Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee

Sommario

Questo manoscritto fornisce la procedura dettagliata dell'iniezione intra-iliaca dell'arteria (IIA), una tecnica per fornire cellule tumorali specificamente ai tessuti degli arti posteriori, comprese le ossa, per stabilire metastasi ossee sperimentali. Sebbene inizialmente stabilito con modelli di tumore al seno, questo protocollo può essere facilmente esteso ad altri tipi di cancro.

Abstract

L'iniezione intra-iliaca (IIA) è un approccio efficace per introdurre lesioni metastatiche di varie cellule tumorali negli animali. Rispetto alle iniezioni intracardiache e intratibiali ampiamente utilizzate, l'iniezione di IIA porta diversi vantaggi. In primo luogo, può fornire una grande quantità di cellule tumorali specificamente alle ossa degli arti posteriori, fornendo così eventi di colonizzazione in fase iniziale sincronizzati spazio-temporalmente e consentendo una solida quantificazione e un rapido rilevamento delle cellule tumorali disseminate. In secondo luogo, inietta le cellule tumorali nella circolazione senza danneggiare i tessuti locali, evitando così i processi infiammatori e di guarigione delle ferite che confondono il processo di colonizzazione ossea. In terzo luogo, l'iniezione di IIA provoca una crescita metastatica molto ridotta negli organi non ossei, impedendo così agli animali di soccombere ad altre metastasi vitali e consentendo il monitoraggio continuo delle lesioni ossee indolenti. Questi vantaggi sono particolarmente utili per l'ispezione della progressione da singole cellule tumorali a micrometastasi multicellulari, che in passato è stata in gran parte sfuggente. Se combinata con approcci all'avanguardia di imaging biologico e istologia ossea, l'iniezione di IIA può essere applicata a vari scopi di ricerca relativi alle metastasi ossee.

Introduzione

Le metastasi rappresentano oltre il 90% dei decessi causati da tumori solidi. Bone è l'organo più comuni colpite da metastasi di vari tipi di cancro, in particolare della mammella e della prostata. Al momento della diagnosi in clinica, metastasi ossee di solito sono già entrati fase avanzata sia con osteolitiche o osteoblastiche alterazioni nel tessuto osseo, spesso accompagnati da sintomi neurologici.

Studi precedenti prevalentemente concentrati sulle evidenti metastasi osteolitiche ^1-3, ma attualmente abbiamo limitato la comprensione di micrometastasi nel ossa prima dell'inizio del processo osteolitica. Questo è almeno in parte a causa della mancanza di appropriati modelli sperimentali e approcci. Modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno spesso metastatizzano ai polmoni, ma molto meno efficiente alle ossa ^4. Allo stesso modo, i tumori ortotopicamente trapiantati raramente sviluppano metastasi ossee spontanee, con un po '4T1 carcinom mammaria osso-tropicaleun sub-cloni e MSP overexpressed PyMT modello di topo transgenico come eccezioni ^5-7. Intra-tibiale di perforazione in grado di fornire le cellule tumorali fino all'osso ^8-10, ma incorre anche danni e infiammazioni ai tessuti locali. Attualmente iniezione intra-cardiaca di linee di cellule di cancro al seno è stato l'approccio importante per indagare la colonizzazione ossea ^11-13. Tuttavia, dopo che le cellule tumorali sono introdotti nel ventricolo sinistro solo una parte limitata giungere infine a ossa e midollo osseo, rendendo difficile tenere traccia metastasi microscopiche in modo quantificabile.

In questo studio, si stabilisce una tecnica, vale a dire l'arteria intra-iliaca (IIA) di iniezione ^14, per fornire selettivamente le cellule tumorali nei tessuti degli arti posteriori, arricchendo in tal modo le cellule tumorali nel midollo e nel midollo osseo senza causare danni ai tessuti locali. A causa della specificità dell'osso, questo approccio consente anche abbastanza tempo per le cellule tumorali indolenti a colonizzare eventualmente prima della unimals soccombono ai tumori primari o metastasi in altri organi vitali. In combinazione con una varietà di altre tecniche, come l'imaging bioluminescenza, immunofluorescenza e Istomorfometria ossa, iniezione IIA è potenzialmente utile per una vasta gamma di scopi di ricerca relativi alla metastasi ossee, soprattutto per tenere traccia la progressione da cellule tumorali singole a più celle micrometastasi. In particolare, abbiamo dimostrato che l'iniezione IIA ci permette di visualizzare le interazioni tra cellule tumorali e vari tipi di cellule che circonda nel microambiente osseo.

Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato fatto in accordo con le linee guida per la cura degli animali del Baylor College of Medicine.

