenovirus D1SR per studiare Ca ²⁺ concentrazioni all'interno del lume del SR. Questo metodo consente la misura diretta di Ca ²⁺ all'interno di questo organello nonché il suo movimento in / out della SR in conseguenza dell'applicazione di diversi agenti calcio-movimento. Questo metodo ha molti vantaggi per gli investigatori che lavorano per una comprensione completa di come i cambiamenti a SR e citoplasmatici di Ca ²⁺

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (alto glucosio, piruvato)	Life technologies	11995-065	Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Conservare a -20 ° C fino a poco prima dell'uso
Siero per vitelli neonati	Sigma-Aldrich		Conservare a -20 gradi C fino a destra prima dell'uso
Piastre con fondo in vetro da 35 mm	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μ Pallone con tappo di tenuta blu ventilato M	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Mantenere a -20 ° C fino a poco prima dell'uso
50 ml Tubo conico in polipropilene	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Regalo
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Tenere a -20 ° C fino a subito prima dell'uso
Provette per microcentrifuga nere da 1,5 ml	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 Microscopio confocale	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (con applicazione FRET SE Wizard)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.