La maggior parte delle infezioni batteriche produce un biofilm. In virtù del loro ambiente, i batteri associati al biofilm sono spesso fenotipicamente resistenti ai farmaci. Le nuove molecole antibatteriche che uccidono i batteri nei biofilm sono quindi una priorità assoluta. Stabiliamo un test per lo screening rapido di composti antimicrobici efficaci nell'eradicazione dei biofilm.
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Articolo metodologico
Targeting biofilm Associated
In questo articolo
Sommario
Abstract
La maggior parte dei batteri patogeni è in grado di formare biofilm durante l'infezione, ma a causa della difficoltà di manipolare e valutare i biofilm, la stragrande maggioranza del lavoro di laboratorio viene condotto con cellule planctoniche. Qui, descriviamo un saggio di biofilm su piastra a pioli eseguito con Staphylococcus aureus. I biofilm batterici vengono coltivati su pioli attaccati a un coperchio per piastra per microtitolazione a 96 pozzetti, lavati attraverso una delicata immersione in tampone e posti in una piastra di provocazione farmacologica. Dopo la successiva incubazione, vengono nuovamente lavati e spostati in una piastra di recupero finale, in cui il colorante fluorescente resazurina funge da indicatore di vitalità. Questo test offre una maggiore facilità d'uso, affidabilità e riproducibilità, nonché una grande quantità di dati se condotto come lettura cinetica. Inoltre, questo test può essere adattato a un approccio di screening farmacologico a medio rendimento mediante il quale viene invece eseguita una lettura fluorescente dell'endpoint, offrendo un percorso per gli sforzi di scoperta farmacologica.
Introduzione
Microbi patogeni possono formare biofilm in vivo che portano a infezioni croniche non acute 1. Infezione biofilm-associata è un grave fattore di rischio di procedure mediche che coinvolgono l'impianto di corpi estranei (ad esempio, la sostituzione di ossa artificiali, le protesi mammarie) o l'installazione di tubi tracheali o cateteri urinari 2. In questi contesti, terapia anti-infettiva è quasi sempre necessario come infezioni biofilm-based sono raramente cancellati da soli, anche in individui immunocompetenti. Staphylococcus aureus è uno dei patogeni più frequentemente osservati implicati nella complicazioni ....
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Protocollo
1. biofilm Initiation
- Crescere una cultura di biofilm producono organismo in un mezzo ricco di nutrienti. Seminare Staphylococcus aureus ceppo Newman in 10 ml di terreno Mueller-Hinton da uno stock di glicerolo. Eseguire tutti i lavori che coinvolgono la gestione di S. aureus con i guanti e all'interno di un armadio biosicurezza.
- Incubare per 16 ore a 37 ° C su shaker rotativo (100-200 rpm).
- Determinare OD 600 della coltura utilizzando uno spettrofotometro ed una cuvetta standard (lunghezza del percorso: 1cm).
- Calcolare il volume (V) della cultura necessari per preparare 20 ml di inoculo con OD....
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Risultati
Il saggio resazurina è abbastanza sensibile per rilevare in modo affidabile pochissime cellule vitali in grado di replicare in terreno privo di droga dopo la sfida. In questa metodologia, definiamo la concentrazione di biofilm sradicare minima come la concentrazione più bassa alla quale nessuna conversione resazurina è visto entro 24 ore. Il test si basa su resazurina molecole ossidanti presenti nelle cellule metabolicamente attivi che convertono il colore della tintura dal blu al rosa. .......
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Discussione
Qui, abbiamo descritto un saggio biofilm modificato per determinare l'attività di inibitori testati su S. biofilm aureus concentrandosi sullo stato metabolico delle cellule biofilm associato. Mentre il biofilm iniziazione descritto e procedure di contestazione per lo più imitate raccomandazioni del produttore, l'uso di resazurina colorante per rilevare e quantificare le cellule biofilm associato che sopravvivono una sfida inibitore 24 ore semplifica notevolmente la procedura raccomandata di rec.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Saran Kupul per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione NIH R01-AI104952 a FW. Un ulteriore supporto è stato fornito dal Center for AIDS Research (CFAR) dell'Università dell'Alabama a Birmingham (UAB), un programma finanziato dal NIH (P30 AI027767) che è stato reso possibile dai seguenti istituti NIH: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Segui le raccomandazioni del produttore |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medio chelexato per 1 ora con resina Chelex 100 e poi integrato con 10% non chelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resina | Bio Rad | 142-2822 | |
| Piastre MBEC | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sale di sodio | Sigma | R7017 | 800 &; g/ml in acqua deionizzata |
| Piattaforma di agitazione per micropiastre sterile con filtro | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Registrazione e analisi della conversione della resazurina | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | preparare 10 mM di stock in etanolo al 100%, conservare a -80 º C |
| Solfato di rame | Acros Organics | 7758-99-8 | preparare una soluzione madre da 100 mM in acqua, conservare a 4 º C |
| Cu-Neocuproina | Autoprodotto | Generato mescolando molarità uguali di neocuproina e solfato di rame. La miscela è stata diluita in mezzo CRPMI alla concentrazione desiderata. | |
| Gentamicina | Sigma | G3632-1G |
Riferimenti
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al.
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Ristampe e permessi
