Dimostriamo un metodo per generare surrogati 3D del cancro al seno, che possono essere coltivati utilizzando un sistema di bioreattori di perfusione per fornire ossigeno e sostanze nutritive. Dopo la crescita, i surrogati vengono fissati e trasformati in paraffina per la valutazione dei parametri di interesse. Viene spiegata la valutazione di uno di questi parametri, la densità cellulare.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Tridimensionale (3D) cultura è un metodo più fisiologicamente rilevanti per modellare il comportamento delle cellule in vitro di due coltura dimensionale. I carcinomi, tra carcinomi mammari, sono tessuti 3D complessi composti da cellule epiteliali cancro e componenti stromali, tra cui fibroblasti e la matrice extracellulare (ECM). Tuttavia la maggior parte modelli in vitro di carcinoma mammario costituiti solo da cellule epiteliali cancerose, omettendo lo stroma e, di conseguenza, l'architettura 3D di un tumore in vivo. Appropriata modellazione 3D del carcinoma è importante per la comprensione accurata della biologia del tumore, il comportamento e la risposta alla terapia. Tuttavia, la durata della cultura e volume di modelli 3D è limitata dalla disponibilità di ossigeno e nutrienti all'interno della cultura. Qui, dimostriamo un metodo in cui le cellule di carcinoma mammario epiteliali e fibroblasti stromali sono incorporati in ECM per generare un surrogato cancro al seno 3D che include stroma e possono essere coltivate comestruttura 3D solido o utilizzando un sistema di bioreattore perfusione di fornire ossigeno e nutrienti. Dopo l'installazione e un periodo di crescita iniziale, surrogati possono essere utilizzati per il test della droga preclinica. In alternativa, i componenti cellulari e matrice della surrogata possono essere modificati per risolvere una varietà di questioni biologiche. Dopo coltura, surrogati sono fissi ed elaborati per paraffina, in modo simile al trattamento di campioni di carcinoma mammario clinica, per la valutazione dei parametri di interesse. La valutazione di un tale parametro, la densità di cellule presenti, è spiegato, dove sono applicati ai microfotografie di sezioni istologiche di surrogati sistemi software di analisi di immagine ImageJ e CellProfiler di quantificare il numero di cellule nucleate per area. Questo può essere usato come un indicatore della variazione del numero di cellule nel tempo o la variazione del numero di cellule risultanti da diverse condizioni di crescita e trattamenti.
Introduzione
Tridimensionale modelli (3D) cultura che imitano in modo più accurato l'architettura tumorale e microambiente in vivo sono importanti per gli studi volti a sezionare le complesse interazioni tra le cellule e il loro microambiente e per testare l'efficacia delle terapie candidati. Tumore impatti dimensionalità ossigeno e gradienti di nutrienti, l'uniformità di esposizione al farmaco, interstiziale flusso di pressione / del sangue, e l'architettura 3D 1-4. La presenza di un adeguato microambiente stromale contribuisce tumore dimensionalità e influenze segnalazione cellulare-ECM e segnalazione paracrina tra cellule stromali e cellule ....
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Protocollo
Cultura 1. cellulare
- Scongelare componente BM notte a 4 ° C, sul ghiaccio.
- medio caldo a 37 ° C. Per sostenere la crescita di entrambe le 231 celle e CAF, utilizzare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) più siero fetale bovino al 10% (FBS).
Nota: I mezzi utilizzati dipenderanno dal tipo di cellula e gli obiettivi sperimentali. - Rimuovere media dalla capsula di Petri (10 cm) di cellule confluenti vicino a 231 e aggiungere 1,5 ml tripsina / EDTA. Incubare per 1 a 3 min a 37 ° C, il monitoraggio di distacco cellulare. Una volta che le cellule cominciano per arrotondare e prende il piatto, arrestare la reazione con l'agg....
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Risultati
Entrambi surrogati di cancro al seno in 3D solidi e irrorati sono stati preparati come descritto sopra e alla produzione di 7 giorni. Successivamente, surrogati sono stati fissati, elaborati per paraffina, sezionati e colorati con ematossilina ed eosina, come descritto sopra. Il numero di cellule nucleate per area (sia 231 cellule e CAF) di ciascun surrogata è stata misurata. Come si vede nella figura 12, microfotografie rappresentativi delle sezioni H colorati con EE di.......
