Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Summary

Le tecniche di pulizia ottica stanno rivoluzionando il modo in cui i tessuti vengono visualizzati. In questo rapporto descriviamo le modifiche del protocollo originale Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Acrylamide-hybridized Imaging compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) che produce risultati più coerenti e meno costosi.

Abstract

Tradizionalmente, la visualizzazione dei tessuti ha richiesto che il tessuto di interesse fosse sezionato in serie e visualizzato, sottoponendo ogni sezione di tessuto a deformazioni non lineari uniche, ostacolando drasticamente la capacità di valutare la morfologia, la distribuzione e la connettività cellulare nel sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, le tecniche di pulizia ottica stanno cambiando il modo in cui i tessuti vengono visualizzati. Questi approcci consentono di sondare in profondità le preparazioni di organi intatti, fornendo un'enorme comprensione dell'organizzazione strutturale dei tessuti in salute e malattia. Tecniche come CLARITY (Clear Lipid-exchanged Apilamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) raggiungono questo obiettivo fornendo una matrice che lega importanti biomolecole consentendo ai lipidi a diffusione di luce di diffondersi liberamente. La rimozione dei lipidi, seguita dalla corrispondenza dell'indice di rifrazione, rende il tessuto trasparente e facilmente visualizzabile in 3 dimensioni (3D). Ciononostante, la pulizia elettroforetica dei tessuti (ETC) utilizzata nel protocollo CLARITY originale può essere difficile da implementare con successo e l'uso di una soluzione proprietaria di corrispondenza dell'indice di rifrazione rende costoso l'uso di routine della tecnica. Questo rapporto dimostra l'implementazione di un protocollo di chiarificazione ottica semplice ed economico che combina CLARITY passivo per una migliore integrità dei tessuti e 2,2'-tiodietanolo (TDE), una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione precedentemente descritta.

Introduction

La capacità di visualizzare strutture neuroanatomiche complete è immensamente preziosa per comprendere il cervello in salute e malattia. Tradizionalmente, l'imaging 3D ha richiesto il sezionamento dei tessuti per fornire la risoluzione assiale e visualizzare le strutture anatomiche profonde. Questo approccio è in grado di produrre set di dati ad alta risoluzione, ma richiede sofisticate tecniche di ricostruzione delle immagini ed è molto laborioso. Di conseguenza, è stato limitato all'imaging di piccoli volumi di tessuto^1-3. Il sezionamento ottico, d'altra parte, è adatto per la creazione di immagini 3D ad alta risoluzione di tessuti marcati in fluorescenza. Poiché il sezionamento ottico è intrinsecamente tridimensionale, non richiede calcoli approfonditi per produrre un volume di immagine 3D. Tuttavia, la diffusione della luce e l'opacità dei tessuti limitano la profondità alla quale i tessuti possono essere sezionati otticamente. La profondità di imaging è limitata a circa 150 μm nella microscopia confocale a scansione laser e a meno di 800 μm utilizzando la microscopia di eccitazione a due fotoni^4-8.

Al fine di superare queste limitazioni, diverse tecniche di chiarifica ottica sono state recentemente sviluppate e poi ulteriormente perfezionate per consentire l'imaging microscopico profondo di tessuti intatti. L'uso di alcol benzilico e benzoato di benzile (BABB) per rendere trasparenti i tessuti fissati è stato uno dei primi approcci⁹. Tuttavia, questo approccio è stato limitato dall'estinzione della fluorescenza nei campioni e dalla cancellazione incompleta delle strutture altamente mielinizzate10. I perfezionamenti di questa tecnica, come l'imaging 3D di organi puliti da solvente (3DISCO), hanno portato a una pulizia dei tessuti molto rapida e completa, ma soffrono ancora di una rapida perdita di segnali fluorescenti, in particolare della proteina fluorescente gialla (YFP)¹⁰. Le soluzioni di chiarificazione a base d'acqua, come Sca/e¹¹ e SeeDB¹², preservano i segnali fluorescenti, ma non eliminano completamente i tessuti altamente mielinizzati. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) è una nuova promettente tecnologia di chiarificazione ottica che sembra superare i limiti delle soluzioni di chiarificazione a base d'acqua sviluppate in precedenza¹³. A differenza di altre tecniche di chiarificazione ottica, il Clear Lipid-exchanged Acrilamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)¹⁴ incorpora il cervello in una matrice porosa che fornisce integrità strutturale a proteine, acidi nucleici e piccole molecole, lasciando i lipidi non legati. I lipidi vengono quindi rimossi elettroforeticamente, culminando in un cervello otticamente ripulito che può essere facilmente visualizzato e altrettanto facilmente sondato utilizzando tecniche comunemente disponibili.

