L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti una serie di metodi per la decapsulazione ad alto rendimento di embrioni e larve di Lymnaea stagnalis in preparazione per l'ibridazione in situ dell'intera montatura e per i successivi trattamenti pre e post-ibridazione.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è una tecnica che consente la risoluzione spaziale di molecole di acido nucleico (spesso mRNA) all'interno di una preparazione dei tessuti 'intero monte', o stadio di sviluppo (ad esempio, un embrione o larva) di interesse. WMISH è estremamente potente, perché può contribuire in modo significativo alla caratterizzazione funzionale di genomi complessi metazoi, una sfida che sta diventando sempre più di un collo di bottiglia con il diluvio di dati di sequenza di prossima generazione. Nonostante la semplicità concettuale della tecnica molto tempo è spesso necessaria per ottimizzare i vari parametri inerenti esperimenti WMISH per sistemi modello nuovi; sottili differenze nelle proprietà cellulari e biochimiche tra tipi di tessuto e le fasi di sviluppo significa che un singolo metodo WMISH potrebbe non essere adatto per tutte le situazioni. Abbiamo sviluppato una serie di metodi WMISH per il modello gasteropode Lymnaea stagnalis riemergenti che generano coerente esegnali WMISH chiari per una serie di geni, e in tutte le fasi di sviluppo. Questi metodi includono l'assegnazione di larve di sconosciuto età cronologica a una finestra ontogenetica, la rimozione efficiente di embrioni e larve dalle loro capsule uovo, l'applicazione di un idoneo trattamento con proteinasi-K per ogni finestra ontogenetica e ibridazione, post-ibridazione e immunolocalizzazione gradini. Questi metodi forniscono una base da cui il segnale risultante per un dato trascrizione di RNA può essere ulteriormente raffinato con aggiustamenti specifici sonda (principalmente sondare concentrazione e temperatura di ibridazione).
Introduzione
I molluschi sono un gruppo di animali che tengono l'interesse di una vasta diversità di discipline scientifiche. Nonostante la loro diversità morfologica 1, ricchezza di specie (secondo solo a Artropodi in termini di numero di specie 2) e rilevanza per una vasta gamma di commerciali 3, 4 medici e scientifici questioni 5-8, ci sono relativamente poche specie di molluschi che possono vantare di essere entrambi i modelli scientifici ben attrezzate e facili da mantenere in un ambiente di laboratorio. Un mollusco che è molto utilizzato da discipline come la neurobiologia 9, ecotossicologia 10....
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Protocollo
NOTA: Le seguenti operazioni delineano il nostro metodo per condurre un esperimento in situ su stadi embrionali e larvali di L. stagnalis. Qualora un passo prevede l'utilizzo di un prodotto chimico pericoloso questo è indicato dalla parola 'ATTENZIONE' e tutte le procedure di sicurezza appropriate devono essere adottate. Collegamenti a fogli rappresentative scheda di sicurezza per sostanze chimiche pericolose sono forniti in file supplementare 1. Ricette per tutti i reagenti sono forniti in file integrativa 2.
1. Assemblea dei Decapsulation Apparato
- Per fare questo....
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Risultati
I pattern di colorazione WMISH rappresentante mostrato in Figura 3 sono stati generati utilizzando la tecnica sopra descritta, e riflettono una varietà di modelli di espressione spaziale per geni coinvolti in una serie di processi molecolari che vanno dalla formazione del guscio (gene Novel 1, 2, 3 e 4), alla segnalazione cellula-cellula (DPP) del regolamento di trascrizione (Brachyury) in una serie di fasi di sviluppo. Anche se non ab.......
