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Articolo metodologico

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

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DOI:

10.3791/54002

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13 maggio 2016

 ,  , 
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

La fibrosi sostenuta con deposizione di proteine della matrice extracellulare eccessive porta alla cirrosi. L'abuso di alcol è una delle principali cause di gravi malattie del fegato. Abbiamo stabilito un modello di fegato fibrotico di zebrafish indotto da etanolo per studiare i meccanismi e le strategie di promozione della rigenerazione degli epatociti in seguito a danno indotto dall'alcol.

Abstract

La fibrosi epatica sostenuta con continuazione dell'accumulo di proteina della matrice extracellulare (ECM) provoca la perdita della competenza cellulare del fegato, portando alla cirrosi con disfunzione epatocellulare. Tra i molteplici insulti epatici, l'abuso di alcol può portare a significativi problemi di salute tra cui insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare. Tuttavia, l'identità delle fonti cellulari endogene che rigenerano gli epatociti in risposta all'alcol non è stata adeguatamente studiata. Inoltre, pochi studi hanno modellato efficacemente la rigenerazione degli epatociti sul danno indotto dall'alcol. Recentemente abbiamo riportato la creazione di un modello di fegato fibrotico indotto da etanolo (EtOH) in zebrafish in cui le cellule progenitrici epatiche (HPC) hanno dato origine a epatociti in seguito a perdita quasi completa di epatociti in presenza di stimolo fibrogenico. Inoltre, attraverso screening chimici che utilizzano questo modello, abbiamo identificato diverse piccole molecole che migliorano la rigenerazione degli epatociti. Qui descriviamo in dettaglio le procedure per sviluppare un modello di fegato fibrotico indotto da EtOH e per eseguire screening chimici utilizzando questo modello nel pesce zebra. Questo protocollo sarà uno strumento fondamentale per delineare i meccanismi molecolari e cellulari di come gli epatociti si rigenerano nel fegato fibrotico. Inoltre, questi metodi faciliteranno la potenziale scoperta di nuove strategie terapeutiche per la malattia epatica cronica in vivo.

Introduzione

Nonostante la notevole capacità di rigenerazione degli epatociti 1, che sono il principale tipo di cellule parenchimali del fegato, insufficienza epatica cronica altera questa capacità, portando a cellule progenitrici epatiche (HPC) -dipendente rigenerazione 2.

Danni al fegato cronica è derivato principalmente da abuso di alcool, cronica da virus dell'epatite C (HCV) 3 e steatosi epatica non alcolica (NAFLD) 4. Si porta a fibrosi epatica sostenuta, che è associato con l'accumulo di matrice extracellulare (ECM) proteine. Accumulo ECM Persistendo distorce architettura epatica intatta formando un tessuto cicatriziale fibroso 5, successivamente, con conseguente cirrosi con alta morbilità e mortalità. Molti tentativi sono stati fatti per mitigare la risposta fibrotica soprattutto concentrandosi su inibendo citochine profibrogenic e miofibroblasti attivati ​​6. Quest'ultimo deriva principalmente dalle cellule stellate epatiche (HSC), le cellule non parenchimali epatiche principali responsabili della formazione della cicatrice fegato 4. Tuttavia, terapie rigenerative che stimolano fonti endogene cellulari tra cui HPC per rigenerare epatociti in presenza di insulti fibrogeniche sostenuti attendono ulteriori indagini.

Molti modelli sperimentali di fibrosi epatica sono stati descritti nei mammiferi. Iniezione ripetitiva di tetracloruro di carbonio (CCL 4) è stato ampiamente utilizzato per indurre la fibrosi epatica in murine e ratto modelli 7. In combinazione con una dieta ad alto contenuto di grassi (HF), l'alcol ha portato ad una sostanziale upregulation dell'espressione genica profibrogenic e fibrosi epatica 8. Mentre steatosi (accumulo di lipidi) risulta dall'esposizione alcol acuta, rende il fegato suscettibile di più grave danno epatico 9.

