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Articolo metodologico

Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

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DOI:

10.3791/54026

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9 giugno 2016

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1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

In questo articolo

Sommario

Gli xenotrapianti di glioblastoma multiforme derivati da pazienti possono essere miniaturizzati in microtumori viventi utilizzando il sistema di coltura di biogel umano 3D. Questo test tumorale 3D in vivo è adatto per i test di risposta ai farmaci e la profilazione molecolare, compresa l'analisi cinematica.

Abstract

L'uso di xenotrapianti derivati da pazienti per modellare i tumori ha fornito importanti informazioni sulla biologia del cancro e sulla risposta ai farmaci. Tuttavia, richiedono tempo, sono costosi e richiedono molta manodopera. Per superare questi ostacoli, molti gruppi di ricerca si sono rivolti a colture sferoidi di cellule tumorali. Sebbene utili, gli sferoidi tumorali o gli aggregati non replicano le interazioni cellula-matrice come si trovano in vivo. Pertanto, gli approcci di coltura tridimensionale (3D) che utilizzano un'impalcatura di matrice extracellulare forniscono un sistema di modello più realistico per l'indagine. A partire da xenotrapianti sottocutanei o intracranici, il tessuto tumorale viene dissociato in una sospensione a singola cellula simile alle neurosfere delle cellule staminali tumorali. Queste cellule vengono poi incorporate in una matrice extracellulare di derivazione umana, il biogel umano 3D, per generare un gran numero di microtumori. È interessante notare che i microtumori possono essere coltivati per circa un mese con un'elevata vitalità e possono essere utilizzati per test di risposta ai farmaci utilizzando saggi standard di citotossicità come il 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) e l'imaging di cellule vive utilizzando Calcein-AM. Inoltre, possono essere analizzati tramite immunoistochimica o raccolti per la profilazione molecolare, come la profilazione cinematica ad alto rendimento basata su array, che è descritta anche qui. I microtumori 3D, quindi, rappresentano un sistema di modelli versatile ad alto rendimento in grado di replicare più da vicino la biologia dei tumori in vivo rispetto agli approcci tradizionali.

Introduzione

I intracraniche tumori cerebrali maligni primitivi più comuni sono grado astrocitomi III e IV grado glioblastoma multiforme (glioblastoma o GBM). Questi tumori offrono prognosi poveri con mediana di sopravvivenza di un anno tra i 12 - 15 mesi con le terapie correnti per GBM negli Stati Uniti 1-3. terapie multimodalità comprendono la chirurgia, radioterapia e chemioterapia compresa temozolomide (TMZ) e gli agenti chinasi mirati. segnalazione della chinasi è spesso dysregulated in GBM, tra sottogruppi di tumori con amplificazione o mutazioni attivanti nel Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), aumenti di Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) di segnalazione, una maggiore fosfatidil-inositolo-3-chinasi (PI3K) e tumore sostenere segnalazione angiogenico attraverso Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR), così come altre chinasi guidato percorsi 4-6. Attuale in vitro e in vivo perdono spesso queste alterazioni rappresentativi 7. Inoltre, profilo genetico non ha offerto i benefici attesi che può riflettere il fatto che i cambiamenti genetici ed epigenetici non sempre prevedere i cambiamenti a livello di attività della proteina, dove la maggior parte chinasi agenti di targeting agiscono direttamente, e dove le terapie con altri meccanismi d'azione possono agire indirettamente.

La linea tradizionale di cellule immortalato che possono essere diversi passaggi all'infinito è stata a lungo lo standard per test anti-droga a causa della loro facilità di manutenzione e riproducibilità. Tuttavia, questo modello soffre di un ambiente di crescita elevato di nutrienti (e artificiale) che seleziona per le cellule che si differenziano notevolmente dal tumore originale in rapida crescita. Come tale, c'è stato un considerevole interesse nello sviluppo di sistemi modello più realistici che riflettono un sistema biologico tumore più complessa in quanto è presente nel paziente. xenotrapianti tumorali sviluppato direttamente da un tumore primario cresciuto in topi ( "xenoline," xenotrapianto paziente-derivati ​​o PDX) Provide un sistema modello più riflessivo, in particolare nel contesto di terapie del cancro, come si sentono di prevedere in modo più affidabile successo clinico. 8 Nonostante la biologia più riflessivo, questi modelli sono costosi e sono difficili da stabilire e mantenere. Inoltre, non sono suscettibili di studi ad alto rendimento. La necessità di sviluppare meglio i modelli biologici che riflettono più accuratamente alterazioni molecolari dei tumori primari, e al profilo e testare questi modelli con misure dirette di attività chinasi, non surrogare marcatori genetici, è chiaro.