1. Preparazione delle cellule

Nota: differenti linee cellulari possono essere utilizzati per l'iniezione IIA seconda scopi di ricerca. Abbiamo utilizzato linee di cellule di cancro al seno MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 e la linea di cellule di cancro alla prostata C4-2 nella nostra ricerca. Usiamo tipicamente sia GFP e lucciola luciferasi cellule tumorali marcato per il nostro studio e alcuni dati qui dalla linea cellulare MCF7 GFP-luciferasi marcato.

1. Mantenere cellule in DMEM contenente 10% FBS e 0,1 mg / ml di penicillina-streptomicina a 37 ° C in 5% CO _2.
2. Prima dell'iniezione IIA, trypsinize le cellule a 80 - 90% confluenza con il 0,25% soluzione / EDTA tripsina. Utilizzare PBS freddo per lavare le cellule due volte, e risospendere le cellule in 10 ml di PBS per il conteggio delle cellule. Per rimuovere PBS, le cellule centrifugare a 800 xg per 5 min.
3. cellule Risospenderead una concentrazione di 5 x 10 ⁶ cellule / ml in PBS ghiacciato.
4. Utilizzare 100 ml GFP e cellule tumorali luciferasi marcato Firefly per IIA iniezione di un mouse.
   Nota:. Pertanto, il numero di celle ricevute da ciascun animale è 5 x 10 ⁵ Questo numero può essere necessario modificare in base alla aggressività delle linee cellulari.
5. Mantenere sospensioni cellulari sul ghiaccio.
   Nota: Le vibrazioni possono essere necessari per prevenire l'aggregazione delle cellule ogni pochi minuti fino a quando è pronto per l'iniezione. Per alcune linee cellulari (come MDA-MB-231), possono essere necessarie procedure più rigorose (ad esempio, di passaggio 45 micron colino cellula) per prevenire l'aggregazione. Si prega di notare che lo zoccolo dei vasi può provocare necrosi del tessuto, e quindi confondendo gli esperimenti.

2. Preparazione degli animali

1. Per la gestione del dolore degli animali, dare 5 mg / kg / die carprofen (o altro analgesico) con integratore alimentare per i topi non meno di 24 ore prima dell'intervento chirurgico. Amministrareuna dose di 0,1 mg / ml di buprenorfina per via sottocutanea 60 min prima dell'intervento. Nota: una procedura opzionale è quello di impiantare estradiolo pallet nella parte posteriore degli animali per fornire estradiolo supplementare. Questo accelererà il crescere delle cellule ER + tumorali (ad esempio, cellule MCF-7) ^9.
2. Anestetizzare 4 - 6 settimane di età mouse (circa 20 g) con ketamina (80 - 100 mg / kg) e xilazina (10 -12.5 mg / ml) mediante iniezione intraperitoneale.
3. Confermare il livello appropriato di sedazione di un 20 g mouse pizzico punta e l'osservazione di una riduzione del 50% della frequenza respiratoria e rosa mucose (ad esempio, la pelle dell'orecchio del mouse e la pelle della zampa). Continuare a monitorare questi segni vitali ogni 15 min durante l'intervento chirurgico. Nota: Nessun movimento dell'animale indica che l'animale è sufficientemente anestetizzati e pronto per la chirurgia.
4. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza.
5. Shave il mouse sul basso addome, in particolare la zona inguinale destra dove l'intervento chirurgico e l'iniezione saràprendere posto.
   Nota: Questo non è necessario se si utilizzano topi nudi atimici.
6. Mettere il mouse sul dorso, diffondere le gambe in posizione naturale e bastone le dita dei piedi per cellulare dissezione cartone con nastro adesivo.
7. Pulire la zona inguinale destra con il 70% tamponi di cotone sterili etanolo isopropilico imbevuti, seguito con betadine scrub chirurgico più volte.

