Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.
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Articolo metodologico
Intra-tracheale Amministrazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui, descriviamo una procedura dettagliata in modo efficiente e fornire direttamente Haemophilus influenzae attraverso le vie respiratorie inferiori di topi. Dimostriamo la procedura per la preparazione H. influenzae inoculo, instillazione intra-tracheale di H. influenzae nel polmone, raccolta di liquido di lavaggio bronco-alveolare (BAL), l'analisi delle cellule immunitarie nel BAL, e l'isolamento di RNA per differenziale analisi di espressione genica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare la risposta infiammatoria polmonare a qualsiasi batteri, virus o funghi. instillazione tracheale diretta è per lo più preferito su procedure intranasale o inalazione di aerosol in quanto fornisce in modo più efficiente l'inoculo batterico nel tratto respiratorio inferiore, con meno ambiguità.
Introduzione
L'infiammazione è un meccanismo immunitario fondamentale di difesa contro gli agenti infettivi. Promuove eradicazione e la riparazione dei tessuti danneggiati patogeno. Inoltre facilita il recupero ad un normale stato di salute 1. Tuttavia, l'infiammazione disregolato spesso porta a malattie infiammatorie croniche 2. Infiammazione delle vie aeree è un trigger iniziale per diverse malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), asma e fibrosi polmonare 3.
L'Haemophilus influenzae non tipizzabile (non incapsulata) (NTHi) è associata a malattie infiammatorie superi....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del Baylor Research Institute.
1. Coltura non tipizzabile Haemophilus influenzae (NTHi) e preparazione del Inoculo
- Piatto NTHi su una piastra di agar cioccolato e mantenere la piastra capovolta in un umidificata CO 2 incubatore notte a 37 ° C e 5% CO 2. Il giorno seguente, la cultura i batteri in brodo Brain Heart Infusion. Quindi, aggiungere 1 ml di brodo in una provetta sterile da 1,5 ml.
- Centrifugare a 4000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Poi, scartare i....
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Risultati
Instillazione intra-tracheale provocato un marcato aumento del numero di leucociti nel BALF (Figura 1A, pannello di sinistra) di installazione con soluzione salina. L'analisi conteggio differenziale dei leucociti mostrato chiaramente migliore infiltrazione dei neutrofili (Figura 1, pannello di destra). L'analisi FACS delle cellule nel BALF confermato ulteriormente l'aumento del numero di neutrofili (Figura 1B). L'analisi .......
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Discussione
Qui, si descrive una procedura unica e minimamente invasiva per inoculare i polmoni di topi con un agente patogeno batterico ai polmoni. Abbiamo dimostrato che questa procedura può essere utilizzata per studiare la funzione di geni differenti utilizzando topi che sono carenti di geni di vie di segnalazione infiammatorie. Questa procedura può anche essere usato per studiare le risposte infiammatorie alle infezioni polmonari virali e fungine. I vantaggi di questo procedimento rispetto ad altri metodi come intranasale o in.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Carson Harrod per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il signor Minghui Zeng e i dottori Mahesh Kathania e Prashant Khare per i loro contributi. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) e del Sammons Cancer Center (sovvenzione del progetto pilota) a K. Venuprasad.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra agar per cioccolato | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Destrosio anidro | Themo Scientific | R01300 | |
| Eparina | Hospira, Inc | RL-3010 | |
| Soluzione rapida Deft | Sigma | GS500-500ML | |
| Ago per siringa 20/26G | BD( | REF305115/175) | |
| Iml siringa | BD | REF 309602 | |
| Catetere 20GA | BD | REF | |
| Forbici da dissezione, diritte, lunghe 10 cm | kentscientific | INS600393 | |
| Pinze per iride, seghettate, lunghe 10 cm | kentscientific | per INS650915 | |
| #5 in acciaio inossidabile, lunga 11 cm | kentscientific | ||
| 10% Formalina | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarosio | peqlab | 35-1020 | |
| Provette da 5 ml in polistirene a fondo tondo | BD | REF 352058 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini | Qiagen | 74104 | |
| Motore pestile a pellet (Omogeneizzatore tissutale) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 piastre per microtitolazione a pozzetti Fondo V | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Diluizione di lavoro 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Diluizione di lavoro 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| Tampone di lisi RBC (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Kit di colorazione per cellule morte aqua riparabile Live/Dead | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/ CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| tubi Facs tubo fondo tondo polistirene | BD | 352052 | |
| Formaldeide | Polyscience | 4018 |
Riferimenti
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J.
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Ristampe e permessi
