La fibrosi sostenuta con deposizione di proteine della matrice extracellulare eccessive porta alla cirrosi. L'abuso di alcol è una delle principali cause di gravi malattie del fegato. Abbiamo stabilito un modello di fegato fibrotico di zebrafish indotto da etanolo per studiare i meccanismi e le strategie di promozione della rigenerazione degli epatociti in seguito a danno indotto dall'alcol.
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Articolo metodologico
Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrosi epatica sostenuta con continuazione dell'accumulo di proteina della matrice extracellulare (ECM) provoca la perdita della competenza cellulare del fegato, portando alla cirrosi con disfunzione epatocellulare. Tra i molteplici insulti epatici, l'abuso di alcol può portare a significativi problemi di salute tra cui insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare. Tuttavia, l'identità delle fonti cellulari endogene che rigenerano gli epatociti in risposta all'alcol non è stata adeguatamente studiata. Inoltre, pochi studi hanno modellato efficacemente la rigenerazione degli epatociti sul danno indotto dall'alcol. Recentemente abbiamo riportato la creazione di un modello di fegato fibrotico indotto da etanolo (EtOH) in zebrafish in cui le cellule progenitrici epatiche (HPC) hanno dato origine a epatociti in seguito a perdita quasi completa di epatociti in presenza di stimolo fibrogenico. Inoltre, attraverso screening chimici che utilizzano questo modello, abbiamo identificato diverse piccole molecole che migliorano la rigenerazione degli epatociti. Qui descriviamo in dettaglio le procedure per sviluppare un modello di fegato fibrotico indotto da EtOH e per eseguire screening chimici utilizzando questo modello nel pesce zebra. Questo protocollo sarà uno strumento fondamentale per delineare i meccanismi molecolari e cellulari di come gli epatociti si rigenerano nel fegato fibrotico. Inoltre, questi metodi faciliteranno la potenziale scoperta di nuove strategie terapeutiche per la malattia epatica cronica in vivo.
Introduzione
Nonostante la notevole capacità di rigenerazione degli epatociti 1, che sono il principale tipo di cellule parenchimali del fegato, insufficienza epatica cronica altera questa capacità, portando a cellule progenitrici epatiche (HPC) -dipendente rigenerazione 2.
Danni al fegato cronica è derivato principalmente da abuso di alcool, cronica da virus dell'epatite C (HCV) 3 e steatosi epatica non alcolica (NAFLD) 4. Si porta a fibrosi epatica sostenuta, che è associato con l'accumulo di matrice extracellulare (ECM) proteine. Accumulo ECM Persistendo distorce architettura epatica intatta forma....
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Protocollo
Zebrafish sono state sollevate e cresciuto utilizzando un protocollo standard che soddisfa i criteri del National Institutes of Health e approvati dal Georgia Institute of Technology Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.
1. preparazione di soluzioni
- Preparare acqua uovo 20 L (intercambiabile usato con 'media embrione') per mantenere embrionale zebrafish / larvale. Sciogliere 1,5 g CaSO 4 e 6 g oceano istante sale marino in 250 ml di acqua distillata. Versare in una damigiana piena di 20 L di acqua distillata e agitare.
- Preparare 1 L soluzione di 1-fenil-2-tiourea (PTU) stock (20x). Sciogliere 0,6 g di pol....
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Risultati
La figura 1 mostra lo sviluppo di un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish larvale. Per ottimizzare un protocollo per esporre le larve zebrafish di EtOH, in primo luogo abbiamo valutato la tossicità EtOH. 2,5 giorni post-fecondazione (DPF) larve sono stati esposti a concentrazioni EtOH 1%, 1,5%, o del 2% per 24 ore seguita da una 24 ore EtOH trattamento concomitante / MTZ. L'esposizione al 2% EtOH causato alto tasso di mortalità, mentre quasi tutte le.......
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Discussione
Abbiamo osservato rigenerazione degli epatociti HPC-mediata nel fegato recupero EtOH / MTZ-trattati, suggerendo che anche in presenza di notevoli quantità di proteine ECM compresi tipo fibrillare collagene, i HPCs conservano la loro competenza per rigenerare come epatociti. L'unico MTZ-trattamento non ha aumentato la deposizione di proteine ECM in modo significativo, mentre il EtOH unico trattamento non ha indotto attivazione HPC 15. Utilizzando il trattamento EtOH / MTZ combinato, siamo stati in grad.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal GTEC (2.731.336 e 1.411.318), il NIH (K01DK081351), e la NSF (1.354.837) per CHS Ringraziamo Alem Giorgis per la lettura critica del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Solfato di calcio emiidrato (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| Acido 1,4-piperazinediethanesulfonico (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)- N,N,N′,N′ Acido -tetraacetico (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldeide | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazolo (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-fenil-2-tiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amminoacido benzoico estere etilico (Tricaina) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Compressa di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Amresco | E404 | Sciogliere una compressa con 100 ml di acqua distillata |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Albumina sierica bovina | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Bassopunto di fusione agarosio | Amresco | BP165 | |
| Libreria di composti di segnalazione con cellule staminali | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Libreria | Timtec | ActiProbe-1K | 10 Azioni mM in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolvere con DMSO a 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolvere con DMSO a 10 |
| mM Anti-Collagene I anticorpo | Abcam | ab23730 | Utilizzare in scala 1:100 per l'immunocolorazione, reagisce con il pesce |
| AlexaFluor 647 Asino IgG anti-coniglio (H+L) | Sonde molecolari | A31573 | Da utilizzare in scala 1:200 per l'immunocolorazione |
| Mezzi di montaggio (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Piastra di Petri da 100 mm | VWR | 25384-088 | |
| a 24 pozzetti piastra | VWR | 10062-896 | |
| Pinze | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Vetrino VWR | 48312-003 | 75x25 mm | |
| Vetro di copertura | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Involucro di plastica | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Foglio di alluminio | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotomo | Leica | VT1000 S | |
| Stereomicroscopio | Leica | M80 | |
| Microscopio per epifluorescenza | Leica | M205 FA | |
| Microscopio Confocol | Zeiss | LSM700 |
Riferimenti
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
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Ristampe e permessi