E 'ben noto che a differenza di due-dimensionali (2D) colture monostrato, modelli di analisi multicellulari 3D o in grado di fornire più fisiologicamente rilevanti endpoint 9-11. cultura 3D comune si avvicina coinvolgere microcarriers matrice rivestite e la formazione sferoide cellulare. sferoidi tumorali possono essere generati tramite l'aggregazione cellulare utilizzando pallone filatore, piatto pHEMA e appendere le tecniche di caduta. Limitazioni per tapprocci ueste includono: impossibilità per alcune cellule a formare sferoidi stabili, la variabilità in termini di crescita e le sfide con tipi di cellule miste. In alternativa, molti sintetico (idrogel, polimeri) e di derivazione animale Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) a matrice da sarcomi del mouse, collagene bovino) matrici sono stati sviluppati per la cultura 3D studia 12-14. Matrix mouse EHS è ampiamente utilizzato, ma noto per promuovere la crescita e differenziazione cellulare in vitro e in vivo 15.

Al fine di replicare biologia tumorale 3D, un sistema biomatrice umano è stato sviluppato dal Dr. Raj Singh et al. 16. Il libero-fattore naturale, la crescita umana Biogel permette impalcature di coltura 3D (sfere, dischi), che supportano la coltivazione a lungo termine di più tipi di cellule. Una serie di disegni cultura Biogel umano 3D sono stabiliti per studiare la crescita del tumore, di adesione, l'angiogenesi e l'invasione proprietà. Vantaggi e proprietà dei Biogel umana rispetto ai comunigel del mouse EHS sono riassunti nella Tabella 1 e Tabella 2.

Fonte: Amnions umana (tessuto pool)
esenti da organismi patogeni, IRB-esenti / approvato
La natura ECM: Non denaturato Biogel (GLP-produzione)
Chiave
componenti: 		Col-I (38%), laminina (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactina & HSPG (<3%)
-GF gratis: Inosservabile EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (non-angiogenico, non tossico)

Tabella 1: Proprietà dei Biogel umana rispetto a EHS Gel comuni.

Biogel umana gel EHS
matrice umana naturale matrice del mouse ricostituita
la crescita e la differenziazione delle cellule Controlled Può promuovere la crescita delle cellule e la differenziazione
espressione genica fisiologica l'espressione del gene variabile
modello di coltura 3D dei tessuti simili modello di coltura piastra a base di

Tabella 2: Vantaggi di Biogel umana rispetto a EHS Gel comuni.

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Protocollo

NOTA: tutte le valutazioni di terapia xenotrapianto sono state effettuate utilizzando un modello di tumore ortotopico per glioblastoma su un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso di animali.