Il zebrafish, Danio rerio, è emerso come un prezioso sistema modello per lo studio dei vertebrati la rigenerazione. Anche sealtri vertebrati inferiori, come tritoni e Axolotl hanno una notevole capacità di rigenerazione, il pesce zebra ha vantaggi rispetto ad altri sistemi modello per quanto riguarda la manipolazione genetica e la visualizzazione strategie necessarie per manipolare i fattori di potenziale rigenerativo 10. Il pesce zebra rappresenta anche un modello vertebrato interessante per lo studio della malattia epatica alcolica (ALD) con la semplice aggiunta di etanolo (EtOH) per la loro acqua. L'esposizione acuta EtOH di zebrafish larvale e adulto causato steatosi epatica 11-13. Quando zebrafish adulto ha ricevuto l'esposizione prolungata EtOH, deposizione di collagene è stata osservata con up-regulation dei geni fibrosi correlati 14. Tuttavia, esiste la necessità di sviluppare modelli per studiare rigenerazione epatica in risposta ad EtOH come stimolo fibrogenico.

Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish 15. Abbiamo combinato un sistema di ablazione genetica specifica-epatociti con il trattamento EtOH in larvale e Adult zebrafish. Abbiamo generato due linee transgeniche, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 e Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, in cui E.coli nitroreduttasi (NTR) si fondono al ciano e proteina fluorescente mCherry, rispettivamente sotto il controllo dell'acido grasso specifico epatociti legame 10a proteine, fegato base (fabp10a) promotore. In questo sistema, NTR converte un metronidazolo profarmaco non tossico (MTZ) in un DNA inter-strand reticolante 16, inducendo la morte esplicita di epatociti. Utilizzando questo modello, abbiamo dimostrato che una popolazione di cellule epatiche, che sono sensibili alle segnalazione Notch, convertito in epatociti nella quasi totale assenza di epatociti e l'eccesso di ECM. Designiamo queste cellule come HPC. Inoltre, attraverso schermi chimici, abbiamo identificato piccoli attivatori molecola di segnalazione Wnt e inibitori di Notch che aumentano la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico. therefori, il nostro modello di fegato fibrotico in zebrafish rappresenta un eccellente sistema di screening chimico rispetto alla cultura- cellulare o sistema di screening dei mammiferi-based. Si tratta di un sistema in vivo con in termini di costi e benefici significativi di risparmio di tempo. Qui si descrivono le procedure dettagliate per la creazione di un modello di fegato fibrotico EtOH-indotta e per l'esecuzione di schermi chimici che utilizzano questo modello in zebrafish. Inoltre, le analisi tempo-corso sono stati effettuati per studiare come epatociti rigenerazione avviene nel fegato fibrotico. Questo protocollo fornirà uno strumento prezioso per studiare i meccanismi e le strategie per potenziare la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico.

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Protocollo

Zebrafish sono state sollevate e cresciuto utilizzando un protocollo standard che soddisfa i criteri del National Institutes of Health e approvati dal Georgia Institute of Technology Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.