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Discussione
Qui, un metodo di coltura 3D è stato descritto che incorpora i componenti del microambiente tissutale, tra la matrice extracellulare (ECM) e fibroblasti stromali umane, in un volume che modelli più strettamente carcinoma mammario umano per consentire lo sviluppo di una morfologia 3D riepilogativo . Il metodo di coltura 3D descritto è più rappresentativo delle malattie umane di coltura cellulare in 2D tradizionale in quanto più tipi di cellule sono incorporati in un volume 3D di ECM. E 'stato osservato che questi par.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
L'Università dell'Alabama presso il Birmingham Center for Metabolic Bone Disease ha eseguito l'elaborazione istologica e il sezionamento dei surrogati. Southern Research (Birmingham, AL) ha fornito supporto per la produzione del sistema di bioreattore. Il finanziamento è stato fornito dal Programma di ricerca sul cancro al seno (BC121367 del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM) | Corning CellGro | 10-014-CV | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 0,25% tripsina + 2,21 mM EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| Piastre per coltura tissutale, 100 mm | CellTreat Scientific Products | 229620 | Piastre sterili |
| per colture tissutali, 35 mm | CellTreat Scientific Products | 229638 | Per la formazione di schiuma PDMS |
| Pipetta in vetro da 9" | Fisher | 13-678-20D | Pipetta sterile |
| da 10 ml | CellTreat Scientific Products | 229210B | Sterile |
| 1.000 & micro; l punte per piptette | FisherBrand | 02-717-166 | Sterile Filtrato |
| 200 &; l puntali per pipette | FisherBrand | 02-717-141 | Sterile Filtrato 10 |
| &; l puntali per pipette | FisherBrand | 02-717-158 | Provette coniche da |
| 15 ml | CellTreat Scientific Products | 229410 | Provette coniche sterili |
| da 50 ml | CellTreat Scientific Products | 229422 | Provette per |
| microcentrifuga sterili da 1,5 ml | FisherBrand | 05-408-129 | Trypan |
| blue | sterile Corning Cellgro | 25-900-CI | sterile |
| Sylgard 184 | Scienze della microscopia elettronica | 24236-10 | PDMS elastomero e agente indurente. Utilizzato per il nostro bioreattore interno. |
| Schiuma | Prodotta internamente per l'uso nel nostro bioreattore interno. | ||
| Collagene bovino ad alta concentrazione di tipo I | Advanced Biomatrix | 5133-A | FibriCol ~10 mg/ml |
| Fattore di crescita ridotto Matrigel (membrana basale) | Corning | 354230 | Materiale della membrana basale |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S8761 | |
| Acqua di grado di biologia molecolare | Fisher | BP2819-1 | |
| DMEM 10x | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| Sistema di scorrimento a camera Nunc Lab-Tek | Thermo Scientific | 177402 | |
| realizzato internamente. | |||
| Ritorno elastico in acciaio inossidabile 304 Rivestito con fili | McMaster-Carr | 1749T19 | per generare microcanali nel nostro sistema di bioreattore interno. |
| Tubo della pompa in silicone polimerizzato al platino BioPharm Plus | Masterflex | EW-96440-14 | Per l'uso nel nostro sistema di bioreattore interno. ID tubo: 1,6 mm, dimensione portagomma: 1/16 poll. |
| Set di tubi a 2 fermi, PVC non svasato, 1,52 mm ID | Cole-Parmer | EW-74906-36 | Per l'uso nel nostro sistema di bioreattore interno (con pompa microperistalitica). |
| Micro pompa peristaltica di precisione a sei canali | Cole-Parmer | EW-74906-04 | Da utilizzare con il nostro sistema di bioreattori interno |
| Siringhe per tubercolina | BD Medical | 309625 | ago calibro 26 da 3/8 pollici; Pinze |
| sterili per tessuti da dissezione | FisherBrand | 13-812-36 | 5,5 pollici |
| Boekel Scientific | 260750 | Opzione attrezzatura per la rotazione surrogata. Utilizzato con giostra per provette da 50 ml (numero di modello 260753) | |
| Carosello per provette da 50 ml | Boekel Scientific | 260753 | Utilizzato con mini rotatore per provette |
| Bambino Forno di ibridazione | Boekel Scientific | 230301 | Opzione di attrezzatura per la rotazione surrogata |
| Gel per l'elaborazione dei campioni | HistoGel Thermo Scientific | HG-4000-012 | Gel per l'elaborazione dei campioni descritto nel passaggio 5.2 |
| Cryomold | Andwin Scientific | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Marcatura dei tessuti Colorante Cancer | Diagnostics, inc. | 03000P | Può essere utilizzato per marcare i surrogati, consentendo di includere più campioni in una cassetta di tessuto |
| Cassette di tessuto incernierate | FisherBrand | 22-272-416 | |
| Formalina | Fisher | 23-245-685 | |
| Vetrini in vetro semplice GoldSeal | Thermo Scientific | 3048-002 | |
| Xilene | Fisher | X3P-1GAL | |
| Etanolo, 200 proof (100%), USP | Decon Laboratories, Inc. | 2805M | |
| Hematoxylin | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| Clarifier | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7401 | |
| Soluzione azzurrante | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | |
| Cytoseal XYL montaggio media | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 83124 | |
| Vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-548-5G |
Riferimenti
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitr....
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Ristampe e permessi