1. Isolamento di cellule GBM xenotrapianto paziente-derivati

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Re-costituiscono collagenasi-I in acqua sterile ad una concentrazione di 5 mg / ml filtro e sterile. Conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C (concentrazione finale è di 50 mg / ml in 100 ml di soluzione enzimatica).
    2. Sciogliere 100 mg fattore di crescita epidermico (EGF) in 2 ml sterile fosfato-Buffered Saline (PBS). Conservare in 100 microlitri (5 mg / 100 ml) aliquote a -20 ° C per una concentrazione finale di 10 ng / ml.
    3. Sciogliere 100 mg FGF-β in 2 ml di PBS sterile. Conservare in 100 microlitri (5 mg / 100 ml) aliquote a -20 ° C per una concentrazione finale di 10 ng / ml.
    4. Aggiungere la bottiglia seguente di una 500 ml di Neurobasal MedIA (NBM) per preparare completa NBM: 10 ml B-27 supplemento senza vitamina A, 5 ml di supplemento N2, 100 ml FEG, 100 ml fibroblasti fattore di crescita (FGF) -Basic, 5 ml di amfotericina B, 0,5 ml di gentamicina, 5 ml L-glutammina.
    5. Preparare la soluzione enzimatica fresco combinando: 98,5 ml di PBS, 1 ml di collagenasi-1, 0,5 ml 10x tripsina / EDTA e sterilizzare per filtrazione con filtro 0,22 micron pori.
    6. Preparare o ottenere un piccolo volume sterile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) / terreno di coltura cellulare F12 con il 7% di siero fetale bovino (FBS) e 1x PBS senza calcio e magnesio.
  2. tumore disaggregazione
    NOTA: atimici topo nu / nu precedentemente iniettati con cellule tumorali nel fianco destro e lasciati da una massa tumorale palpabile è necessaria per questa procedura. Negli esempi mostrati qui, abbiamo usato cellule GBM xenotrapianto derivati ​​da pazienti, JX10 e JX12 17.
    1. Sterilizzare area di lavoro a spruzzo 2% clorexidina e impostare area di lavoro ingegnoh strumenti necessari / forniture tra cui Chuck usa e getta, pinze, bisturi, vetro capsula di Petri, soluzione enzimatica, PBS, e clorexidina (Vedi Figura 2A).
    2. Euthanize mouse / topo che ospitano un tumore fianco. Obiettivo per un tasso di spostamento / min 20% delle emissioni di CO 2 con il 30% di CO 2. Dopo il mouse mostra arresto respiratorio, mantenere il flusso di CO 2 per circa 1 min (in genere 3 minuti in totale). I topi vengono rimossi dalla camera e dislocazione cervicale viene eseguita come conferma eutanasia secondaria. Spruzzare l'animale con il 3% di clorexidina per disinfettare la pelle.
    3. Tenendo il mouse costante, fare semicircolare incisione cutanea ~ 1,5 cm dal massa tumorale (fianco impiantato tumore) utilizzando un bisturi sterile monouso con # 11 lama cominciano cranica alla massa tumorale e incidendo verso il ventre del mouse e intorno al fine caudale.
    4. Riflettere pelle sopra massa tumorale con le dita con una leggera trazione sulla estremità caudale dell'incisione e poi spingere sulla pellesuperficie di elevare tumore per avere migliore accesso senza toccare il tumore (vedere Figura 2B).
    5. Utilizzare smussa con una pinza a delicatamente massa tumorale libera dalla parete peritoneale e dalla pelle (vedere la figura 2C).
    6. massa tumorale di trasferimento con una pinza a vetro sterile Petri (NON usare piatti di plastica per evitare la rottura durante il tritare) e disfarsi correttamente carcassa e posizionare tali strumenti da parte.
    7. Utilizzare nuova serie di strumenti sterili (bisturi con lama # 11, pinze semi-curve) per sbrigliare tessuto tumorale del tessuto necrotico e ospite membranosa tessuto connettivo del tumore che copre.
    8. Posizionare soluzione 15 ml di enzimi in una sterile trypsinizing ventilato pallone con ancoretta e iniziare a mescolare lentamente nella cappa.
    9. In uno sterile piatto di vetro Petri, lavare i tumori raccolti 3 - 5 volte con PBS sterile per rimuovere il sangue in eccesso (può versare o usare la siringa per sciacquare loro con la PBS). inclinare leggermente piatto e pipetta o aspirare il materiale di lavaggio. Mince finely utilizzando due lame # 11 bisturi (Vedi Figura 2D).
    10. Aggiungere 14 ml di soluzione di enzima per tumore tritato e pipetta delicatamente su e giù 2 - 3 volte. miscela Trasferimento a sfiatare-trypsinizing pallone e mescolare lentamente per 20 minuti. Preparare 5 50 provette coniche ml aggiungendo 1,5 ml FBS a ciascuno al fine di neutralizzare la tripsina nel passaggio 1.2.11.
    11. Dopo 20 minuti, raccogliere 14 ml di soluzione di cellule dalla boccetta trypsinizing e aggiungere a un tubo con FBS. Aggiungere soluzione enzimatica 14 ml fresca a pallone e continuare a mescolare.
    12. Centrifugare raccolte cellule a 150 xg per 8 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Aggiungere 45 ml di completo NBM al pellet, mescolare delicatamente, e ripetere la centrifugazione di risciacquare siero. Risospendere pellet in 5 ml completa NBM e tenere sul ghiaccio.
    13. Ripetere passaggi di raccolta delle cellule per un totale di 5 raccolti, che unisce tutte le cellule raccolte in un unico tubo conico in ghiaccio.
    14. Inserire un filtro cella 40 micron sulla parte superiore di un tubo conico 50 ml. Prep tegli cella filtro facendo passare 10 ml di DMEM / F12 + 7% FBS attraverso e poi lavate con 10 ml di PBS.
    15. Aggiungere lentamente sospensione cellulare al colino, permettendo così di gocciolare attraverso (Vedi Figura 2M). Sollevare delicatamente la linguetta del filtro cella tra ogni nuova aggiunta a rompere qualsiasi vuoto e permettono alle cellule in sospensione di passare liberamente (vedi Figura 2N).
    16. Centrifugare la sospensione cellulare filtrato come sopra. Risospendere in 10 ml completa NBM e contare fino a determinare il numero totale di cellule vitali che utilizzano 0,04% trypan blu e un emocitometro. Mantenere le cellule in ghiaccio fino generazione microtumor.