1. preparazione di soluzioni

  1. Preparare acqua uovo 20 L (intercambiabile usato con 'media embrione') per mantenere embrionale zebrafish / larvale. Sciogliere 1,5 g CaSO 4 e 6 g oceano istante sale marino in 250 ml di acqua distillata. Versare in una damigiana piena di 20 L di acqua distillata e agitare.
  2. Preparare 1 L soluzione di 1-fenil-2-tiourea (PTU) stock (20x). Sciogliere 0,6 g di polvere in 1 PTU acqua distillata L. Aggiungere 1 ml di soluzione madre per 20 ml di mezzo embrione ad una concentrazione finale di 0,003% in una soluzione di lavoro.
    ATTENZIONE: PTU può causare tossicità sistemica a seguito di inalazione o l'esposizione cutanea. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate.
  3. Preparare 1 L etil 3-aminobenzoate soluzione madre metanosolfonato (Tricaine) (20x). Sciogliere 4 g di polvere Tricaine in acqua distillata. Aggiustare il pH a 7 con l'aggiunta di 1 M Tris (pH 9), e portare il volume finale a 1 L con acqua distillata. Aliquota in 50 ml e conservare a -20 ° C. Scongelare prima dell'uso.
    ATTENZIONE: Tricaine può indurre una perdita di sensibilità. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate.
  4. Preparare 100 larvale metronidazolo (MTZ) soluzione di lavoro ml. Fare fresco 15 mM soluzione MTZ sciogliendo 0,25 g di polvere MTZ nello 0,1% dimetilsolfossido (DMSO) in 100 ml di mezzo embrione. Sciogliere MTZ polvere completamente di agitazione vigorosa. Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica di MTZ.
    ATTENZIONE: MTZ può causare irritazione. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate.
  5. Preparare 100 ml di soluzione di lavoro larvale etanolo / metronidazolo (EtOH / MTZ). Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare fotocatalitico degradazione di MTZ. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 100% in 100 ml di soluzione MTZ ad una concentrazione finale di 1,5% al ​​momento dell'uso.
  6. Preparare 500 ml di soluzione di lavoro degli adulti MTZ. Fare fresco 10 mM soluzione MTZ sciogliendo 0,83 g di polvere MTZ nello 0,1% DMSO in 500 ml di acqua del sistema. Sciogliere MTZ polvere completamente di agitazione vigorosa. Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica di MTZ.
  7. Preparare 1 L PEM tampone. Sciogliere 30.2 g TUBI, 0,74 g EGTA, e 0,12 g MgSO 4 in acqua distillata. Regolare il pH a 7 con NaOH. Portare il volume finale a 1 L con acqua distillata.

2. Preparazione di larve Zebrafish

  1. Impostare l'accoppiamento di [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulto con Tg (hand2: EGFP) PD24 13 zebrafish adulto in serbatoi di accoppiamento. Utilizzare divisori per condurre l'accoppiamento a tempo.
  2. Rimuovere il divider la mattina seguente e permettono di pesce per accoppiarsi senza interruzioni. embrioni Harvest 2 ore più tardi da sforzare l'acqua del sistema e trasferire gli embrioni in 100 mm piastre di Petri con terreno di embrione.
  3. Mantenere non più di 100 embrioni per piastra di Petri. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere uova non fecondate utilizzando una pipetta di vetro. Crescere embrioni a 28 ° C e aggiungere feniltiourea (PTU) ad una concentrazione finale di 0,003% dopo 10 ore di post-fecondazione (HPF) per inibire lo sviluppo del pigmento.

3. L'etanolo, Trattamento metronidazolo e fegato Rigenerazione in larvali Zebrafish

  1. Preparare la soluzione EtOH fresca aggiungendo etanolo in un mezzo embrione ad una concentrazione finale di 1,5%. Non aggiungere PTU.
  2. Trattare embrioni con 20 ml di soluzione di etanolo per ogni capsula di Petri 56-80 HPF. Coprire piastre di Petri con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione di etanolo.
  3. Classificare [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] larve con dimensioni del fegato simile, come determinato da espressione CFP, a 80 HPF. Non utilizzare Tricaine durante l'ordinamento le larve EtOH-trattati, perché questo farà sì alto tasso di mortalità, con successivo trattamento EtOH / MTZ. Mantenere le larve ordinato con una densità di 30 embrioni per piastra di Petri.
  4. Preparare fresco 15 mm MTZ nel medio embrione nello 0,1% DMSO. Aggiungere corretta quantità di EtOH in soluzione MTZ fare una concentrazione finale di 1,5%. Incubare le larve in 20 ml di soluzione EtOH / MTZ per capsula di Petri per 24 ore a 28 ° C. Coprire piastre di Petri con involucro di plastica per mantenere la concentrazione EtOH e con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
  5. Alla fine del trattamento, rimuovere la soluzione EtOH / MTZ trasferendo larve di nuove piastre Petri con terreno fresco embrione. Lavare le larve 3 volte con media embrione e tenerli in 20 ml di mezzo embrione senza PTU.
  6. Per risolvere le larve con quasi completa ablazione della epatociti, osservare la fluorescenzasotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro PCP con un ingrandimento di 80X. risultati ablazione di successo in minima fluorescenza PCP nel fegato e volume del fegato significativamente ridotto.
  7. Per evitare la morte delle larve EtOH / MTZ-trattati, non utilizzare Tricaine per l'ordinamento. Fissare le larve per immunocolorazione (vedere la sezione 5) o tenere larve ordinati in piastre di Petri a 28 ° C per ulteriori analisi.

