L'obiettivo di questo protocollo è valutare la pressione sanguigna sistemica in topi coscienti che si muovono liberamente utilizzando dispositivi di radio-telemetria impiantabili.
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Articolo metodologico
Misurazione della pressione sanguigna a lungo termine in topi liberi di muoversi utilizzando la telemetria
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante lo sviluppo di nuovi agenti vasoattivi, monitoraggio della pressione arteriosa è cruciale per valutare l'efficacia di nuovi farmaci proposti. In effetti, la ricerca incentrata sulla scoperta di nuovi potenziali bersagli terapeutici utilizzando topi geneticamente modificati richiede un giudizio affidabile a lungo termine della variazione di pressione arteriosa sistemica. Attualmente, il gold standard per l'ottenimento di misure a lungo termine della pressione sanguigna nei topi ambulatoriali utilizza impiantabili di radio-trasmettitori, che richiedono incannulamento arteria. Questa tecnica elimina la necessità di legare, immobilizzare o anestetizzare gli animali che introducono stress e manufatti durante il campionamento dei dati. Tuttavia, il monitoraggio della pressione arteriosa nei topi tramite cateterizzazione può essere piuttosto difficile a causa delle ridotte dimensioni delle arterie. Qui vi presentiamo una guida passo-passo per illustrare i passaggi chiave cruciali per un impianto sottocutaneo di successo di radio-trasmettitori e carotide cannulation nei topi. Abbiamo anche esempi di attività di pressione sanguigna a lungo termine presi dai topi liberi di muoversi dopo un periodo di recupero post-operatorio. A seguito di questa procedura consentirà registrazioni della pressione sanguigna diretta affidabili da più animali contemporaneamente.
Introduzione
L'ipertensione è uno dei principali fattori di rischio per le malattie cardiovascolari, senza dubbio si tratta di un grave problema di salute pubblica sia nei paesi sviluppati e in via di sviluppo 1. Diversi modelli animali di ipertensione sperimentale sono stati sviluppati per imitare risposte ipertensive come quelle osservate nell'uomo 2. Tra gli altri, il mouse ambulatoriale rappresenta un ottimo modello per studiare la genesi e la progressione dell'ipertensione permettendo nell'analisi vivo delle conseguenze dell'esposizione cronica a ipertensione.
La pressione sanguigna (BP) monitoraggio nei topi ha aiutato i ricercatori a svelare diversi meccanismi coinvolti nella fisiologia e fisiopatologia delle malattie come l'ipertensione e insufficienza cardiaca 3, 4. Infatti, la manipolazione del genoma del topo permesso generazione di transgenici o modelli gene targeting adatto per studiare l'ipertensione 5, 6. Tuttavia, anche la manipolazione delicatadi topi consapevole induce emozioni che possono potenzialmente introdurre artefatti durante l'acquisizione dei dati, mentre l'uso di sedazione o tranquillanti profondamente influenzare la pressione sanguigna 7. Questi aspetti sono particolarmente importanti e devono essere presi in considerazione quando si tenta di monitoraggio a lungo termine BP.
Ci sono diversi modi per registrare BP nei topi, e un confronto tra le tecniche più comuni attualmente disponibili sono stati discussi altrove 8, 9. Tuttavia, le raccomandazioni AHA per la misurazione BP concluso che la misurazione endoarteriosa di BP sono generalmente preferiti per la loro capacità di misurare direttamente BP per un periodo prolungato di tempo 10. Radio-telemetria accoppiato con la misura diretta della pressione arteriosa è il metodo di state-of-the-art per il monitoraggio delle funzioni fisiologiche in sveglio e liberi di muoversi animali da laboratorio, riducendo al minimo lo stress e manufatti per l'ambiente associati 9, 11.Radio-telemetria offre la possibilità di raccogliere automaticamente la pressione arteriosa, frequenza cardiaca, la temperatura corporea e l'attività degli animali provenienti da animali coscienti multipli.
Anche se questa metodologia sta diventando molto popolare in molti laboratori, radio-telemetria impianto in topi può essere tecnicamente impegnativo. Qui mostriamo un protocollo passo-passo che illustra come impiantare un trasduttore di pressione nei topi. La tecnica prevede l'inserimento sottocutaneo della sonda nel corpo del mouse, incanalare il catetere al collo e in avanti vicino all'arco aortico attraverso l'arteria carotide sinistra. dati in remoto catturati vengono trasmesse in diretta sul monitor del computer. I dati sono memorizzati anche per l'analisi "off-line".
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Protocollo
Etica dichiarazione: Tutte le procedure origine animale di cui in questo video-articolo è stato esaminato e approvato dal Comitato di cura e l'uso di animali (IACUC) presso l'Università del Tennessee Health Science Center.