2. Tessuto alternativo disaggregazione protocollo

  1. Automatizzata dissociatore tessuti e sistema di disaggregazione.
    1. Posizionare il tubo di disaggregazione nella dissociatore cellulare, selezionare il programma "Tumor _02_02" e premere start e correre per 32 sec. tubo di trasferimento per Rotator, posto nel 37 ° C incubatore per 40 min.
    2. Centrifugare cellule sospese-a 150 xg per 8 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Mentre centrifugazione le cellule, impostare reagenti per il trattamento della sospensione cellulare. Aggiungere 10 ml NBM privo di siero e la sospensione delicatamente triturare.
    3. Dopo la centrifugazione, ottenere un pellet di cellule che contiene ~ 10 - 30 x 10 6 cellule vitali (~ 0,3 ml). Risospeso il pellet in 10 ml di NBM privo di siero (vedere la figura 2O). Determinare le cellule vitali mediante test di esclusione (vedi punto 3.2.2).

3. Microtumor Generation

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Preparare completa NBM come in 1.1.4 e preparare neutralizzato alta densità biogel umana (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / ml) per protocollo interno. Simili matrici Biogel può essere utilizzato come bene.
  2. Microtumor Produzione e Cultura
    1. Ottenere cellule PDX appena dissociate la sospensione singola cella in completa NBM, sul ghiaccio.
    2. Mescolare il cellulare suspension con un uguale volume di soluzione trypan blu (0,4% in PBS) e analizzare utilizzando emocitometro per determinare il numero di cellule e la vitalità con esclusione trypan blu 18. Rimuovere il volume necessario per generare 50.000 cellule / microtumor dove il volume = (50.000 cellule / tumore * # tumori) / (numero di cellule vitali / 1 ml) e posto in una nuova provetta conica.
    3. Concentrare le cellule per centrifugazione a 150 xg per 8 minuti, a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con la soluzione HDHG ghiacciata in un rapporto finale di 1 cellule parte di FBS e 4 parti HDHG.
    4. Utilizzare una pipetta multicanale elettronica per erogare 10 ml per miscela di cellule-HDHG pin su una piastra in acciaio 96-pin (con rivestimento idrofobo) per generare microtumors (perle di 2 mm ciascuno contenente 50.000 cellule).
    5. Posizionare perline tumorali 3D all'interno di coltura tissutale incubatore (37 ° C, 5% di CO 2, umidificata) per 15 minuti per gelate le perline.
    6. Dopo gelificazione, trasferire i microtumors (10 μ; L) ad una camera di coltura in sospensione personalizzati (50 ml) o grande piatto di coltura di volume (10 cm) contenenti completa NBM usando la pipetta multicanale elettronico e personalizzato pin-dispositivo.
    7. Dopo 1 - 2 giorni nel tessuto della cultura incubatore, trasferire microtumors a piastre di coltura a 96 pozzetti contenenti / pozzetto utilizzando una vasta-bocca di erogazione pipetta ed eseguire diversi protocolli di analisi e di analisi 50 ml NBM.
  3. Il trattamento farmacologico e manutenzione di microtumors
    1. Selezionare concentrazioni finali per i test di droga.