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Discussione
Il metodo qui descritto permette la visualizzazione efficiente dei trascritti di RNA con presumibilmente diversi livelli di espressione all'interno di tutte le fasi di sviluppo di Lymnaea stagnalis. Per rimuovere gli embrioni e larve dalle loro capsule abbiamo trialed una varietà di sostanze chimiche, shock osmotico e trattamenti fisici riportati per altri encapsulated- lo sviluppo di organismi modello. Tuttavia, nelle nostre mani il metodo che descriviamo qui è l'unica tecnica high-throughput che rimuo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di DJJ attraverso il progetto DFG # JA2108 / 2-1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinze peso piuma | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Tubi in silicone | Glasgerä tebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Capillari in vetro | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 piastre per coltura tissutale | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldeide | Carl Roth | P733.1 | ATTENZIONE - Può causare il cancro. Tossico per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Tossico: pericolo di effetti irreversibili molto gravi per inalazione, a contatto con la pelle e in caso di ingestione. |
| Acido etilendiammina tetraacetico | Carl Roth | CN06.3 | ATTENZIONE - PROVOCA IRRITAZIONE AGLI OCCHI. PUÒ CAUSARE IRRITAZIONE DELLE VIE RESPIRATORIE E DELLA PELLE. Evitare di respirare la polvere. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle e gli indumenti. Utilizzare solo con un'adeguata ventilazione |
| Cloruro di magnesio | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Può essere dannoso se ingerito. |
| Cloruro di sodio | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll tipo 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polivinilpirrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Può essere dannoso se ingerito. |
| Senza nucleasiSiero bovino Albumina | Carl Roth | 8895.1 | |
| Sperma di salmone | Carl Roth | 5434.2 | |
| Eparina | Carl Roth | 7692.1 | ATTENZIONE - GLI EFFETTI AVVERSI INCLUDONO EMORRAGIA, IRRITAZIONE LOCALE. POSSIBILE REAZIONE ALLERGICA SE INALATO, INGERITO/CONTATTATO. IRRITANTE PER OCCHI/PELLE/VIE RESPIRATORIE. POSSIBILE IPERSENSIBILIZZAZIONE. È STATO SEGNALATO CHE DURANTE LA GRAVIDANZA AUMENTA IL RISCHIO DI NATIMORTALITÀ |
| Proteinasi-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glicina | Carl Roth | 3790.2 | |
| Formammide deionizzata | Carl Roth | P040.1 | ATTENZIONE - Irritante per gli occhi e la pelle. Può essere dannoso per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Può causare danni al nascituro. Igroscopico. |
| Formamide standard | Carl Roth | 6749.3 | ATTENZIONE - Irritante per gli occhi e la pelle. Può essere dannoso per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Può causare danni al nascituro. Igroscopico. |
| Trietanolammina | Carl Roth | 6300.1 | ATTENZIONE - Evitare di respirare vapore o nebbia. Evitare il contatto con gli occhi. Evitare il contatto prolungato o ripetuto con la pelle. Lavare accuratamente dopo la manipolazione. |
| Anidride acetica | Carl Roth | 4483.1 | ATTENZIONE - PROVOCA GRAVI USTIONI ALLA PELLE E AGLI OCCHI. REAGISCE VIOLENTEMENTE CON L'ACQUA. NOCIVO SE INGERITO. VAPORI IRRITANTI PER GLI OCCHI E LE VIE RESPIRATORIE |
| Acido maleico | Carl Roth | K304.2 | ATTENZIONE - Molto pericoloso in caso di contatto con gli occhi (irritante), di ingestione, . Pericoloso in caso di contatto con la pelle (irritante), di inalazione (irritante polmonare). Leggermente pericoloso in caso di contatto con la pelle (permeatore). Corrosivo per gli occhi e la pelle. |
| Benzil benzoato | Sigma | B6630-250ML | ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Nocivo se ingerito. |
| Alcool benzilico | Sigma | 10,800-6 | ATTENZIONE - Nocivo se ingerito. Nocivo se inalato. Provoca grave irritazione agli occhi. |
| Glicerolo | Carl Roth | 3783.1 | |
| Polvere bloccante | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab frammenti AP coniugato | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blu tetrazolio cloruro in dimetilformammide | Carl Roth | 4421.3 | ATTENZIONE - Può causare danni al nascituro. Nocivo per inalazione e a contatto con la pelle. Irritante per gli occhi. |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato | Carl Roth | A155.3 | ATTENZIONE - Potenzialmente dannoso se ingerito. Non entrare in contatto con la pelle, negli occhi o sugli indumenti. Potenziale irritante per la pelle e gli occhi. |
| N-acetil cisteina | Carl Roth | 4126.1 | |
| Ditiotreitolo | Carl Roth | 6908.1 | ATTENZIONE - Può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Può causare irritazione delle vie respiratorie e dell'apparato digerente. Le proprietà tossicologiche di questo materiale non sono state completamente studiate. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Può essere dannoso se ingerito. |
| Sodio dodecil solfato | Carl Roth | CN30.3 | ATTENZIONE - Nocivo se ingerito. Tossico a contatto con la pelle. Provoca irritazione della pelle. Provoca gravi danni agli occhi. Può causare irritazione delle vie respiratorie. |
| Cloruro di potassio | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-sodio idrogeno fosfato diidrato (Na2HPO4• 2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Diidrogeno fosfato di potassio (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodio citrato diidrato (C6H5Na3O7• 2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | ATTENZIONE - Può causare irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Le proprietà tossicologiche di questo materiale non sono state completamente studiate. |
| Olio minerale | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
Riferimenti
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the Uni....
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Ristampe e permessi