4. Schermi chimici in EtOH / MTZ-trattati larvale Zebrafish

  1. Portare le piastre a 96 pozzetti contenenti 10 mM scorte chimiche in DMSO (consultare l'elenco dei materiali per i dettagli delle librerie chimiche commerciali) dal -80 ° C freezer. Coprire con un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica dei prodotti chimici. Scongelare soluzioni madre a temperatura ambiente con dolce dondolio.
  2. Preparare soluzioni chimiche diluendo 10 soluzioni madri mm con medio embrione ad una concentrazione finale di 50 micron (in 96 pozzetti: s inizialicreen; in provette da 1,5 ml: nuovo test). larve di controllo sono stati trattati con uguali concentrazioni di DMSO in media embrione.
  3. Trasferimento larve con quasi completa ablazione epatociti, che sono stati trattati con 1,5% EtOH / 15 mm MTZ e allineati secondo quanto sopra indicato, a uno a 96 pozzetti (schermata iniziale) o 24 pozzetti (ripetere il test) piastre preriempite con media embrione ad una densità di 5 larve per bene. Utilizzare pozzetti in duplicato per ogni sostanza chimica.
  4. Rimuovere media embrione e aggiungere o 250 ml (piastre a 96 pozzetti) o 500 ml (24 pozzetti) soluzioni chimiche in ciascun pozzetto. piastre di copertura con un foglio di alluminio e trattare le larve per 50 ore a 28 ° C. Ispezionare larve chimico-immersione quotidiana e rimuovere eventuali larve morte da singoli pozzi.
  5. Alla fine del trattamento chimico, osservare il numero e / o intensità di epatociti CFP-esprimono sotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro PCP con un ingrandimento di 80X. Fotografia dal vivo che mostra larve migliorata o ridurreil numero d e / o intensità di epatociti PCP che esprimono con una macchina fotografica digitale per i record.
  6. Conserva le larve da formaldeide fissazione per l'imaging confocale come descritto nella sezione 5.
  7. Per testare nuovamente i prodotti chimici che facilitano la rigenerazione degli epatociti nella schermata iniziale, esaminare la loro efficacia a concentrazioni superiori e inferiori per trovare la concentrazione più efficace con le procedure descritte nel 4,1-4,5 ( 'nuovo test').

5. larvale Zebrafish Fixation, Immunocolorazione, e confocale Imaging

  1. Anestetizzare larve aggiungendo Tricaine ad una concentrazione finale di 0,02%. Trasferire 10-15 larve in una provetta da 1,5 ml e lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di preparati al momento 2% di formaldeide in tampone PEM di risolvere O / N a 4 ° C.
    ATTENZIONE: La formaldeide provoca irritazione ed è noto per essere cancerogeno per l'uomo. Maneggiare in una cappa.
  2. Scartare il fissaggio soluzione correttamente e poi wash 3 volte con PBS a temperatura ambiente. larve fisso può essere conservato in PBS a 4 ° C fino a diversi giorni. Di procedere alla fase successiva dà subito risultati migliori immunocolorazione.
  3. Rimuovere con attenzione il tuorlo e la pelle che copre la zona del fegato utilizzando una pinza # 55 allo stereomicroscopio.
  4. Permeabilize e blocco larve nel Blocco tampone (4% di siero albumina bovina e 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N a 4 ° C.
  5. Incubare con coniglio anti-collagene I anticorpi alla diluizione di 1: 100 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte per 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio (0,3% Triton X-100 in PBS).
  6. Incubare con AlexaFluor 647 coniugato asino anticorpi anti-coniglio alla diluizione di 1: 200 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte per 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio. Quindi lavare una volta con PBS.
  7. Delicatamente trasferire le larve di vetrini utilizzando una pipetta di vetro, e orientare le larve fissato con il lato laterale sinistro rivolto verso l'alto. Rimuovere l'eccesso di PBS usando Kimwipes. Aggiungere una goccia di mezzi di montaggioE vetro di copertura di tenuta con smalto. Condurre confocale immediatamente è fortemente raccomandato.
  8. Utilizzare un sistema confocale dotata di un obiettivo 40X / 1.3 olio per catturare le immagini. Usare la forza del laser al 20-50%. Catturare immagini dello stack Z a intervalli di 1 micron.

