Sviluppo e caratterizzazione di In Vitro Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca 2+] i E ossido nitrico Produzione

Summary

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate fino alla confluenza all'interno di un dispositivo di rete microfluidica. Sono state illustrate le distribuzioni della giunzione delle cellule endoteliali e della F-actina e sono stati quantificati in tempo reale a livello di singola cellula le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio e della produzione di ossido nitrico in risposta all'adenosina trifosfato (ATP).

Abstract

Le cellule endoteliali (ECS) che ricoprono le pareti dei vasi sanguigni in vivo sono costantemente esposti a scorrere, ma EC coltivate sono spesso coltivati ​​in condizioni statiche e mostrano un fenotipo pro-infiammatorio. Sebbene lo sviluppo di dispositivi microfluidici è stato abbracciato dagli ingegneri più di due decenni, le loro applicazioni biologiche rimangono limitati. Un modello in vitro microvasi più fisiologicamente rilevanti convalidato da applicazioni biologiche è importante per far avanzare il campo e colmare il divario tra in vivo e in vitro. Qui, presentiamo procedure dettagliate per lo sviluppo della rete microrecipiente coltivate utilizzando un dispositivo microfluidico con una capacità di perfusione a lungo termine. Abbiamo anche dimostrare le sue applicazioni per misurazioni quantitative dei cambiamenti agonisti indotte CE [Ca ^{2 +]} _i e l'ossido nitrico (NO) la produzione in tempo reale utilizzando confocale e microscopia a fluorescenza convenzionale. La rete dei microvasi formatolavoro con perfusione continua mostrato giunzioni ben sviluppati tra EC. Distribuzione VE-caderina era più vicino a quello osservato nei microvasi intatti di monostrati CE staticamente in coltura. ATP-indotta aumenti transitori in CE [Ca ^2+] _i e la produzione di NO sono stati quantitativamente misurata a livello individuale cellulari, che ha convalidato la funzionalità dei microvasi in coltura. Questo dispositivo microfluidico consente EC di crescere sotto una ben controllata, flusso fisiologicamente rilevanti, il che rende l'ambiente di coltura cellulare più vicino in vivo rispetto che nelle culture 2D convenzionali, statiche. Il disegno di rete microcanali è altamente versatile, e il processo di fabbricazione è semplice e ripetibile. Il dispositivo può essere facilmente integrato nel sistema microscopica confocale o convenzionale consentendo imaging ad alta risoluzione. Più importante, perché la rete microrecipiente coltura può essere formata da ECS umani primari, questo approccio servirà come strumento utile per studiare comepatologicamente emocomponenti alterati da campioni di pazienti influenzano EC umane e forniscono informazioni sulle problematiche cliniche. Anche può essere sviluppato come piattaforma per lo screening di droga.

Introduction

Le cellule endoteliali (ECS) che ricoprono le pareti dei vasi sanguigni in vivo sono costantemente esposti a scorrere, ma EC coltivate sono spesso coltivati ​​in condizioni statiche e mostrano un fenotipo pro-infiammatorio ^1,2. La tecnologia microfluidica consente un fluido controllato con precisione attraverso un microscala geometricamente vincolata (sub-millimetrica) canali ^3, che prevede la possibilità per le cellule in coltura, in particolare per ECS vascolare, di crescere in condizioni di flusso desiderate. Queste caratteristiche rendono le condizioni di coltura cellulare più vicino a in vivo rispetto alle tradizionali, co....

Protocol

1. fabbricazione di dispositivi Microfluidic

1. Fotolitografia di fabbricazione standard di un SU-8 50 Master Mold
   1. Pulire il wafer di silicio prima spin-coating. Risciacquare un wafer di silicio 2 pollici nudo con acetone per 15 min seguito da alcol isopropilico (IPA) per 15 min. Disidratare il wafer ponendolo su una piastra riscaldante a 150 ° C per 1 ora. Dopo la disidratazione, raffreddare il wafer a temperatura ambiente.
   2. Spin-coat wafer di silicio con SU-8 fotosensibile. Aggiungere 2 ml di SU-8 photoresist sul wafer. Rampa wafer a 500 rpm a 100 rpm accelerazione / sec per 10 sec, seguita da 1,000 rpm a 300 rpm accelerazione / sec per 30....

Results

Questa sezione mostra alcuni dei risultati ottenuti con la rete microrecipiente coltura sviluppata con questo protocollo. Il modello microcanali è una ramificazione rete a tre livelli (Figura 1A). In questo disegno, a 159 micron di larghezza rami del canale madre in due 126 micron canali di larghezza, e rami di nuovo in quattro canali 100 micron figlia di larghezza. Una simulazione numerica 3D è stato eseguito per stimare le distribuzioni di sollecitazione di taglio sott.......