3. La Vena iliaca comune e Arteria posizione e Separazione

1. Effettuare una incisione cutanea di 1,0 - 1,2 cm di lunghezza tra il 4 ^° e 5 ^° capezzoli nell'addome basso a destra con sterili, # 10 di carbonio lame di bisturi in acciaio detenute in un manico n ° 3. Quindi utilizzare un telo chirurgico sterile per coprire il corpo animale ad eccezione del sito di incisione.
2. Spostare l'animale al banco di livello superiore dissezione microscopio. Utilizzare un ingrandimento di 4X per l'iniezione.
3. Sotto 4X ingrandimento del microscopio dissezione, inserire una pinza separazione smussato tra il tessuto adiposo e il peritoneum, e spingere i tessuti verso l'esterno su entrambi i lati per esporre i vasi iliaci e nervi (vedi Figura 1).
   Nota: L'arteria tra aorta dalla linea mediana e la parte inferiore dei rami dell'arteria è chiamata iliaca comune. È qui che l'iniezione avviene.
4. Utilizzare un paio di pinze sottili dritti a sfondare il tessuto connettivo (come una membrana) tra le navi e il nervo, più vicino ai vasi.
5. Accendere i pinza sottile rette per la mano sinistra. Afferra un paio di pinze sottili ad angolo con la mano destra. Inserire le pinze mano destra nella stessa posizione in cui sono stati suddivisi i tessuti connettivi. E poi attaccare le pinze mano destra attraverso, sotto i vasi.
6. Allo stesso tempo, inserire le pinze mano sinistra nei tessuti connettivi sul lato sinistro delle navi per guidare le pinze mano destra che passano attraverso.
7. Una volta che la pinza mano destra ottiene sotto i vasi, cercare di separare le navi dal ti circondaSSUE un po 'di più, e poi tenerli in cima alle pinze mano destra.
8. Utilizzare pinze mano sinistra per consegnare la punta di una sutura 4-0 di seta per le pinze mano destra, e poi tirare delicatamente e lentamente la sutura attraverso sotto i vasi. Nota: Ora entrambe vasi vena e arteria comuni sono sollevati dalla sutura (vedi Figura 2).

4. iniezione e post-iniezione di cura

1. Preparare le cellule per l'iniezione in una siringa da insulina 31 G. Utilizzare 100 ml di sospensione cellulare in PBS per iniezione. Assicurati di pipetta su e giù più volte per separare le cellule ed evitare l'aggregazione in modo che le cellule iniettate non intasare e bloccare il flusso di sangue.
2. Con la pinza angolata nella mano sinistra, mettere le pinze sotto i vasi lungo la guida della sutura, e quindi aprire i due bracci della pinza, avendo i vasi detenuti delicatamente sulle pinze.
   Nota: L'intervallo tra i due bracci della pinza sarà l'isito njection.
3. Tenere il 31 ago G con 100 microlitri sospensioni cellulari nella mano destra, con la smussatura dell'ago verso l'alto, pronto per l'iniezione.
4. Inserire l'ago nel lume dell'arteria (sangue entrerà la punta dell'ago). Poi spingere sospensione cellulare lentamente per iniettare le cellule. La sospensione cellulare spingerà il sangue rosso nel vaso. Cercate di non rompere i vasi o perdite sospensione cellulare fuori.
5. Quando l'iniezione è terminata, tirare delicatamente indietro l'ago e tenere premuto il navi fino alle pinze mano sinistra per fermare l'emorragia. Poi tirare via la sutura.
6. Sganciare la pinza della mano sinistra, e utilizzare rapidamente un batuffolo di cotone di premere l'area di incisione dell'arteria per fermare l'emorragia.
   Nota: Di solito 5 - 10 min pressione continua è sufficiente per fermare l'emorragia.
7. Quando il sanguinamento si ferma, usare la colla pelle per chiudere i bordi pelle della zona intervento chirurgico. Fare un marchio auricolare, e verificare la presenza di bioluminescenza segnalazione per esaminare la distribuzione delle cellule iniettate.
   Nota: Una iniezione di successo si tradurrà in un'immagine simile alla figura 3.
   1. Controllare segnalazione bioluminescenza mediante iniezione di 100 microlitri 15 mg / ml luciferina in PBS a 75 mg / kg concentrazione mouse mediante il seno intra-orbitale.
      1. Per l'iniezione intra-orbitale, mettere le dita su entrambi i lati degli occhi del mouse, usare la pressione per fare bulbo oculare leggermente pop fuori dal telaio occhio, inserire 28 g di aghi di insulina siringa tra palla occhio e il naso, e quindi spingere lentamente la siringa per iniettare luciferina .
         Nota: Nella posizione corretta, l'ago deve essere in grado di raggiungere una profondità di 2 - 3 mm prima di colpire tessuti duri (osso).
      2. Posizionare il mouse nel sistema di imaging per l'imaging in vivo animale intero per 10-60 secondi a 5 minuti (vedi figura 3).
         Nota: Una procedura opzionale è quello di impiantare estradiolo pellet nella parte posteriore degli animali per fornire estradiolo supplementare. Questo accelererà la crescita delle cellule tumorali ER + (per esempio, MCF-7celle) ^15.
8. Lasciare il mouse su una piastra elettrica caldo fino a quando non si sveglia. Monitorare il sanguinamento, gonfiore, segni di deiscenza e dolore durante il periodo post-chirurgica. Mettere i topi torna alla gabbia con una copertura analgesica (carprofin supplemento dietetico suggerito) data per la gestione del dolore fino a quando non segni di dolore. Fate molta attenzione e cura per gli animali durante 7 giorni dopo l'intervento.