      NOTA: Se il farmaco ha conosciuto efficacia nella cultura 2D, selezionare 2x IC 50 come la concentrazione dose intermedia e seleziona 3 volte diluizioni seriali sopra e sotto per un totale di 5 livelli di dose. Ad esempio, se la IC 50 è 9 pM per il farmaco in coltura 2D, selezionare 2 mM, 6 pM, 18 pM, 54 pM, e 162 pM come concentrazione finale per il test di droga.
    2. Preparare la soluzione di dosaggio della droga 2x in completa NBM da dimetil sulfoxide (DMSO) stock. Diluire soluzione di dosaggio in media DMSO 1% per preparare una dose di 5, diluizione in serie di 3 volte.
    3. Aggiungere 50 ml di soluzione di dosaggio al microtumor pozzetto contenente 50 ml in piastre di saggio per ottenere una concentrazione di DMSO finale di 0,5%. Ripetere l'operazione per ogni replica (ad esempio, 4) in ogni dose di droga determinato al punto 3.3.1.
    4. Mantenere le culture a 37 ° C, 5% di CO 2, umidificata tessuto cultura incubatore per 1 - 14 giorni. culture feed due volte alla settimana aggiornando i media e la soluzione di droga come sopra.

4. morfologica e analisi fenotipica di Microtumors

  1. Determinare morfologia cellulare in microtumors utilizzando standard di colorazione live-cell.
    1. Preparare 1 mM magazzino di calceina-AM in DMSO. Aliquota e conservare a -20 ° C.
    2. A intervalli cultura desiderato (1, 7 e 14 giorni), aggiungere la soluzione calceina-AM preparata in PBS (senza Ca / Mg) a piastra a 96 pozzetti per 1 micron concentrazione finale.
    3. covare20 min a 37 ° C, 5% di CO 2, incubatore umidificato, e l'immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza a 2X, 4X e 10X (eccitazione: 450-490 passa banda nm, emissione: 515 nm lungo, dicroiche 500 nm) .
  2. Microtumor crescita / proliferazione Assay
    1. Sciogliere la polvere MTT in PBS (senza Ca / Mg) per preparare 12 mm magazzino. filtro sterile, un'aliquota, e conservare a -20 ° C.
    2. A intervalli desiderati coltura (1, 7 e 14 giorni), aggiungere 20 ml di soluzione di MTT a 96 pozzetti a 100 volumi cultura microlitri. Incubare 2 ore in coltura tissutale incubatore.
    3. Preparare la soluzione lisi fresco del 10% SDS a 0,01 M HCl e aggiungere pari quantità di volume di cultura a piastre. Incubare le piastre sigillati durante la notte in 37 ° C incubatore.
    4. Leggere l'assorbanza a 570 nm con un lettore multi-piatto.
  3. Microtumor preparazione per l'analisi Kinomic
    1. Preparare tampone di lisi pre-refrigerazione a 4 ° C e quindi aggiungendo un rapporto 1: 100 di ciascun 100x ProTEIN fosfatasi inibitore (PPI) e 100x proteine ​​inibitore della proteasi (PI). Mescolare bene e tenere in ghiaccio.
    2. Trasferimento 2 microtumors a ciascuno dei tre 1,5 ml provetta. Rimuovere il surnatante e aggiungere 40 ml di tampone di lisi contenente PPI e PI a ciascuna provetta e lisi per 30 minuti a 4 ° C.
    3. campioni pipetta con forza di rompere perline tumorali. Centrifugare a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C i campioni e conservare a -80 ° C fino al momento dell'analisi kinomic.

