Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Summary

Le tecniche di pulizia ottica stanno rivoluzionando il modo in cui i tessuti vengono visualizzati. In questo rapporto descriviamo le modifiche del protocollo originale Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Acrylamide-hybridized Imaging compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) che produce risultati più coerenti e meno costosi.

Abstract

Tradizionalmente, la visualizzazione dei tessuti ha richiesto che il tessuto di interesse fosse sezionato in serie e visualizzato, sottoponendo ogni sezione di tessuto a deformazioni non lineari uniche, ostacolando drasticamente la capacità di valutare la morfologia, la distribuzione e la connettività cellulare nel sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, le tecniche di pulizia ottica stanno cambiando il modo in cui i tessuti vengono visualizzati. Questi approcci consentono di sondare in profondità le preparazioni di organi intatti, fornendo un'enorme comprensione dell'organizzazione strutturale dei tessuti in salute e malattia. Tecniche come CLARITY (Clear Lipid-exchanged Apilamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) raggiungono questo obiettivo fornendo una matrice che lega importanti biomolecole consentendo ai lipidi a diffusione di luce di diffondersi liberamente. La rimozione dei lipidi, seguita dalla corrispondenza dell'indice di rifrazione, rende il tessuto trasparente e facilmente visualizzabile in 3 dimensioni (3D). Ciononostante, la pulizia elettroforetica dei tessuti (ETC) utilizzata nel protocollo CLARITY originale può essere difficile da implementare con successo e l'uso di una soluzione proprietaria di corrispondenza dell'indice di rifrazione rende costoso l'uso di routine della tecnica. Questo rapporto dimostra l'implementazione di un protocollo di chiarificazione ottica semplice ed economico che combina CLARITY passivo per una migliore integrità dei tessuti e 2,2'-tiodietanolo (TDE), una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione precedentemente descritta.

Introduction

La capacità di visualizzare strutture neuroanatomiche complete è immensamente preziosa per comprendere il cervello in salute e malattia. Tradizionalmente, l'imaging 3D ha richiesto il sezionamento dei tessuti per fornire la risoluzione assiale e visualizzare le strutture anatomiche profonde. Questo approccio è in grado di produrre set di dati ad alta risoluzione, ma richiede sofisticate tecniche di ricostruzione delle immagini ed è molto laborioso. Di conseguenza, è stato limitato all'imaging di piccoli volumi di tessuto^1-3. Il sezionamento ottico, d'altra parte, è adatto per la creazione di immagini 3D ad alta risoluzione di tessuti marcati in fluorescenza....

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con Istituzionale cura degli animali e le linee guida Comitato Usa (IACUC). Thy1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato topi sono stati utilizzati per questi esperimenti, ma qualsiasi topi che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere cancellati e ripreso con successo.

1. Preparazione del tessuto

Attenzione: paraformaldeide (PFA) e acrilammide sono tossici e irritanti. Effettuare esperimenti che utilizzano questi reagenti in una cappa aspirante e con attrezzature adeguate di protezione individuale (camice, guanti e protezioni per gli occhi).

1. Sacrif....

Results

Visualizzare l'organizzazione strutturale del cervello è fondamentale per capire come la morfologia e la connettività influenzano la funzione del cervello in salute e malattia. tecniche di compensazione ottici permettono di popolazioni di cellule immagine in 3D nei tessuti intatti, che ci permette di studiare la morfologia e la connettività coeso.

I topi che esprimono proteine ​​fluorescenti guidata da promotori specifici per .......

Discussion

compensazione passiva di idrogel incorporato tessuti (chiarezza passivo) è un metodo semplice e poco costoso per la compensazione grandi pezzi di tessuto. Questo approccio non richiede attrezzature dedicate e può essere facilmente eseguita con un agitatore a temperatura controllata. Nell'arco di poche settimane, anche di grandi dimensioni, i tessuti altamente mieliniche, come ad esempio un intero cervello o del midollo spinale, diventeranno trasparenti e adatto per la microscopia. Anche se questo rapporto è concentr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Fisher	BP399-1	tamponi
32% paraformaldeide (PFA)	Microscopia elettronica	Sciences 15714-5	perfusione e idrogel
2,2'-tiodietanolo (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione
40% acrilammide	Bio-Rad	161-0140	idrogel
2% bis-acrilammide	Bio-Rad	161-0142	idrogel
VA-044 iniziatore	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	idrogel
Acido borico	Sigma-Aldrich	B7901	tampone di pulizia
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Fisher	BP166-5	tampone di pulizia
Idrossido di sodio	Fisher	55255-1	tamponi
Azide di sodio	Sigma-Aldrich	52002-100G	conservante
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	tamponi
Eparina	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfusione
Nitrato di sodio	Fisher	BP360-500	perfusione
DAPI	Sonde molecolari	D1306	colorazione nucleare
99,9% isoflurano	Phoenix	57319-559-06	anestetico
acido idrocolorico	Fisher	A1445-500	tamponi
Piatto con fondo in vetro	Willco	HBSB-5040	Piatti Willco
Adesivo riutilizzabile	Bostick	371351	Blu-Tack
Elastomero siliconico	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Salvietta senza lanugine	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Matrice cerebrale di topo	Roboz	SA-2175	tessuto
di sezionamentoLame per matrici	Roboz	RS-9887	sezionamento di tessuti
Pompa peristaltica	Cole-Parmer	77122-24	pefusione
Microscopio confocale a scansione laser	Microscopia	Leica	SP5
Software di imaging	Microscopia Leica	LAS AF