La pulizia elettroforetica dei tessuti (ETC) viene utilizzata per rimuovere i lipidi dai tessuti inclusi in idrogel in CLARITY, tuttavia, l'ETC può essere difficile da implementare in modo coerente e i tessuti soggetti a elettroforesi possono mostrare distorsione tissutale, imbrunimento, perdita di fluorescenza e reattività anticorpale. La pulizia passiva dei lipidi evita queste limitazioni, ma richiede tempi di pulizia aumentati^15-17. La compensazione passiva consente anche la pulizia di un gran numero di campioni in parallelo, poiché non è limitata dal numero di apparati ETC disponibili. La diminuzione della concentrazione di paraformaldeide e l'esclusione della bis-acrilammide dall'idrogel hanno portato a un grande aumento della velocità di eliminazione a scapito di una maggiore espansione dei tessuti¹⁶. Sono state sviluppate alternative meno costose alla soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione utilizzata nella tecnica originale CLARITY^17-19. Il 2,2'-tiodietanolo (TDE) è un agente di pulizia del cervello economico e rapido che inverte parte dell'espansione tissutale che si verifica durante la rimozione dei lipidi¹⁸. Questo rapporto incorpora la pulizia passiva del tessuto incluso in idrogel e l'uso del TDE come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione alla tecnica originale CLARITY per produrre un protocollo altamente riproducibile e poco costoso per la pulizia ottica del sistema nervoso centrale del topo.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con Istituzionale cura degli animali e le linee guida Comitato Usa (IACUC). Thy1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato topi sono stati utilizzati per questi esperimenti, ma qualsiasi topi che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere cancellati e ripreso con successo.

1. Preparazione del tessuto

Attenzione: paraformaldeide (PFA) e acrilammide sono tossici e irritanti. Effettuare esperimenti che utilizzano questi reagenti in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).

1. Sacrificare l'animale in camera di eutanasia con ~ 1 ml di isoflurano fino respirazione cessa (~ 2 - 3 min).
2. Utilizzare una pompa peristaltica impostato ~ 5 ml / min per defluire in intracardiaca il mouse con la soluzione di perfusione (Tabella 1) a 4 ° C fino a quando il sangue viene cancellato dai tessuti (5 - 10 min).
3. Modificare il perfusato di soluzione fissativa (Tabella 1)a 4 ° C fino al collo e coda sono notevolmente irrigidito (5 - 10 min).
4. Terminare la perfusione e decapitare il animali. Sezionare delicatamente il cervello dal cranio rimuovendo prima il tessuto connettivo circostante cranio e quindi la rimozione di osso dalla superficie ventrale del cranio e sollevando il cervello (figura 1a), come descritto in ^20.
   Nota: Prestare particolare attenzione alla rimozione di osso che circonda i lobi flocculonodular del cervelletto e dei bulbi olfattivi.
   1. Sezionare il midollo spinale dalla colonna vertebrale, inserendo delicatamente la punta di una multa, tagliente forbice tra il midollo spinale e la colonna vertebrale e il taglio dei singoli segmenti della colonna vertebrale di distanza, come descritto in ^21.
5. Hemisect cervello ponendolo in una matrice plastica cervello di topo e tagliando lungo la linea mediana con una lama di matrice.
6. Aggiungere ogni emisfero e del midollo spinale per separare 50 ml vasca centrifugaes con ~ 40 ml di soluzione di idrogel (Tabella 1). Da questa copertura in avanti punto le provette con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori durante tutte le fasi successive.
7. Incubare la provetta contenente il campione in idrogel a 4 ° C con agitando delicatamente (~ 30 rpm) per 7 giorni.

