Targeting biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Sommario

La maggior parte delle infezioni batteriche produce un biofilm. In virtù del loro ambiente, i batteri associati al biofilm sono spesso fenotipicamente resistenti ai farmaci. Le nuove molecole antibatteriche che uccidono i batteri nei biofilm sono quindi una priorità assoluta. Stabiliamo un test per lo screening rapido di composti antimicrobici efficaci nell'eradicazione dei biofilm.

Abstract

La maggior parte dei batteri patogeni è in grado di formare biofilm durante l'infezione, ma a causa della difficoltà di manipolare e valutare i biofilm, la stragrande maggioranza del lavoro di laboratorio viene condotto con cellule planctoniche. Qui, descriviamo un saggio di biofilm su piastra a pioli eseguito con Staphylococcus aureus. I biofilm batterici vengono coltivati su pioli attaccati a un coperchio per piastra per microtitolazione a 96 pozzetti, lavati attraverso una delicata immersione in tampone e posti in una piastra di provocazione farmacologica. Dopo la successiva incubazione, vengono nuovamente lavati e spostati in una piastra di recupero finale, in cui il colorante fluorescente resazurina funge da indicatore di vitalità. Questo test offre una maggiore facilità d'uso, affidabilità e riproducibilità, nonché una grande quantità di dati se condotto come lettura cinetica. Inoltre, questo test può essere adattato a un approccio di screening farmacologico a medio rendimento mediante il quale viene invece eseguita una lettura fluorescente dell'endpoint, offrendo un percorso per gli sforzi di scoperta farmacologica.

Introduzione

Microbi patogeni possono formare biofilm in vivo che portano a infezioni croniche non acute ^1. Infezione biofilm-associata è un grave fattore di rischio di procedure mediche che coinvolgono l'impianto di corpi estranei (ad esempio, la sostituzione di ossa artificiali, le protesi mammarie) o l'installazione di tubi tracheali o cateteri urinari ^2. In questi contesti, terapia anti-infettiva è quasi sempre necessario come infezioni biofilm-based sono raramente cancellati da soli, anche in individui immunocompetenti. Staphylococcus aureus è uno dei patogeni più frequentemente osservati implicati nella complicazioni biofilm correlati che si verificano durante l'uso di dispositivi medici invasivi ^3.

Purtroppo, la natura stessa del biofilm da barriera protettiva rende più resistenti al trattamento delle cellule planctoniche ^1,4, e la valutazione della efficacia clinica predetto è una parte critica sia inizialelo sviluppo di farmaci così come la sorveglianza della resistenza ai farmaci. Vi è un crescente riconoscimento che condizioni di laboratorio, si è concentrata sulle culture planctonici, potrebbero non rappresentare fedelmente la malattia del mondo reale ^5. Ulteriori aggravando il problema, la replica di fenotipi biofilm è difficile, e modelli biofilm esistenti sono noioso e soffrono di alta inter- e intra-assay variabilità ^6. Così, molti ricercatori, per necessità, di default per saggi cellulari planctonici di sensibilità ai farmaci, quindi potenzialmente trascurare un aspetto importante della virulenza batterica e la malattia.