Nota: utilizzare gli strumenti di microchirurgia sterili durante tutta la procedura chirurgica. Gli strumenti chirurgici possono essere sterilizzati utilizzando uno sterilizzatore infrarossa ad una temperatura ottimale di sterilizzazione 1.500 ° F (815,6 ° C). Telemetri possono essere riutilizzati, tuttavia, prima di inserirla nell'animale assicurarsi di sterilizzare l'intero trasmettitore secondo le istruzioni del produttore e che la punta del catetere è stata riempita con un gel speciale fornito dal produttore.
1. Gli animali sperimentali
- Ottenere l'approvazione IACUC per tutti gli esperimenti che verranno eseguite. La consultazione con IACUC istituzionale è altamente raccomandato per quanto riguarda i requisiti per l'uso di analgesici post-operatorio dopo questa procedura.
- Tenere gli animali in ccamere limate controllata aventi una temperatura ambiente di 21 ° C, 60% umidità relativa, e un ciclo luce-buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
Nota: Perché il corpo del mouse deve accogliere la sonda telemetria (approssimativamente 1 cm di diametro x 2 cm di lunghezza), è preferibile utilizzare i topi che pesano 20 grammi.
2. Anestesia e preparazione Operativo
- Pesare il mouse usando una bilancia di precisione e registrare il suo peso. Assicurati di gestire l'animale dolcemente e silenziosamente.
- Posto l'animale nella camera di induzione e chiuderlo. Impostare la velocità del flusso di ossigeno a 0,5 L / min e impostare la concentrazione isoflurano al 4-5%.
- Quando il mouse perde conoscenza, metterlo su un piatto corpo riscaldamento mantenuto a 36-37 ° C. Mantenere l'anestesia tramite nosecone con set isoflurano al 2% (tenere a portata di 0,5 l / min).
- Preparare le regioni di funzionamento rimuovendo i capelli dalla parte posteriore del collo e tegli faccia ventrale del collo mediante l'applicazione di crema depilatoria.
- Trattare il sito di incisione con 3 applicazioni di lavaggio chirurgico (soluzione betadine) in alternanza con il 70% di alcol isopropilico.
3. Chirurgia
- Posizionare il mouse in posizione supina. Verificare la presenza di riflessi pizzicare il piede, e regolare l'anestesia fino a quando non vi è alcuna risposta. Effettuare un approssimativamente 1 cm incisione mediana sotto il collo del mouse con un bisturi. Nel lato sinistro del taglio creare uno spazio sottocutaneo separando accuratamente la pelle dal tessuto connettivo sottostante.
- Capovolgere il mouse, e utilizzare un bisturi per fare una incisione cutanea di circa 1,5 cm di lato dorsale sinistro dietro la scapola. Creare una tasca sottocutanea lungo il fianco dell'animale sufficientemente grande per il dispositivo. Inserire il trasmettitore nella tasca.
- Inserire un piccolo pinza emostatica nell'incisione posteriore e manovrarlo sottocutanea verso la parte anterioreapertura del collo. Utilizzando la fascetta inserita-emostatico, prenda delicatamente un tubo in polietilene atossico (4 cm Lunghezza x 1 mm ID).
- Tirare il hemostat indietro attraverso il tunnel l'incisione laterale nella parte posteriore finché il tubo sporge da entrambi addominale e dorsale incisione, rilasciare il tubo dal emostatico. Dalla parte posteriore, inserire il sensore catetere nel tubo per tunnel la punta del catetere di rilevamento della pressione attraverso il collo. Dalla anteriore del collo, tirare e rimuovere il tubo in polietilene e chiudere l'incisione dorsale mediante clip metalliche.
- separare con cura le ghiandole mandibolari utilizzando applicatori di punta di cotone sterile e ritrarre la ghiandola mandibolare sinistra utilizzando un gancio elastico soggiorno. Utilizzando pinze curve punta fine, individuare la carotide lungo il lato sinistro della trachea. Mantenere il sito chirurgico sterile, mettendo e garantire un telino sterile.
- isolare con cura il recipiente dal tessuto circostante e delicatamente separare lanervo vago (colore biancastro) che si trova lungo l'arteria carotide lontano dalla arteria. Fare attenzione a non tagliare o danneggiare il nervo o l'arteria.
- Passare tre pezzi di non assorbibile 7-0 sutura sotto la sezione carotide isolato. Legare la sutura cranica per chiudere il flusso di sangue. Estrarre la sutura che è più vicino allo sterno per occludere temporaneamente il flusso di sangue dall'aorta.
- Fare un nodo sciolto utilizzando la sutura centrale. Questo verrà utilizzato per fissare il catetere nel vaso. Tagliare una piccola incisione nell'arteria tra il cranio e le suture sternale con micro-forbici.
- Afferra il catetere con una pinza speciale nave incannulamento, facendo attenzione a non comprimere il catetere per prevenire la perdita di gel dalla sonda. Delicatamente, afferrare l'arteria con una pinzetta punta fine curvo pinze, recuperare il catetere, e inserirla nel vaso attraverso la piccola incisione.