2. polimerizzazione

1. Scartare ~ 25 ml di idrogel, mantenendo il campione e ~ 25 ml di idrogel nella provetta da centrifuga.
2. Deoxygenate campione rimuovendo il tappo e posizionare il tubo da centrifuga in barattolo essiccatore e collega il vaso ad un vuoto. Applicare il vuoto per almeno 10 minuti per consentire gas disciolti venire dalla soluzione e formare bolle. Agitare delicatamente per rimuovere le bolle.
3. Sostituire il vuoto nel vaso essiccatore 100% azoto oltre 2 - 3 min. Una volta che la pressione equalizza (una volta all'inizio della giara essiccatore può essere aperto), tappare rapidamente il tubo per impedire la reintroduzione di ossigeno.
4. Polimeroizzare l'idrogel ponendo la provetta con il campione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 3 ore fino polimerizzazione è completa. Idrogel polimerizzato assumerà una consistenza gelatinosa (Figura 1b). Nota: Una piccola quantità di idrogel non polimerizzato in alto è accettabile.
5. Utilizzare una spatola per rimuovere il campione polimerizzato dalla provetta, poi tagliare via l'eccesso idrogel dal campione.
6. Rimuovere l'idrogel restante ponendo il campione su un panno senza pulire e delicatamente sfregamento e rotolare il tessuto su di esso, lasciando solo un sottile strato di idrogel polimerizzato sul campione.

3. La rimozione dei lipidi

Nota: il tessuto lipidico-eliminato è fragile, maneggiare con cura. Utilizzare un filtro cella quando lo svuotamento del tubo per evitare di perdere del campione. Inoltre, il campione si gonfiano in tutto il processo di compensazione, tuttavia, gonfiore può essere invertito durante il processo di indice di rifrazione corrispondente.

Attenzione: Sodium solfato dodecil (SDS) e l'acido borico sono irritanti. Effettuare esperimenti li utilizzano in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).

1. Trasferire campione polimerizzato di clean 50 ml tubo di centrifuga, aggiungere 45 ml di compensazione tampone (Tabella 1). Incubare a 45 ° C con un leggero scuotimento (~ 30 rpm). Modificare il buffer al giorno per un periodo iniziale di 7 giorni versando fuori il buffer di compensazione utilizzato in rifiuti chimici e l'aggiunta di ~ 45 ml di tampone di compensazione fresco. Tenere le provette da centrifuga contenenti i campioni coperti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori.
2. Dopo i primi 7 giorni, incubare il campione a 40 ° C e lo scambio di compensazione tampone ogni 2 - 3 giorni. Continuare compensazione fino a quando tutti i lipidi sono solubilizzati e tessuti raggiunge la trasparenza (Figura 1c). Questo sarà il 4 - 6 settimane per un emisfero del cervello del mouse e 2 - 4 settimane per un midollo spinale.
3. Una volta che il tessuto viene cancellato, il trasferimentocampione in un tubo da 50 ml centrifuga e lavare 4 volte in PBST (Tabella 1) a 40 ° C agitando delicatamente (~ 30 rpm) su 24 ore per rimuovere residui di SDS.

4. La colorazione molecolare

Attenzione: 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) è un irritante e gli esperimenti che utilizzano dovrebbe essere eseguita in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).

1. Trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml pulito e riempire con 1 mg / ml DAPI in 1x PBST, pH 7.5. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore. Tenere le provette da centrifuga contenenti i campioni coperti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori.
2. Lavare 3 volte in PBST a temperatura ambiente per almeno 6 ore / lavaggio.

5. indice di rifrazione di corrispondenza

Attenzione: 2,2'-tiodietanolo (TDE) è un irritante e gli eventuali esperimenti utilizzandolo should essere eseguita in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).

1. Trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml pulito e riempire con il 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubare a 40 ° C agitando delicatamente (~ 30 rpm) per 24 ore.
2. Scambio 30% TDE con 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubare a 40 ° C con delicata agitazione per 24 ore.
   Nota: Il campione si restringerà torna a dimensioni approssimative di originale.
3. Su una superficie piana e pulita rotolare un pezzo di adesivo riutilizzabile in un cilindro con diametro uniforme solo leggermente maggiore dello spessore del campione.
4. Disporre il cilindro adesivo riutilizzabile in un cerchio aperto (~ diametro 25 mm interno con una piccola apertura nella parte superiore) su un piatto fondo di vetro 40mm. Se correzioni devono essere fatte, togliere il cilindro dal vetro e tagliato con una lama di rasoio.
5. Utilizzare una punta P1000 pipetta per creare una tenuta tra l'adesivo riutilizzabile e vetro darotolare intorno al bordo esterno del cilindro.
6. Luogo ~ 100 ml 63% TDE sul piatto di vetro e diffuso in tutto per coprire la superficie di vetro all'interno del cerchio di adesivo riutilizzabile.
7. Utilizzando una spatola, posizionare accuratamente il campione al centro del cerchio, facendo attenzione a non formare bolle.
8. Pipetta altri 100 ml di 63% TDE direttamente sul campione, quindi collocare immediatamente a 40 millimetri di vetro di copertura circolare su l'adesivo riutilizzabile.
9. Utilizzando l'indice, medio e anulare di entrambe le mani, premere con attenzione intorno al perimetro del cerchio finché il vetro di copertura ha preso contatto con il campione.
10. Portare lentamente il piatto fondo di vetro in posizione verticale di riposo contro una superficie, quindi aggiungere 63% TDE con una pipetta finché la soluzione raggiunge la piccola apertura nella parte superiore. Usare un panno senza pulire per asciugare la punta della pipetta in modo che la soluzione non cola sul vetro. Per evitare bolle nella camera, non svuotare la pipetta fino in fondo.
11. Ala piccola apertura, aggiungere elastomero silicio per racchiudere il cerchio e creare una camera chiusa. Attendere 5 minuti che si asciughi prima di imaging.

6. Microscopia

Attenzione: I laser utilizzati in confocale, illuminazione piano singolo e la microscopia foglio di luce sono molto potente e può causare la cecità. Tutti gli esperimenti che utilizzano il laser deve essere eseguita dopo una formazione completa e con grande cautela e protezione per gli occhi adeguata.

1. Posizionare la camera di imaging con il campione all'interno sul palco di un microscopio confocale a scansione laser.
2. Aprire il software di imaging (vedi Tabella dei Materiali). Per accendere il laser ad argon di eccitazione, fare clic sulla scheda di configurazione nella parte superiore del programma quindi l'icona del laser. Seleziona la casella accanto a argon per alimentare il laser e spostare la scala slitta al 30%. Osservare il puntatore lentamente riscaldare nella posizione selezionata.
   1. Ritorna alla scheda acquisiscono in alto. Nella grande scatola "Impostazioni percorso del fascio &# 34; andare al carico / salva casella di impostazione e selezionare il menu a tendina per selezionare un canale di lunghezza d'onda appropriata per immagine YFP (527 nm).
3. Selezionare obiettivi appropriati per l'imaging individuando il collegamento ipertestuale rosso con l'etichetta "Obiettivo: oggetto corrente" sotto la casella impostazioni del canale. Facendo clic sulla scheda si apre tutti gli obiettivi disponibili e una selezione ruoterà automaticamente la torretta.
   1. Utilizzare obiettivi (ad es., 10X) con una distanza grande lavoro (maggiore dello spessore del tessuto per creare l'immagine, ad esempio, 11 mm) e una apertura numerica (ad es., 0,3) per massimizzare risoluzione in piano dell'immagine e minimizzare lo spessore della sezione ottica.
4. Sulla colonna di sinistra del menu a discesa, aprire il "XY: risoluzione" finestra per impostare matrice di acquisizione, chiamato "format", a 1.024 x 1.024 o un valore appropriato per il limite laterale risoluzione dell'obiettivo. Impostare il fattore di zoom più basso possibile (ad es., 1.7).
5. Nella stessa finestra, impostare parametri medi 8 media di linea e 1 fotogramma facendo cadere giù i menu etichettate singolarmente di conseguenza. Utilizzare valori grandi per un alto rapporto segnale-rumore e piccoli valori per l'acquisizione rapida.
   Nota: 8 medie di linea e 1 media struttura acquisiranno immagini di alta qualità di un emisfero del cervello del mouse in circa 4 ore.
6. Individuare il campione utilizzando i controlli di scena. Una volta che un campo rappresentativo è visibile, impostare il guadagno e offset.
   Nota: Il guadagno e offset varia considerevolmente in base al tipo di tessuto, fluorofori, e / o caratteristica anatomica di essere ripreso. Per YFP, impostare i valori 760-780 per il guadagno e da -1,0 a -1,5 per l'offset.
7. Selezionare "scan tile" e selezionare i confini della regione di interesse. Impostare i limiti superiore e inferiore della z-stack da acquisire. Impostare lo spessore della sezione ottica basato su limite di risoluzione ottica sezione del oggettivo.
   Nota: Un obiettivo dilimite di risoluzione ottica sezione è definita principalmente dalla sua apertura numerica. La maggior parte del software di controllo microscopio calcolerà automaticamente un valore appropriato per l'obiettivo in uso. Per un obiettivo 10X con una apertura numerica di 0,3 sarebbe di circa 11 micron.
8. Avviare l'acquisizione.
   Nota: Questo può richiedere più ore.
9. Raccogliere immagini ad alta risoluzione usando obiettivi ingrandimento superiore di specifiche regioni di interesse.

