Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Sommario

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Abstract

Qui, descriviamo una procedura dettagliata in modo efficiente e fornire direttamente Haemophilus influenzae attraverso le vie respiratorie inferiori di topi. Dimostriamo la procedura per la preparazione H. influenzae inoculo, instillazione intra-tracheale di H. influenzae nel polmone, raccolta di liquido di lavaggio bronco-alveolare (BAL), l'analisi delle cellule immunitarie nel BAL, e l'isolamento di RNA per differenziale analisi di espressione genica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare la risposta infiammatoria polmonare a qualsiasi batteri, virus o funghi. instillazione tracheale diretta è per lo più preferito su procedure intranasale o inalazione di aerosol in quanto fornisce in modo più efficiente l'inoculo batterico nel tratto respiratorio inferiore, con meno ambiguità.

Introduzione

L'infiammazione è un meccanismo immunitario fondamentale di difesa contro gli agenti infettivi. Promuove eradicazione e la riparazione dei tessuti danneggiati patogeno. Inoltre facilita il recupero ad un normale stato di salute ^1. Tuttavia, l'infiammazione disregolato spesso porta a malattie infiammatorie croniche ^2. Infiammazione delle vie aeree è un trigger iniziale per diverse malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), asma e fibrosi polmonare ^3.

L'Haemophilus influenzae non tipizzabile (non incapsulata) (NTHi) è associata a malattie infiammatorie superiori ed inferiori polmonari croniche ^4,5. E 'la specie dominante isolati dalle vie aeree inferiori di bambini e adulti con cronica ostruttiva ^4,6,7 malattia polmonare. La risposta infiammatoria dopo l'infezione NTHi è caratterizzata dalla sovraregolazione di citochine proinfiammatorie (come TNF e IL-1β), ed è mediata by mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) e fattore nucleare-kB (NF-kB) attraverso i recettori Toll-like (TLR) ^8.

Modelli murini sono strumenti molto utili per analizzare la patologia sottostante del polmone malattia infiammatoria a causa della disponibilità di diverse linee gene-carenti. Diversi metodi sono stati utilizzati per inoculare batteri vivi attenuati / e prodotti batterici, tra intranasale instillazione e aerosolized ^9,10 inalazione. Qui, dimostriamo intra-tracheale instillazione. Sebbene utilizzato meno frequentemente, questo approccio è più efficace e altamente riproducibili a causa della consegna diretta dell'inoculo al tratto respiratorio inferiore.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del Baylor Research Institute.

1. Coltura non tipizzabile Haemophilus influenzae (NTHi) e preparazione del Inoculo

1. Piatto NTHi su una piastra di agar cioccolato e mantenere la piastra capovolta in un umidificata CO ₂ incubatore notte a 37 ° C e 5% CO _2. Il giorno seguente, la cultura i batteri in brodo Brain Heart Infusion. Quindi, aggiungere 1 ml di brodo in una provetta sterile da 1,5 ml.
2. Centrifugare a 4000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Poi, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile 1x. Ripetere questa operazione una sola volta.
3. Trasferire 100 ml di soluzione di ri-sospeso in 900 ml di PBS 1x e misurare l'assorbanza della cultura diluito a 600 lunghezze d'onda nm in uno spettrofotometro.
4. Determinare l'unità di vitalità e formazione di colonies (CFU) del inoculo di coltura 1:10 diluizioni seriali su piastre di agar cioccolato e incubando overnight a 37 ° C e 5% CO _2.
5. Sulla base della vitalità e CFU determinata dal passaggio precedente, regolare l'inoculo ad una concentrazione finale di 20 x 10 ⁶ CFU / ml.

2. intra-tracheale (esso) instillazione

1. Iniettare il mouse per via intraperitoneale (ip) con 0,1 ml / 10 g di peso corporeo di mouse con un / ketamina + 20 mg / ml soluzione xylazina ml 150 mg. La procedura deve essere eseguita nel cappuccio con una sorgente luminosa per mantenere l'animale caldo.
2. Pizzicare lo spazio interdigitale del mouse per verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato.
3. Posizionare il mouse sul dorso. Radere la zona ventrale del collo e disinfettare con clorexidina e il 70% di alcol etilico.
4. Sollevare la pelle della parte ventrale superiore del collo usando ratto pinze dente. Fai una piccola incisione (0,5-1,0 cm) sopra il timo con un bisturie sezionare accuratamente il muscolo per esporre la trachea.
   1. Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 G, iniettare lentamente 0,05 ml di aria, seguito da 0,05 ml NTHi ottenuti dalla sezione 1 o soluzione salina come controllo, seguita da un'altra 0,05 ml di aria. Tenere animali verticale per circa 1 min.
5. Chiudere l'incisione con la colla chirurgica. Mantenere il mouse lateralmente reclinata e caldo per circa 10 min.

