Questo protocollo è preparato per condividere il nostro metodo di isolamento delle cellule endoteliali coronariche di topo a scopo di imaging o per condurre esperimenti di biologia molecolare.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule endoteliali linea la parete interna dei vasi sanguigni e svolgono un ruolo importante nella regolazione del tono vascolare, la permeabilità vascolare, e la formazione di nuovi vasi. La disfunzione delle cellule endoteliali è implicato nello sviluppo e nella progressione di molte malattie cardiovascolari, tra cui cardiopatia ischemica. Per esaminare la funzione e caratterizzazione di cellule endoteliali coronariche, isolamento delle cellule è il primo passo e richiede elevata purezza e quantità di condurre esperimenti successivi. Questo protocollo descrive un metodo efficiente per isolare topo adulto coronarie cellule endoteliali. Il cuore del mouse è sezionato e tritata in piccoli pezzi. Dopo la digestione del cuore utilizzando dispasi e collagenasi II, le cellule vengono lavate e incubate con perline magnetiche che sono coniugate con anticorpi anti-CD31. Le perle con le cellule endoteliali vengono lavati diverse volte e sono pronti per l'uso in varie applicazioni, tra cui l'imaging molecolare e biologica experimenti. Isolamento efficiente produce circa 10 4 cellule per un cuore con oltre il 90% di purezza.
Introduzione
modelli murini di varie malattie cardiovascolari e disturbi metabolici portano cambiamenti fisiologici e molecolari che sono simili a quelli riscontrati in pazienti. Inoltre, l'alterazione genetica dei topi è un potente strumento che ci permette di indagare il ruolo patogenetico di geni specifici nello sviluppo e nella progressione delle malattie. Al giorno d'oggi,-specifica delle cellule di tipo gene-knock-in o topi -out si generino facilmente in molti laboratori e la misurazione di mRNA e livelli di proteine in specifici tipi di cellule è il primo passo per determinare se i topi sono stati veramente geneticamente modificati.
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Protocollo
La ricerca sui topi è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della University of Arizona ed è stata eseguita secondo il National Institute of Health (NIH) le linee guida.
NOTA: Le sezioni 1, 2 e 3 devono essere effettuate il giorno prima l'esperimento come impostazione.
1. Soluzioni Preparazione
- buffer di CD31 (50 ml)
- Aggiungere 50 ml 1 × Tampone fosfato salino (PBS) ad un tubo 50 ml. Pesare 0,05 g albumina sierica bovina (BSA) e 0,037 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e aggiungere al tubo da 50 ml e mettere il tubo di ruotare per circa 1 ora fino a quando si dissolve in polvere. Regolar....
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Risultati
L'isolamento di successo delle cellule endoteliali coronariche da un cuore del mouse si ottiene in genere circa 10 4 cellule con oltre il 90% di purezza con una forma di ciottoli. Per una popolazione pura di cellule endoteliali, si deve usare cautela in tutto il protocollo al fine di garantire un ambiente sterile priva di qualsiasi contaminazione. La comparsa di cellule allungate o allargate cellule all'interno della popolazione indica contaminazione con altri tipi di .......
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Discussione
Le cellule endoteliali più utilizzati nella ricerca sono cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a causa della loro praticità e facilità di coltura. Tuttavia, molte ricerche richiede la disponibilità di un modello fisiologico raggiunto con l'isolamento delle cellule endoteliali da altri organi specifici 10. Le cellule endoteliali formano una popolazione molto minore di cellule nel tessuto cardiaco; il loro isolamento e la coltura grado di dimostrare di essere molto difficile.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione da parte del National Institutes of Health (HL115578 ad A. Makino).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse perline IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Anticorpo CD31 anti-topo per ratto | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispasi (proteasi neutra) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenasi di tipo II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| glicerolo | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Cocktail di inibitori della fosfatasi | Sigma | P0044-1ml | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma | P8340-1 ml | |
| Eparina | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valina | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillina/Streptomicina | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
Riferimenti
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al.
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Ristampe e permessi