Qui si descrive il protocollo per il saggio di batteri, in particolare S. aureus, in biofilm pre-grown utilizzando una base di ^7,8 sistema di biofilm ben 96. Mentre il protocollo per la formazione di biofilm e la sfida segue essenzialmente la raccomandazione del costruttore, presentiamo una metodologia ricca di informazioni alternative per quantificare la fattibilità del BIOFilm dopo sfida. Brevemente, i batteri sono coltivate in piastra piolo, dove biofilm formano sui pioli sporgenti collegati al coperchio della piastra. Dopo la formazione di biofilm, i pioli sono delicatamente immersi in pozzetti di una piastra fresca ripiena con PBS per rimuovere le cellule planctoniche. Il peg-coperchio, con biofilm allegate, viene trasferito in una nuova piastra sfida, contenente varie concentrazioni di antibiotici da dosare. Dopo una seconda incubazione, coperchi sono nuovamente rimosso, lavato, e trasferiti ad una piastra di recupero contenente resazurina tintura, dove subiscono una incubazione finale. conversione resazurina può essere registrata cineticamente o preso come una lettura finale dopo un periodo di recupero definito. Questo metodo di tintura a base di quantificare la vitalità del biofilm si differenzia notevolmente dalle noiose CFU (unità formanti colonie) metodologia basata su conteggio descritto nel protocollo originale ^7. OD ₆₀₀ misurazioni della piastra sfida droga e resazurina cinetiche di conversione fungono redditività letturaout di cellule planctonici e biofilm, rispettivamente, offrendo un test veloce, affidabile e tecnicamente semplice ricco di informazioni per la sopravvivenza biofilm.

Protocollo

1. biofilm Initiation

1. Crescere una cultura di biofilm producono organismo in un mezzo ricco di nutrienti. Seminare Staphylococcus aureus ceppo Newman in 10 ml di terreno Mueller-Hinton da uno stock di glicerolo. Eseguire tutti i lavori che coinvolgono la gestione di S. aureus con i guanti e all'interno di un armadio biosicurezza.
2. Incubare per 16 ore a 37 ° C su shaker rotativo (100-200 rpm).
3. Determinare OD ₆₀₀ della coltura utilizzando uno spettrofotometro ed una cuvetta standard (lunghezza del percorso: 1cm).
4. Calcolare il volume (V) della cultura necessari per preparare 20 ml di inoculo con OD _{600 (inoculo)} di 0,1 in chelexed mezzi Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) ⁹ utilizzando la formula: [V = 20 ml * 0,1 / OD _{600 (cultura )]}
   Nota: Riferimento 9 fornisce dettagli sulla preparazione CRPMI.
   1. Aggiungere il volume coltura calcolata (dall'alto) in una provetta da centrifuga e cellule pellet mediante centrifugazione per 1 min a 10.000 x g. per prepare biofilm inoculo, aspirare il mezzo di crescita e risospendere pellet cellulare trascorso in 20 ml CRPMI.
5. Versare inoculo in un serbatoio 25 ml.
6. Rimuovere con cautela il coperchio da una piastra sterile piolo 96 pozzetti tirandola verso l'alto.
   Nota: Fare attenzione a non contaminare i pioli che pendono dal coperchio. Il coperchio può essere posizionato a testa in giù su una superficie pulita all'interno di un armadio biosicurezza.
7. Usando una pipetta microlitri 200 multicanale, aggiungere 125 microlitri inoculo in ciascun pozzetto di righe da A a G della piastra inferiore.
8. Riempire media 125 ml sterile CRPMI in ciascun pozzetto di fila H come controllo di sterilità.
9. Prendere la peg-coperchio e tenerlo sopra il fondo piatto con i pioli rivolti verso il basso. Allineare con cura i singoli pioli con relativi pozzetti. Evitare il contatto fisico tra la piastra e le spine. Una volta allineati, abbassare il coperchio con cautela verso il basso. Evitare disallineamenti come aggiustamenti eseguiti dopo i picchetti hanno toccato la piastra inferiore può contcontrolli di sterilità aminate in fila H.
10. Sigillare il coperchio alla piastra con la pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e mettere in un sacchetto di plastica richiudibile, tenuta saldamente. Mantenere il volume dell'aria nel sacchetto più basso possibile per minimizzare l'evaporazione.
11. Incubare senza agitazione a 37 ° C per 48 ore in un incubatore CO ₂ 5%.
    Nota: 48 ore di crescita è stato ottimale per S. aureus, ma varierà basato sul organismo utilizzato.
    Nota: Anche se l'incubazione statico è un buon punto di partenza per ottimizzare il dosaggio, scuotendo leggermente a 150 giri al minuto, un vortex è una delle variazioni che possono migliorare la formazione di biofilm di alcuni S. aureus isolati.