6. Preparazione di Zebrafish adulti

  1. Impostare l'accoppiamento di [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulto in serbatoi di accoppiamento. Harvest embrioni la mattina seguente da sforzare l'acqua del sistema e trasferire gli embrioni in 100 mm piastre di Petri con terreno di embrione.
  2. Mantenere non più di 100 embrioni per piastra di Petri. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere uova non fecondate utilizzando una pipetta di vetro. Crescere embrioni a 28 ° C e aggiungere PTU ad una concentrazione finale di 0,003% dopo 10 HPF per inibire lo sviluppo del pigmento.
  3. A 4 dpf, usare Tricaine per anestetizzare le larve e risolvere [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larve. Lavare Tricaine passando a nuove embrione medio più volte. Lasciare che le larve di recuperare a 28 ° C fino a raggiungere la frequenza cardiaca normale di 120-180 battiti al minuto 18.
  4. Sollevare larve ordinato per 6-12 mesi in base alla procedura standard 19.

7. L'etanolo, Trattamento Metronidazolo, e fegato Rigenerazione in Zebrafish adulti

  1. Trasferire 6-12 mesi di età [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] adulto zebrafish ai serbatoi di accoppiamento con una rete. Mantenere pesci ad una densità non superiore a 10 pesci per vasca.
  2. Preparare la soluzione EtOH fresca aggiungendo EtOH in acqua sistema a una concentrazione finale di 1%. Trattare pesci adulti con 500 ml di soluzione di EtOH in ogni serbatoio e mantenerli in un incubatore a 28 °.
  3. pesce Trasferimento adulto per soluzione EtOH fresco tutti i giorni, degli scarti prop pesci mortirettamente come un rischio biologico. Continuamente trattare gli animali per 72 ore prima del trattamento MTZ.
  4. Preparare fresco soluzione 10 mM MTZ in acqua sistema in 0.1% DMSO. Pre-riscaldare la soluzione MTZ in un incubatore a 28 °. Trattare pesce con 500 ml di soluzione MTZ in 1 L Serbatoio di passaggio per 8 ore a 28 ° C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio.
  5. Osservare ogni ora durante il trattamento e rimuovere immediatamente pesci morti. Scartare pesci morti correttamente come un rischio biologico. Alla fine del trattamento MTZ, lavare MTZ trasferendo animali all'acqua sistema fresco due volte.
  6. Consentire agli animali di recuperare e mantenerli in un incubatore a 28 ° C. Mangimi e trasferire i pesci di acqua sistema fresca tutti i giorni fino al punto di tempo per le analisi.

8. Zebrafish adulti Fegato Fixation, Immunocolorazione, e confocale Imaging

  1. Anestetizzare il pesce adulto con 0,02% Tricaine e euthanize in acqua ghiacciata per 15 minuti. Pat secco pesce su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia di dissezione.
  2. Esporre organi gastrointestinali, eliminando la pelle e muscoli come descritto in precedenza 20. Utilizzare forbici per tagliare la pelle e muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale alla opercolo, e quindi posteriormente lungo il lato del pesce torna alla pinna anale.
  3. Mettete il pesce in un tubo da 15 ml e lavare una volta con PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 4 ml di preparati al momento 2% di formaldeide in tampone PEM di risolvere O / N a 4 ° C.
  4. Scartare fissa soluzione correttamente, e lavare 3 volte con PBS a temperatura ambiente. campioni fissi possono essere tenuti in PBS a 4 ° C per diversi giorni. Di procedere alla fase successiva dà subito risultati migliori immunocolorazione.
  5. Sezionare l'intero intestino con fegato dalla cavità corpo del pesce tagliando l'esofago. Incorporare gli organi gastrointestinali con 4% a basso punto di fusione agarosio in uno stampo di sezionamento.
  6. Utilizzare un vibratome per tagliare campioni in sezioni trasversali a 50 micron intervalli in ghiaccio PBS freddo, a partire dall'estremità anteriore. Trasferimento seczioni a 6 pozzetti con PBS utilizzando un pennello # 1.
  7. Permeabilize e le sezioni di blocco in blocco buffer di O / N a 4 ° C.
  8. Incubare con coniglio anti-collagene I anticorpi alla diluizione di 1: 100 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte, 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio.
  9. Incubare con AlexaFluor 647 coniugato asino anticorpi anti-coniglio alla diluizione di 1: 200 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte, 15 min ciascuno con tampone di lavaggio e una volta con PBS.
  10. trasferire delicatamente sezioni per vetrini utilizzando un pennello # 1. Rimuovere l'eccesso di PBS utilizzando Kimwipes, aggiungere una goccia di mezzi di montaggio e vetro di copertura di tenuta con smalto. Condurre confocale immediatamente è altamente consigliato.
  11. Utilizzare un sistema confocale dotata di un obiettivo 40X / 1.3 olio per catturare le immagini. Usare la forza del laser al 20-50%. Catturare immagini dello stack Z a intervalli di 1 micron.