Results

Visualizzare l'organizzazione strutturale del cervello è fondamentale per capire come la morfologia e la connettività influenzano la funzione del cervello in salute e malattia. tecniche di compensazione ottici permettono di popolazioni di cellule immagine in 3D nei tessuti intatti, che ci permette di studiare la morfologia e la connettività coeso.

I topi che esprimono proteine ​​fluorescenti guidata da promotori specifici per ...

Discussion

compensazione passiva di idrogel incorporato tessuti (chiarezza passivo) è un metodo semplice e poco costoso per la compensazione grandi pezzi di tessuto. Questo approccio non richiede attrezzature dedicate e può essere facilmente eseguita con un agitatore a temperatura controllata. Nell'arco di poche settimane, anche di grandi dimensioni, i tessuti altamente mieliniche, come ad esempio un intero cervello o del midollo spinale, diventeranno trasparenti e adatto per la microscopia. Anche se questo rapporto è concentr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Fisher	BP399-1	tamponi
32% paraformaldeide (PFA)	Microscopia elettronica	Sciences 15714-5	perfusione e idrogel
2,2'-tiodietanolo (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione
40% acrilammide	Bio-Rad	161-0140	idrogel
2% bis-acrilammide	Bio-Rad	161-0142	idrogel
VA-044 iniziatore	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	idrogel
Acido borico	Sigma-Aldrich	B7901	tampone di pulizia
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Fisher	BP166-5	tampone di pulizia
Idrossido di sodio	Fisher	55255-1	tamponi
Azide di sodio	Sigma-Aldrich	52002-100G	conservante
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	tamponi
Eparina	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfusione
Nitrato di sodio	Fisher	BP360-500	perfusione
DAPI	Sonde molecolari	D1306	colorazione nucleare
99,9% isoflurano	Phoenix	57319-559-06	anestetico
acido idrocolorico	Fisher	A1445-500	tamponi
Piatto con fondo in vetro	Willco	HBSB-5040	Piatti Willco
Adesivo riutilizzabile	Bostick	371351	Blu-Tack
Elastomero siliconico	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Salvietta senza lanugine	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Matrice cerebrale di topo	Roboz	SA-2175	tessuto
di sezionamentoLame per matrici	Roboz	RS-9887	sezionamento di tessuti
Pompa peristaltica	Cole-Parmer	77122-24	pefusione
Microscopio confocale a scansione laser	Microscopia	Leica	SP5
Software di imaging	Microscopia Leica	LAS AF