Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sclerosi multipla si presume essere una malattia autoimmune infiammatoria, che è caratterizzato dalla formazione di lesione al sistema nervoso centrale (CNS) con conseguente deterioramento cognitivo e motorio. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di SM utile, perché è anche caratterizzata dalla formazione della lesione del sistema nervoso centrale, disabilità motoria ed è guidato anche da reazioni autoimmunitarie e infiammatorie. Uno dei modelli EAE viene indotta con un peptide derivato dalla proteina mielina oligodendrociti (MOG) 35-55 nei topi. I topi EAE sviluppare un corso di malattia progressiva. Il corso è suddiviso in tre fasi: la fase preclinica (giorno 0 - 9), l'insorgenza della malattia (giorno 10 - 11) e la fase acuta (giorno 12 - 14). MS e EAE sono indotti da cellule T autoreattivi che si infiltrano il sistema nervoso centrale. Queste cellule T secernono chemochine e citochine che portano al reclutamento di ulteriori cellule immunitarie. Pertanto, la distribuzione di cellule immunitarie nel midollo spinale durante le tre fasi della malattia è stata studiata. Per evidenziare il punto di tempo della malattia in cui inizia l'attivazione / la proliferazione / accumulo di cellule T, cellule B e monociti, la distribuzione delle cellule immunitarie nei linfonodi, la milza e il sangue è stato anche valutato. Inoltre, i livelli di diverse citochine (IL-1b, IL-6, IL-23, TNFa, IFNγ) nelle tre fasi di malattia sono stati determinati, al fine di conoscere i processi infiammatori della malattia. In conclusione, i dati forniscono una panoramica del profilo funzionale delle cellule immunitarie durante EAE patologia.
Introduzione
La sclerosi multipla (MS) e il corrispondente modello animale, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), mostrano variazioni neuroinfiammazione autoimmuni del sistema nervoso centrale (CNS). All'inizio lesioni della SM e EAE attivi sono caratterizzati dalla presenza di cellule immunitarie infiltrate. L'eziologia della SM rimane sconosciuta, ma è ampiamente considerato di coinvolgere la distruzione della mielina mediata dalle cellule T autoreattivi. Queste cellule T autoreattive secernono citochine pro-infiammatorie e chemochine che attraggono altre cellule del sistema immunitario come le cellule B, monociti e neutrofili dalla circolazione. I monoci....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
ETICA DICHIARAZIONE: Le nostre procedure sperimentali sono approvati dal Comitato Etico del Regierungspräsidium Darmstadt (Germania) e confermare le normative nazionali ed europee. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e ridurre il numero di animali utilizzati.
1. EAE Modello
- Induzione del modello EAE
- Utilizzare 10- a 13 settimane di età femminile 129S4 / SvJae × C57BL / 6 topi per l'induzione di EAE.
- Dare i topi una iniezione sottocutanea, nella parte superiore e inferiore della schiena, del encefalitogenico MOG 35 - peptide 55 (mielina ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La figura 1 fornisce una panoramica schematica dei diversi metodi descritti in questo articolo. 1) Topi riceve un'iniezione di MOG 35-55 antigene e sviluppare sintomi clinici iniziali dopo 10,7 ± 0,3 giorni 28. Un corso rappresentante della malattia di topi EAE è mostrato in Figura 1. 2) vari tessuti (milza, linfonodi, midollo spinale lombare) e il sangue sono estratti da topi di controllo e EAE.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il modello di EAE qui descritto ha ricevuto la massima attenzione come modello di SM ed è abitualmente utilizzato in fase di test strategie terapeutiche per la SM 32. La malattia del mouse presenta molte caratteristiche cliniche e istologiche della SM ed è causata dall'induzione di autoimmunità agli antigeni neuronali. La sensibilizzazione agli antigeni della mielina è associata con il cervello di sangue barriera erettile e in tal modo, l'infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centra.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
MJP è consulente di Xellia e Leo Pharmaceuticals.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Else Kröner-Fresenius (EKFS) Research Training Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) e dal "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" dello Stato dell'Assia.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di rilevamento di sequenza ABI Prism 7500 | Applied Biosystems, Austin, USA | sistema di PCR quantitativa | |
| Accutase | Sigma Aldrich Monaco di Baviera, Germania | di distacco cellulare | A6964 |
| CD3-PE-CF594 | BD, Heidelberg, Germania | 562286 | |
| CD4-V500 | BD, Heidelberg, Germania | 560782 | |
| CD8-eFluor650 | eBioscience, Francoforte, Germania | 95-0081-42 | |
| CD11b-eFluor605 | eBioscience, Francoforte, Germania | 93-0112-42 | |
| CD11c-AlexaFluor700 | BD, Heidelberg, Germania | 560583 | |
| CD19-APC-H7 | BD, Heidelberg, Germania | 560143 | |
| CD45-Vioblue | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-092-910 | |
| CompBeads | BD, Heidelberg, Germania | 552843 | perline di compensazione |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Monaco, Germania | C0130 | |
| Standard citometrico di conteggio assoluto | Polyscience, Eppelheim, Germania | BLI-580-10 | |
| Citometro Impostazione e Tracciamento delle perline | BD, Heidelberg, Germania | 642412 | |
| DNase I | Sigma Aldrich Monaco di Baviera, Germania | D5025 | |
| EAE Kit | Hooke Laboratories, Lawrence, USA | EK2110 | |
| F4/80-PE-Cy7 | BioLegend, Fell, Germania | 123114 | |
| Kit di sintesi del cDNA del primo filamento | Thermo Scientific, Schwerte, Germania | K1612 | |
| Tampone di blocco del recettore Fc-1 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-092-575 | |
| Conteggio assoluto citofluorimetrico standard | Polyscience, Eppelheim, Germania | 580 | |
| Software FlowJo v10 | Treestar, Ashland, USA | software per citometria a flusso | |
| LSRII/Fortessa | BD, Heidelberg, Germania | citometro a flusso | |
| Ly6G-APC-Cy7 | BD, Heidelberg, Germania | 560600 | |
| Soluzione di lisi | BD, Heidelberg, Germania | 349202 | |
| Maxima SYBR Green | Thermo Scientific, Schwerte, Germania | K0221 | colorante legante il DNA fluorescente |
| Kit RNeasy Mini | Qiagen, Hilden, Germania | estrazione dell'RNA | 74104 |
Riferimenti
- McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
- Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
- Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