- Stringere il nodo di sutura intorno all'arteria centrale e far avanzare con delicatezza il gattoheter. rilasciare delicatamente la sutura che è prossimale allo sterno e continuare ad avanzare il catetere verso l'aorta trasversale.
- Osservare il contrassegno sul catetere che fornisce un indice approssimativa di quanto il catetere deve essere inserito. Una volta che il punto è raggiunto, delicatamente stringere sia inferiore e la sutura superiore intorno al catetere. Il catetere è fissato alla carotide dai nodi di sutura.
- Chiudere l'incisione cutanea con non assorbibile 5-0 di sutura. Una volta chiusa, sigillare l'incisione con tessuto adesivo.
4. chirurgico di recupero e BP Misure
- Monitorare animali da vicino per il ritorno di posture normali e comportamenti. Durante il periodo post-operatorio amministrare analgesia 24 ore come indicato da un veterinario del personale.
- Una volta che gli animali hanno recuperato (5 - 7 giorni dopo l'intervento), li alloggiare individualmente in una gabbia regolare del mouse posizionato sulla parte superiore della piastra ricevitore di telemetria.
- Ruotare il TR impiantatoansmitters "on" e "off" utilizzando un dispositivo magnetico posizionati brevemente vicino all'animale dall'esterno della gabbia.
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Risultati
I dati possono essere acquisiti in remoto da un ricevitore; tracce vengono visualizzate su uno schermo di computer per il controllo di qualità (Figura 1a). Dettagli come ID animale, pressione diastolica e pressione arteriosa sistolica sono indicate anche (Figura 1b). Arteriosa BP può essere registrata in continuo (24/7), o per brevi intervalli programmati (ad esempio, 60 sec acquisizione ogni ora). I dati possono essere memorizzati automaticamen...
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Discussione
Impiantabile radio-telemetria è migliorata significativamente negli ultimi dieci anni; dimensioni più piccole della sonda rende l'impianto meno traumatica per l'animale, la durata della batteria prolungata aiuta a ridurre i costi, e le frequenze telemetro indipendenti eliminare le interferenze tra i ricevitori. Telemetria è considerato il metodo allo stato dell'arte per la raccolta di una vasta gamma di parametri fisiologici da animali liberi di muoversi senza artefatti dovuti all'uso di contenzione, int...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH/NHLBI) [Grant no. HL114869] e il supporto da UTHSC a SM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema per anestesia per piccoli animali | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | sistema per anestesia per piccoli animali a basso flusso | |
| Scaldapad e termometro per topi | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | consente il monitoraggio della temperatura corporea e il controllo omeotermico nei piccoli animali | |
| Microscopio binoculare | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | Corpo binoculare KSCXTS-1121 | con asta del supporto a braccio e |
| pinze emostatice | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | utilizzato per bloccare i vasi sanguigni o etichettare le suture |
| Piccole clip metalliche, 7 mm, acciaio inossidabile | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | utilizzato per la chiusura della pelle |
| Soluzione di betadina | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | Soluzione topica di iodio povidone al 10% |
| Soluzione salina normale | Abott Laboratories | 04930-04-10 | necessaria per prevenire l'essiccazione dei tessuti. |
| Nair (lozione depilatoria) | necessario per la rimozione della pelliccia dal sito di incisione / chirurgia | ||
| Sutura di seta treccia | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Taglia 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Etanolo | 2716 | 70% etanolo per la disinfezione | |
| Forbici a molla | Strumento Fine Science | 15000-10 | per dissezione minore |
| Forbici (angolate lateralmente) | Strumento Fine Science | 14063-011 | Manico n. 3 Lama |
| bisturi | 2976-0 | N. 10 | |
| Pinze (curve) | Strumento Fine Science | 11150-10 | per trattenere i tessuti |
| Pinze (diritte) | Strumento Fine Science | 11151-10 | per trattenere i tessuti |
| Porta aghi | Strumento di scienza fine | 12002-12 | per sutura |
| Naso ad ago sottile Pinze | Strumento | ||
| Isoflurano | Henry Schein Salute animale, Melville, New York, Stati Uniti | un agente anestetico per inalazione generale | |
| Sterilizzatore | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilizzare gli strumenti chirurgici in 5-10 secondi utilizzando il riscaldamento a infrarossi |
| Garze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | da utilizzare per la pulizia, la preparazione, lo sfregamento o la medicazione delle ferite Dispositivo di |
| telemetria | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | per registrare la pressione sanguigna nei mouse che si muovono liberamente Sistema |
| di ricezione della telemetria accartocciato con un PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Pinze per incannulamento dei vasi, 13 cm, 0,5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | speciali pinze per incannulamento dei vasi |
| Adesivo per tessuti | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | utilizzare per chiudere piccole ferite, spesso eliminando la necessità di suture e/o bende |
| Bilancia analitica da laboratorio di precisione | BB300 |
Riferimenti
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- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. Models of experimental hypertension in mice. Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al. Arterial Pressure Monitoring in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 105-122 (2011).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
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Ristampe e permessi
