Generazione di marcato e markerless Mutanti nel modello di cianobatteri Specie

Summary

L'introduzione di molteplici alterazioni genomiche nei cianobatteri è uno strumento essenziale nello sviluppo di ceppi per scopi industriali e di ricerca di base. Descriviamo un sistema per la generazione di mutanti non marcati nella specie cianobatterica modello Synechocystis sp. PCC6803 e mutanti marcati in Synechococcus sp. PCC7002.

Abstract

I cianobatteri sono organismi ecologicamente importanti e potenziali piattaforme per la produzione di biocarburanti e prodotti industriali utili. La manipolazione genetica dei cianobatteri, in particolare di organismi modello come Synechocystis sp. PCC6803 e Synechococcus sp. PCC7002, è uno strumento chiave sia per la ricerca di base che per quella applicata. La generazione di mutanti non marcati, in cui le alterazioni cromosomiche vengono introdotte in un ceppo tramite l'inserimento di una cassetta di resistenza agli antibiotici (un frammento di DNA manipolabile contenente uno o più geni), seguita dalla successiva rimozione di questa cassetta utilizzando un marcatore selezionabile negativo, è una tecnica particolarmente potente. I mutanti non marcati possono essere manipolati geneticamente ripetutamente, consentendo l'introduzione di tutte le alterazioni desiderate in un ceppo. Inoltre, l'assenza di geni che codificano proteine di resistenza agli antibiotici nel ceppo mutato è auspicabile, in quanto evita la possibilità di "fuga" di organismi resistenti agli antibiotici nell'ambiente. Tuttavia, i metodi dettagliati per cicli ripetuti di manipolazione genetica dei cianobatteri non sono ben descritti nella letteratura scientifica. Qui forniamo una descrizione completa di questa tecnica, che abbiamo utilizzato con successo per generare mutanti con delezioni multiple, mutazioni puntiformi singole all'interno di un gene di interesse e inserimento di nuove cassette geniche.

Introduction

I cianobatteri sono un phylum evolutivamente antica e diversificata di batteri che si trovano in quasi tutti gli ambienti naturali della Terra. Negli ecosistemi marini sono particolarmente abbondanti e svolgono un ruolo chiave in molti cicli degli elementi nutritivi, che rappresentano circa la metà di fissazione del carbonio ^1, la maggior parte dell'azoto fissazione ² e centinaia di milioni di tonnellate di produzione di idrocarburi ³ negli oceani ogni anno. Cloroplasti, l'organello responsabile per la fotosintesi delle alghe e delle piante eucariotiche, è probabile che si sono evoluti da un cianobatterio che è stato inghiotti....

Protocol

1. Preparazione della cultura dei media

1. Preparare medio BG11 secondo le Castenholz 1988 ^17.
   1. Preparare soluzioni di BG11 100x, elementi e ferro stock (tabella 1) tracciare.
   2. Preparare soluzioni separate di azioni di fosfato, Na ₂ CO ₃ stock, N - [Tris (idrossimetil) metil] -2-aminoethanesulfonic (TES) tampone e NaHCO ₃ (Tabella 1).
   3. Autoclave il fosfato e Na ₂ CO ₃ scorte. Filtro-sterilizzare TES buffer e NaHCO ₃ con 0,2 micron filtri.
   4. Preparare BG11 combinando 976 ml di acqua, 10 ml di 100x BG11, 1 ml ....

Results

Disegno plasmide è fondamentale per la generazione di successo di entrambi i mutanti marcati e non marcati. Figura 1 è riportato un esempio di plasmide A e B utilizzato per generare una delezione mutanti nei geni Synechocystis cpcC1 e cpcC2 ^13. In ogni caso le 5 'e 3' regioni fiancheggianti sono circa 900-1.000 bp. regioni fiancheggianti ridotti possono essere utilizzati anche se la più piccola che abbiamo trialed successo è stato di.......

Discussion

I passi più critici nella generazione di mutanti non contrassegnate sono: 1) un'attenta progettazione plasmide per garantire solo la regione di destinazione è alterata; 2) garantire che i campioni rimangano axeniche, soprattutto quando coltivate su saccarosio; 3) placcatura cellule per la generazione di mutanti marcati trasformato inizialmente su piastre di agar BG11 privi antibiotici, seguita da aggiunta di agar più antibiotici 24 ore successive; 4) la coltura segnato mutanti per 4 giorni interi prima di placcatura.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	Sigma	230391
CaCl2	Sigma	C1016
citrico	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	Sigma	331058
CuSO4.5H2O	Sigma	209198
Co(NO3)2.6H2O	Sigma	239267
Citrato di ammonio ferrico	Sigma	F5879
K2HPO4	Sigma	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
cianocobalamina	Sigma	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Sucrose	Fisher	SUC001
Piastra Petri 90 mm Greiner a tripla ventilazione		633185
0,2 &; m filtri	Sartorius	16534
Palloni conici da 100 ml	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38  m	Bemis	FIL003
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	DNA Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
	MoBio	12100-300
Endonucleasi di restrizione	NEB
T4 ligasi	Thermo Scientific	EL0011
Luria Bertani brodo	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamicina solfato	Sigma	60615
Ampicillina	Sigma	A9518
Kit miniprep plasmidico GeneJET	Thermo Scientific	K0503
Tubo a fondo tondo da 14 ml	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polimerasi	Promega	M7805
425-600 &; m perle di vetro	Sigma	G8772
Glicerolo	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Lampadine fluorescenti	Gro-Lux	69
HT multitron fotobioreattore	Infors