2. Preparazione della piastra biofilm sfida

1. Il giorno della sfida biofilm prendere una piastra a 96 pozzetti fresco e aggiungere 100 ml di CRPMI, equilibrati a RT, a ciascun pozzetto di righe B a H. Per evitare risultati inconsistenti, utilizzare una piastra a 96 pozzetti che può contenere 200 mldei media quando i pioli sono all'interno, e dispone pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra biofilm iniziazione.
2. Diluire fino a 4 composti di prova separatamente in 1,0 ml di CRPMI a 2x la concentrazione finale desiderata, al fine di spiegare una diluizione finale nel passo 2.7.
   Nota: un buon punto di partenza è di 8 volte superiori alla concentrazione inibitoria delle cellule planctoniche.
3. Aggiungere 200 ml di composto 1 a Wells A1 a A3, composto di 2 pozzi in A4 A6, composto di 3 pozzi in A7 a A9 e composto 4 in pozzi A10 a A12.
4. In serie diluire i composti di prova utilizzando una pipetta multicanale e trasferire 100 ul dalla fila A alla fila B e mescolare.
5. In questo modo, continuare a trasferire 100 ul pozzetto a pozzetto. Mescolare dopo ogni trasferimento e sosta in fila F.
6. Dopo la miscelazione, espellere i 100 ml di fila F in un contenitore per rifiuti. Non trasferire alcun liquido alle righe G e H.
7. Aggiungere 100 ml di CRPMI a ciascun pozzetto della piastra con una pipetta multicanale perportare il volume a 200 ml. Vedere la Figura 1 per il layout piatto finale.

3. biofilm Sfida

1. Aggiungere 200 ml di tampone fosfato salino (PBS) ad un nuovo sterile 96 pozzetti che dispone pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra biofilm iniziazione.
2. Rimuovere il sacchetto di plastica e pellicole di paraffina dalla piastra biofilm iniziazione incubate.
3. Sollevare il coperchio verso l'alto. Evitare il contatto tra i picchetti e il fondo piatto come questo può danneggiare il biofilm. Tenere la parte inferiore per la successiva analisi OD ₆₀₀ (vedi 3.8).
4. Risciacquare cellule planctoniche posizionando il peg-coperchio sulla piastra contenente PBS (dal punto 3.1). Immergere pioli per 5 secondi, sollevare dalla PBS, e immergere ancora una volta, facendo attenzione a non colpire i picchetti contro i lati pure.
5. Mettere il coperchio peg-risciacquato nella piastra sfida. Evitare il contatto inutili tra i picchetti e piastra di fondo per non danneggiare il biofilm che porta arisultati inconsistenti.
6. piastra di tenuta con la pellicola di paraffina e riporre in un sacchetto di plastica richiudibile come descritto al punto 1.10.
7. Incubare la piastra senza agitazione per 24 ore a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
8. Prendere parte inferiore della piastra di biofilm iniziazione da 3.3. Risospendere i batteri in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e misurare il diametro esterno ₆₀₀ con un lettore di micropiastre adatto per confermare la crescita che si verificano in tutti i pozzetti, ma i controlli di sterilità in fila H.