Discussion

In questo articolo, presentiamo protocolli dettagliati per lo sviluppo della rete dei microvasi colta, la caratterizzazione di giunzioni CE e citoscheletro distribuzione F-actina, e le misurazioni quantitative della CE [Ca ^2+] _i e la produzione di NO utilizzando un dispositivo di microfluidica. Il dispositivo microfluidico perfuso fornisce un modello in vitro che consente uno stretto simulazione delle geometrie microvascolari in vivo e condizioni di flusso shear. Dal momento.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Acetone	Fisher Scientific	A929
Punzone per biopsia	Miltex	33-31 AA
Albumina bovina	MP Biomedicals	810014
Estratto di cervello bovino (BBE)	Lonza	CC-4098
Vetrino coprioggetti	Fisher Scientific	12-542C
DAF-2 DA	Calbiochem	251505
destrano	Sigma-Aldrich	31390
Asino anti-capra IgG (H+L) Anticorpo secondario	Tecnologie per la vita	A-11055
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190-250
DRAQ5 (colorazione dei nuclei)	Tecnologia di segnalazione cellulare	4084
Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Siero fetale bovino	Gibco	16000-044
Fibronectina	Gibco	PHE0023
Fluo-4 AM	Life technologies	F-14201
Gelatina da pelle suina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Gentamicina (50 mg/ml)	Gibco	15750-078
Vetrino coprioggetti in vetro	Fisher Scientific	12-548B
Vetro Pasteur pippette	VWR	14672
Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina	Sigma-Aldrich	H3393-10KU
HEPES Soluzione salina tamponata	Lonza	CC-5024
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)	Lonza	CC-2517
Alcool isopropilico (IPA)	VWR	89125
L-Glutammina (200 mM)	Gibco	25030-081
Ingrediente
NaCl (132 mM)	Fisher Scientific	S671-3
KCl (4.6 mM)	Fisher Scientifico	P217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM)	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4 · 7H2O (1,2 mM)	Fisher Scientific	M63-500
Glucosio (5,5 mM)	Fisher Scientific	BP350-1
NaHCO3 (5,0 mM)	Fisher Scientific	S233-500
Hepes Salt (9,1 mM)	Research Organics	6007H
Hepes Acid (10,9 mM)	Research Organics	6003H
MCDB 131 Colture Tecnologie per	la media vita	10372-019
Microscopia elettronica	paraformaldeide	Scienze 15710
Falloidina (colorazione F-actina)	Sigma-Aldrich	P1951
Soluzione salina tamponata con fosfato	Life technologies	14040-133
Polidimetilsilossano (PDMS)	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Scalpel	Exel Int	29552
Scotch	3M	34-8711-3070-3
Wafer di silicio	VWR	14672
SU-8 fotoresist	MicroChem	SU-8 2050 Y111072
Sviluppatore SU-8
	Sigma-Aldrich	Z707503-100EA
Triton X-100	Chemical Book	T6878
Soluzione neutralizzante della tripsina	Gibco	R-002-100
Soluzione di tripsina/EDTA (TE)	Gibco	R-001-100
Tubing	Cole-Parmer	Tubo microforo in PTFE, 0,012" ID x 0,030" OD
VE-caderina	Santa Cruz Biotechnology	SC-6458
Nome dell'attrezzatura	Azienda	Numero di catalogo	Comments/Description
Biosafety Cappa laminare	NuAire	NU-425 Classe II, Tipo A2
Fotocamera CCD	Hamamatsu	ORCA
Microscopio confocale	Leica	TCS SL
Essiccatore	Bel-Art	F42022
Piastra riscaldante	Wenesco	HP-1212
Incubatore	Forma Scientific	3110
Forno Isotemp	Barnstead	3608-5
Litografia banco	Karl Suss	MA6 Litografia
Microscopio ottico	Nikon	L200 ND & Diaphod 300
Otturatore per la telecamera CCD	Strumento Sutter Lambda	10-2
Pulitore al plasma	PVA TePla / Harrick plasma	M4L / PDC-32G
Spin coater	Brewer Science	Cee 200X
Sistema di pompe a siringa	Harvard Apparatus	703005
Nome del software	Azienda	Numero di catalogo	Comments/Description
CAD software	Autodesk	AutoCAD 2015
software di simulazione CD	COMSOL	COMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Acquisizione e analisi di immagini per la produzione di NO	Metafluor		di imaging universale