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Risultati

La figura 1 mostra lo sviluppo di un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish larvale. Per ottimizzare un protocollo per esporre le larve zebrafish di EtOH, in primo luogo abbiamo valutato la tossicità EtOH. 2,5 giorni post-fecondazione (DPF) larve sono stati esposti a concentrazioni EtOH 1%, 1,5%, o del 2% per 24 ore seguita da una 24 ore EtOH trattamento concomitante / MTZ. L'esposizione al 2% EtOH causato alto tasso di mortalità, mentre quasi tutte le...

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Discussione

Abbiamo osservato rigenerazione degli epatociti HPC-mediata nel fegato recupero EtOH / MTZ-trattati, suggerendo che anche in presenza di notevoli quantità di proteine ​​ECM compresi tipo fibrillare collagene, i HPCs conservano la loro competenza per rigenerare come epatociti. L'unico MTZ-trattamento non ha aumentato la deposizione di proteine ​​ECM in modo significativo, mentre il EtOH unico trattamento non ha indotto attivazione HPC 15. Utilizzando il trattamento EtOH / MTZ combinato, siamo stati in grad...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal GTEC (2.731.336 e 1.411.318), il NIH (K01DK081351), e la NSF (1.354.837) per CHS Ringraziamo Alem Giorgis per la lettura critica del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Solfato di calcio emiidrato (CaSO4)AcrosAC385355000
Solfato di magnesio (MgSO4)EMDMX0075
Acido 1,4-piperazinediethanesulfonico (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-
N,N,N′,N′ Acido -tetraacetico (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EtanoloSigma-AldrichE7023200 proof
FormaldeideFisher ScientificF79-500
Metronidazolo (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-fenil-2-tiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-amminoacido benzoico estere etilico (Tricaina)Sigma-AldrichA5040
Compressa di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)AmrescoE404Sciogliere una compressa con 100 ml di acqua distillata
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Albumina sierica bovinaFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Bassopunto di fusione agarosio AmrescoBP165
Libreria di composti di segnalazione con cellule staminaliSelleck ChemicalsL210010  mM stock in DMSO
ActiProbe-1K LibreriaTimtecActiProbe-1K10  Azioni mM in DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Dissolvere con DMSO a 10  mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Dissolvere con DMSO a 10 
mM Anti-Collagene I anticorpoAbcamab23730Utilizzare in scala 1:100 per l'immunocolorazione, reagisce con il pesce
AlexaFluor 647 Asino IgG anti-coniglio (H+L)Sonde molecolariA31573Da utilizzare in scala 1:200 per l'immunocolorazione
Mezzi di montaggio (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
Piastra di Petri da 100 mmVWR25384-088
a 24 pozzetti piastraVWR10062-896
PinzeFine Science Tools11255-20Dumont #55
Vetrino VWR48312-00375x25 mm
Vetro di coperturaVWR48366-04518 mm
Involucro di plasticaFisher Scientific22305654
Foglio di alluminioFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomoLeicaVT1000 S
StereomicroscopioLeicaM80
Microscopio per epifluorescenzaLeicaM205 FA
Microscopio ConfocolZeissLSM700

Riferimenti

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