3. Raccolta BALF

1. Sacrificare il mouse cervicale dislocazione 24 ore dopo l'infezione.
2. Aprire la cavità addominale del mouse con forbici anatomiche e tagliare l'aorta ventrale a sanguinare. Esporre la parte ventrale del polmone.
3. Esporre la trachea e intubare con un catetere 20 gauge. Instillare 0,8 ml di tampone BAL (1x PBS, 0.1% di destrosio, 10 U / ml di eparina) e raccogliere il lavaggio aspirando delicatamente. Ripetere questa procedura per tre volte.
4. Contare il numero totale di cellule in 100 microlitri di sospensione BALF utilizzando un hemocytometro a 10 ingrandimenti con Trypan Blue colorazione.
5. Preparare vetrini per modificare la colorazione Giemsa. Un'aliquota di 100 ml di BAL nei rispettivi pozzetti della cytospin e centrifugare a 500 xg per 5 min. Asciugare le diapositive per 10 minuti e macchiare le cellule utilizzando modificato macchia Giemsa secondo protocolli del produttore.
6. Utilizzare le cellule rimanenti per la successiva analisi, come la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), microscopia confocale, l'espressione genica e Western Blot ^11-13.

4. istopatologia Preparazione

1. Per l'analisi istopatologia, infettare i topi con NTHi come descritto al punto 2.4. Dopo 24 ore di infezione, sacrificare gli animali da dislocazione cervicale. Tagliare aprire la cavità toracica con le forbici anatomiche per esporre i polmoni e la trachea come accennato prima. Quindi, inserire il catetere 20 gauge nella trachea.
2. Riempire il polmone con il 2% soluzione di agarosio calda preparata in formalina 4%. Una volta che ilpolmoni sono completamente gonfiati, posto ghiaccio sulla parte superiore dei polmoni a solidificare la soluzione di agarosio.
3. Poi, rimuovere con attenzione la spina dorsale e metterlo in una soluzione 50 ml di formalina 4% in PBS 1x fino a quando non viene elaborato per (H & E) sezioni ematossilina eosina.

5. FACS colorazione delle cellule nel BALF

1. Mettere 1 x 10 ⁵ cellule dal fluido BALF in un piatto titolo micro V-bottom 96 pozzetti.
2. Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS e far girare a 4000 xg per 3 min a 4 ° C.
3. Macchiare le cellule con soluzione macchia cellule in 100 microlitri 1x PBS (1: 1.000 diluizione) e mantenere a temperatura ambiente per 15 min.
4. Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C.
5. Mantenere cellule in 100 ml di FACS tampone di lavaggio [tampone di lavaggio (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% di sodio azide] contenente 1: 100 diluito Fc-Block per 15 min a 4 ° C.
6. cellule centrifugare a 4000 xg per 3 min e scartare supernatant.
7. cellule macchia con 100 microlitri superficie colorazione cocktail (diluizione 1: 100) in tampone di lavaggio FACS per 30 minuti a 4 ° C.
8. Lavare le cellule tre volte con 300 ml di tampone di lavaggio FACS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C.
9. Fix cellule in 100 ml di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente.
10. Lavare le cellule due volte con 300 microlitri di PBS 1x a 400 xg per 3 min a 4 ° C e risospendere in 300 ml di tampone di lavaggio FACS.
11. Effettuare controlli per la colorazione monocolore citometria a flusso perline.
    1. Aggiungere una goccia di perle nel piatto microlitro 96 pozzetti V-parte inferiore e lavare con 200 microlitri 1x PBS.
    2. Aggiungere 1 ml di colorazione degli anticorpi a 100 l PBS 1x e perline e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Lavare perle due volte con 300 ml 1x PBS.
12. Analizzare i controlli e le singole cellule macchiato mediante citometria di flusso ^14.

