Questo protocollo è preparato per condividere il nostro metodo di isolamento delle cellule endoteliali coronariche di topo a scopo di imaging o per condurre esperimenti di biologia molecolare.
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Articolo metodologico
Questo protocollo è preparato per condividere il nostro metodo di isolamento delle cellule endoteliali coronariche di topo a scopo di imaging o per condurre esperimenti di biologia molecolare.
Le cellule endoteliali linea la parete interna dei vasi sanguigni e svolgono un ruolo importante nella regolazione del tono vascolare, la permeabilità vascolare, e la formazione di nuovi vasi. La disfunzione delle cellule endoteliali è implicato nello sviluppo e nella progressione di molte malattie cardiovascolari, tra cui cardiopatia ischemica. Per esaminare la funzione e caratterizzazione di cellule endoteliali coronariche, isolamento delle cellule è il primo passo e richiede elevata purezza e quantità di condurre esperimenti successivi. Questo protocollo descrive un metodo efficiente per isolare topo adulto coronarie cellule endoteliali. Il cuore del mouse è sezionato e tritata in piccoli pezzi. Dopo la digestione del cuore utilizzando dispasi e collagenasi II, le cellule vengono lavate e incubate con perline magnetiche che sono coniugate con anticorpi anti-CD31. Le perle con le cellule endoteliali vengono lavati diverse volte e sono pronti per l'uso in varie applicazioni, tra cui l'imaging molecolare e biologica experimenti. Isolamento efficiente produce circa 10 4 cellule per un cuore con oltre il 90% di purezza.
modelli murini di varie malattie cardiovascolari e disturbi metabolici portano cambiamenti fisiologici e molecolari che sono simili a quelli riscontrati in pazienti. Inoltre, l'alterazione genetica dei topi è un potente strumento che ci permette di indagare il ruolo patogenetico di geni specifici nello sviluppo e nella progressione delle malattie. Al giorno d'oggi,-specifica delle cellule di tipo gene-knock-in o topi -out si generino facilmente in molti laboratori e la misurazione di mRNA e livelli di proteine in specifici tipi di cellule è il primo passo per determinare se i topi sono stati veramente geneticamente modificati.
Endotelio è un sottile strato singolo di cellule endoteliali (ECS) che riveste la parete vascolare interno. Le cellule endoteliali giocano un ruolo critico nella regolazione della tensione vascolare, la permeabilità vascolare, e la formazione di nuovi vasi 1,2. La disfunzione endoteliale è un segno distintivo di molte condizioni patologiche e cambiamenti nella funzione endoteliale può portare a diverse automalattie cardiovasco- 3,4. È quindi significativo per studiare la funzione delle cellule endoteliali in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.
Ci sono diversi modi per isolare EC 5-8 e il metodo di isolamento deve essere ottimizzato a seconda di quale verranno utilizzati i tessuti e le specie. Questo perché EC da tessuti differenti di un elevato livello di eterogeneità rispetto ai marcatori di superficie e proteica 9. isolamento di successo di cellule endoteliali spesso può essere difficile e richiede un certo grado di formazione e la pratica. Una volta ottenuto, il metodo di isolamento proposto in questo protocollo rivela stabile ed efficiente.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere il mouse coronarica ECS (MCECs) di alta qualità e quantità. Anche se la quantità di cellule raccolte da un cuore è meno di cellule raccolte da altri tessuti mediante altre tecniche, questa tecnica fornisce ancora betqualità ter. La purezza delle cellule endoteliali nella popolazione risultante è superiore al 90%. Così, questa tecnica sarebbe l'ideale per le applicazioni che si basano su cellule endoteliali puramente isolate come l'imaging cellulare.
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La ricerca sui topi è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della University of Arizona ed è stata eseguita secondo il National Institute of Health (NIH) le linee guida.
NOTA: Le sezioni 1, 2 e 3 devono essere effettuate il giorno prima l'esperimento come impostazione.
1. Soluzioni Preparazione
2. Preparare le biglie magnetiche
3. autoclave
4. Soluzioni Preparazione
5. Lavare le perline
6. Dissection
9. Preparazione della coltura cellulare / Imaging
10. Preparazione per Western Blot (WB) Campioni
11. Imaging
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L'isolamento di successo delle cellule endoteliali coronariche da un cuore del mouse si ottiene in genere circa 10 4 cellule con oltre il 90% di purezza con una forma di ciottoli. Per una popolazione pura di cellule endoteliali, si deve usare cautela in tutto il protocollo al fine di garantire un ambiente sterile priva di qualsiasi contaminazione. La comparsa di cellule allungate o allargate cellule all'interno della popolazione indica contaminazione con altri tipi di ...
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Le cellule endoteliali più utilizzati nella ricerca sono cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a causa della loro praticità e facilità di coltura. Tuttavia, molte ricerche richiede la disponibilità di un modello fisiologico raggiunto con l'isolamento delle cellule endoteliali da altri organi specifici 10. Le cellule endoteliali formano una popolazione molto minore di cellule nel tessuto cardiaco; il loro isolamento e la coltura grado di dimostrare di essere molto difficile.
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione da parte del National Institutes of Health (HL115578 ad A. Makino).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse perline IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Anticorpo CD31 anti-topo per ratto | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispasi (proteasi neutra) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenasi di tipo II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| glicerolo | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Cocktail di inibitori della fosfatasi | Sigma | P0044-1ml | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma | P8340-1 ml | |
| Eparina | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valina | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillina/Streptomicina | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
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