4. Determinazione biofilm

1. Utilizzare un lettore di piastre dotato di una camera di incubazione e in grado di prendere letture di fluorescenza cinetici per la rilevazione resazurina conversione. Impostare una misurazione della fluorescenza cinetica 24 ore utilizzando una eccitazione 530 nm e 590 nm di emissione.
2. Impostare la temperatura della camera a 37 ° C e ha la piastra letto ogni 20 min. Impostare il lettore di piastre per misurare dal fondo della piastra base alle istruzioni del produttorezioni.
3. Preparare Lavare la piastra con l'aggiunta di 200 ml di PBS con una pipetta multicanale ad una sterile 96 pozzetti.
4. Preparare mezzo di recupero biofilm con l'aggiunta di 400 ml di 0,8 mg / ml resazurina soluzione madre a 20 ml di terreno CRPMI ad una concentrazione finale di 16 mg / ml resazurina.
   Nota: resazurina è irritante per la pelle conosciuta. Uso di un camice, occhiali anti-schizzo, e guanti durante la manipolazione. CRPMI come supporti di ripristino biofilm è stato usato perché fornisce il segnale di fondo più basso, ma può essere sostituito da mezzi di Mueller Hinton, se del caso.
5. Aggiungere 150 pl di mezzo di recupero biofilm con una pipetta multicanale a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fresco.
6. Trasferimento piatto sfida da incubatrice in un armadio biosicurezza e con attenzione rimuovere il sacchetto di plastica e la pellicola sigillante.
7. Togliere il peg-coperchio dalla piastra sfida e risciacquare le cellule planctoniche in PBS come descritto in 3.4. Mantenere il fondo della piastra sfida per successiva OD ₆₀₀ analisi (vedi 4.10).
8. Dopo il risciacquo, inserire il piolo-coperchio nella piastra inferiore contenente il mezzo di recupero biofilm.
9. Avvolgere il lato della piastra con la pellicola di paraffina, facendo attenzione a non ostacolare il fondo dei pozzetti perimetrali. Subito dopo aver terminato la piastra, collocarlo sul lettore di piastre e iniziare una lettura cinetica in un periodo di 24 ore, avviando il già fatto resazurina protocollo cinetica dal punto 4.1.
10. Per quantificare la crescita di cellule planctoniche che possono o non possono verificarsi durante sfida, leggere la OD ₆₀₀ dell'intera piastra inferiore sfida utilizzando un lettore di micropiastre. Seguire le istruzioni riportate al punto 3.8.
    Nota: risospendere accuratamente il contenuto di ogni pozzetto come cellule spargimento fuori dal biofilm tendono a crescere in ciuffi sul fondo del pozzo. Eventuali bolle all'interno del pozzo saranno fortemente interferire con OD ₆₀₀ letture e devono essere evitati o rimossi prima della lettura.

Risultati

Il saggio resazurina è abbastanza sensibile per rilevare in modo affidabile pochissime cellule vitali in grado di replicare in terreno privo di droga dopo la sfida. In questa metodologia, definiamo la concentrazione di biofilm sradicare minima come la concentrazione più bassa alla quale nessuna conversione resazurina è visto entro 24 ore. Il test si basa su resazurina molecole ossidanti presenti nelle cellule metabolicamente attivi che convertono il colore della tintura dal blu al rosa. ...

Discussione

Qui, abbiamo descritto un saggio biofilm modificato per determinare l'attività di inibitori testati su S. biofilm aureus concentrandosi sullo stato metabolico delle cellule biofilm associato. Mentre il biofilm iniziazione descritto e procedure di contestazione per lo più imitate raccomandazioni del produttore, l'uso di resazurina colorante per rilevare e quantificare le cellule biofilm associato che sopravvivono una sfida inibitore 24 ore semplifica notevolmente la procedura raccomandata di rec...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Segui le raccomandazioni del produttore
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medio chelexato per 1 ora con resina Chelex 100 e poi integrato con 10% non chelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resina	Bio Rad	142-2822
Piastre MBEC	Innovotech	19111
Resazurin Sale di sodio	Sigma	R7017	800 &; g/ml in acqua deionizzata
Piattaforma di agitazione per micropiastre sterile con filtro	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Registrazione e analisi della conversione della resazurina
Neocuproine	Sigma	N1501	preparare 10 mM di stock in etanolo al 100%, conservare a -80 º C
Solfato di rame	Acros Organics	7758-99-8	preparare una soluzione madre da 100 mM in acqua, conservare a 4 º C
Cu-Neocuproina	Autoprodotto		Generato mescolando molarità uguali di neocuproina e solfato di rame. La miscela è stata diluita in mezzo CRPMI alla concentrazione desiderata.
Gentamicina	Sigma	G3632-1G