5. Monitoraggio metastatico crescita

1. Istomorfometria:
   1. Harvest tumore cuscinetto tessuti ossei, fissare le ossa in paraformaldeide al 4% per 24 ore, poi li Decalcificare a pH 7.0 soluzione EDTA 14% per 3 - 5 giorni, e sottoporli a paraffina embedding come descritto in precedenza ^14.
   2. Sezione tessuti ossei paraffina incorporare al spessore di 3 micron ed eseguire il metodo istologico standard ematossilina / eosina come descritto in precedenza ^14.
2. Immunohistochemisprovare:
   1. Soggetto paraffina osso cuscinetto tumore scivola di immunoistochimica colorazione per vari scopi, come descritto in precedenza ^14. In breve, immunostain MCF7 cellule tumorali da anticorpi anti-GFP e cellule osteogeniche immunostain (pre-osteoblasti e osteoblasti) da anticorpi anti-Osterix e anticorpi anti-fosfatasi alcalina (ALP), rispettivamente.

Risultati

La figura 1 illustra la posizione anatomica e rapporto iliaca comune (rosso) e vena (blu).

La figura 2 mostra la posizione relativa dei vasi iliaci e nervi al microscopio di dissezione. Come illustrato nella Figura 2A, i vasi e nervi sono proprio sotto la parete peritoneale e possono essere rivelate dopo l'incisione cutanea è fatto e il peritoneo viene spinto via. La vena ilia...

Discussione

Anche se solo l'arteria iliaca è il bersaglio di iniezione per le cellule tumorali, si consiglia la separazione sia della vena iliaca e l'arteria dai tessuti circostanti, e di sollevare loro insieme come un fascio. Questo perché la vena e arteria ampiamente contatto tra loro, e la parete del vaso venoso è sottile ed è facile da rompere. Pertanto, per una iniezione di successo, fa risparmiare tempo e fatica a reggere le due navi insieme, anche se le cellule tumorali vengono iniettate solo per l'arteria. Una s...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Anfatericina B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Soluzione di tripsina/EDTA	HyClone	SH30042.01
45 μ Filtro cellulare	M VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF con carprofene	Articolo controllato dalle cure veterinarie in BCM		Per la gestione del dolore
Buprenorfina	Articolo controllato da cure veterinarie in BCM		Per la gestione del dolore
Pellet di estradiolo	Ricerca innovativa dell'America	SE-121
Ketamina e xilazina	Articolo controllato da cure veterinarie in BCM
Unguento veterinario	Articolo controllato da cure veterinarie in BCM		Evitare la secchezza oculare
Rasoio	Oster	78005-050	Per topi pelosi
Etanolo isopropilico	ACROS	67-63-0
Scrub chirurgico Betadine	Prodotto controllato da cure veterinarie in
#10	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Manico multiplo
n. 3 Ted	Pella, Inc	541-31	Bisogno di essere sterilizzato in autoclave
Telo chirurgico sterile	Tecnologia	di infusione SaiPSS-SD1
Pinza dritta	Strumento chirurgico Roboz	RS-5132	Necessità di autoclavaggio
Pinze fini diritte	Strumenti per la scienza	fine 11253-20	Necessità di autoclavazione
Pinze fini bordate	Strumenti per la scienza fine	11253-25	Necessità di autoclave
4-0 Sutura in seta Vicryl	Johnson & Siringhe per insulina Johnson Health Care	J214H
31 G	BD	328418
Cotton fioc multipli con cotton fioc (sterili)	VWR International Laboratory	89031-272
Colla per la pelle	Henry Schein Animal Health	31477	Per la chiusura della pelle del sito chirurgico
Applicatore di marchi auricolari	scienza fine	24220-00
	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferina	Gold Biotechnology	LUCK	Evitare la luce e mettere sul ghiaccio
Siringhe da insulina da 28 G	BD	329410	Per iniezione intraorbitale
Paraformadeide	Alfa Aesar	30525-89-4	Per la fissazione dei tessuti
EDTA	OmniPur	4050	Per la decalcificazione del tessuto osseo
< strong>Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
Microscopio di dissezione	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II sistema di imaging	Advanced Molecular Vision
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
>Antibodies
Anticorpi anti-GFP (JL-8)	Clontech	632381
Anticorpi anti-ALP	Abcam	ab108337
Anti-Osterix anticorpi	Abcam	ab22552