6. L'omogeneizzazione di tessuto polmonare per isolare l'RNA

1. Dopo l'infezione, raccogliere un piccolo pezzo di polmone (20-40 mg) e conservarlo in RNA stabilizzante reattivo a 4 ° C durante la notte. Poi, conservare a -80 ° C fino alla fase successiva.
2. Lavare i tessuti del polmone a freddo 1x PBS per sbarazzarsi del reagente stabilizzazione RNA.
3. Posizionare il tessuto in un tampone di lisi contenente 1,5 ml tubo da centrifuga (1 ml di buffer di lisi + 10 ml β-mercaptoetanolo).
4. Tritare il tessuto in piccoli pezzi con le forbici a punta ed omogeneizzare con un cordless pestello pellet motore per 20-40 secondi.
5. Mantenere il lisato in ghiaccio per 5 minuti e procedere con passo 7.1.

7. Isolamento RNA dal polmone

1. Centrifugare il lisato a 18.000 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante pipettando e trasferire con cura in una nuova provetta da 1,5 ml.
2. Aggiungere 1 volume di etanolo 70% al lisato. Mescolare immediatamente pipettando e aspettare 2-4 minuti.
3. Trasferire fino a 700 ml di lisato ad una colonna di spin localein un tubo di raccolta 2 ml.
4. Centrifugare a 9.600 xg per 15 sec e scartare il flow-through.
5. Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through.
6. Aggiungere 80 microlitri DNasi direttamente alla membrana Spin Column e mantenere a temperatura ambiente per 15 min.
7. Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through.
8. Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through.
9. Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e far girare a 9.600 xg per 2 minuti. Gettare il flow-through.
10. Porre la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. Gettare il flow-through.
11. Aggiungere 30-50 acqua priva di RNasi microlitri direttamente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. RNA Conservare a -80 ° C.
12. Eseguire l'analisi RNA-Seq ^14.

Risultati

Instillazione intra-tracheale provocato un marcato aumento del numero di leucociti nel BALF (Figura 1A, pannello di sinistra) di installazione con soluzione salina. L'analisi conteggio differenziale dei leucociti mostrato chiaramente migliore infiltrazione dei neutrofili (Figura 1, pannello di destra). L'analisi FACS delle cellule nel BALF confermato ulteriormente l'aumento del numero di neutrofili (Figura 1B). L'analisi ...

Discussione

Qui, si descrive una procedura unica e minimamente invasiva per inoculare i polmoni di topi con un agente patogeno batterico ai polmoni. Abbiamo dimostrato che questa procedura può essere utilizzata per studiare la funzione di geni differenti utilizzando topi che sono carenti di geni di vie di segnalazione infiammatorie. Questa procedura può anche essere usato per studiare le risposte infiammatorie alle infezioni polmonari virali e fungine. I vantaggi di questo procedimento rispetto ad altri metodi come intranasale o in...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra agar per cioccolato	Fisher Scientific	CAS50-99-7
Destrosio anidro	Themo Scientific	R01300
Eparina	Hospira, Inc	RL-3010
Soluzione rapida Deft	Sigma	GS500-500ML
Ago per siringa 20/26G	BD(	REF305115/175)
Iml siringa	BD	REF 309602
Catetere 20GA	BD	REF
Forbici da dissezione, diritte, lunghe 10 cm	kentscientific	INS600393
Pinze per iride, seghettate, lunghe 10 cm	kentscientific	per INS650915
#5 in acciaio inossidabile, lunga 11 cm	kentscientific
10% Formalina	Fisher Scientific	CAS 67-56-1
Agarosio	peqlab	35-1020
Provette da 5 ml in polistirene a fondo tondo	BD	REF 352058
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Light Labs	A-7001-R
Reasy Mini	Qiagen	74104
Motore pestile a pellet (Omogeneizzatore tissutale)	Sigma	Z359971-1EA
96 piastre per microtitolazione a pozzetti Fondo V	Thermo	2605
1X PBS	Gibco	10010-023
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
CD45.2-APC	eBioscience	17-0454-81	Diluizione di lavoro 1:100
Ly-6G-eFlor 450	eBioscience	48-5931-82	Diluizione di lavoro 1:100
BSA	HyClone	SH30574.03
Tampone di lisi RBC (10X)	Biolegend	420301
Kit di colorazione per cellule morte aqua riparabile Live/Dead	Invitrogen	L-34957
EDTA (0.5M)	lifetechnologies	15575-020
CD16/ CD32 FcBlock	BD	553142
tubi Facs tubo fondo tondo polistirene	BD	352052
Formaldeide	Polyscience	4018

381433 Pinzetta INS600095