5. Kinomic Profiling di Microtumors

  1. Proteine ​​tirosin chinasi (PTK) profiling
    1. Reagenti Scongelare (10x Protein Kinase (PK) tampone e 2% di siero albumina bovina (BSA)) a 4 ° tampone C Carico PK (300 ml 10x PK scorta in 2,7 ml di dH 2 O) nella siringa in posizione # 2 sulla profilazione piattaforma.
    2. Aprire il programma software saggio di chinasi e caricare il file di protocollo PTK e premere 'START', annotare i campioni all'interno di softwsono programma dopo i chip di scansione. Posizionare i gettoni sulla piattaforma di profilazione e di carico di 25 ml di 2% di sieroalbumina bovina (BSA) per matrice e quindi premere LOAD per iniziare il protocollo software controllato blocco passo.
    3. Diluire 6 micron di 100 mm ATP magazzino con 54 ml dH 2 O per fare 10 mM adenosina trifosfato (ATP). Quando il software inizia il 3 °, e fase di lavaggio finale (visibile sullo schermo) portare 15 ug di lisato portato fino a 28 ml con dH 2 O, mescolare e aggiungere alla matrice.
    4. Preparare master mix PTK (MM) (per un massimo di 12 campioni). Aggiungere 32,6 ml dH 2 O per ricostituire ditiotreitolo (DTT) e aggiungere 6 ml DTT, e 60 ml 10x PK soluzione, a tubo PTK-MM1 (già contiene 60 ml 10x BSA).
    5. Attendere fino a quando prompt 'carico' nel software di analisi chinasi appare quindi aggiungere 126 ml di PTK-MM1, 60 ml additivo PTK, e 60 microlitri 10 mM ATP per MM2 (contiene precedentemente frazionato 4,5 ml PY20 FITC anticorpi) e mescolare.Aggiungere 16 ml di questo master mix PTK in ciascuna provetta lisato campione e mescolare pipetta 5 volte.
    6. Assicurarsi vetro di copertura è pulito e quindi aggiungere 35 microlitri lisato / master mix per array, chiudere il coperchio giostra, e premere il tasto LOAD.
  2. Serina / treonina chinasi (STK) Profiling:
    1. reagenti Scongelare (10x tampone PK, 10x STK tampone, e il 2% BSA) a 4 ° C. Buffer di carico PK (300 ml a 2,7 ml dH 2 0) in posizione siringa # 1, 01:10 e buffer di STK (300 ml a 2,7 ml dH 2 0) in posizione siringa # 2.
    2. Aprire il programma software per computer saggio di chinasi e caricare il file di protocollo STK e premere START, annotare i campioni all'interno del programma dopo i chip di scansione. Posizionare i gettoni sulla piattaforma di profilazione e di carico di 25 ml di 2% BSA per array, quindi premere LOAD per iniziare il protocollo di blocco passo controllato via software.
    3. Diluire 6 micron di 100 mm ATP con 54 ml dH 2 O. Durante la finale (3 °) fase di lavaggio mix2 mg di lisato e portare fino a 32,6 ml con dH 2 O, mescolare e aggiungere alla matrice.
    4. Fare STK master mix: Aggiungere 70 ml 10x PK a tubo STK-MM1 (contiene 7 ml 100x BSA), e poi aggiungere 42 ml dH 2 O a tubo STK-MM1.
    5. Attendere fino a quando prompt 'carico' nel software di analisi chinasi poi: Aggiungere 18 ml 10 mM ATP per STK-MM1, e aggiungere 9 ml MM1 ad ogni lisato campione. Mescolare bene.
    6. Assicurarsi vetro di copertura è pulito e aggiungere 35 microlitri lisato / master mix per array, chiudere il coperchio giostra, e premere LOAD.
    7. Durante la finale (3 °) fase di lavaggio aggiungere anticorpo secondario 1,05 ml STK-FITC a tubo DMAB (contiene 3,03 ml STK mix anticorpo primario), aggiungere 39,6 ml AB tampone per DMAB, aggiungere 356,0 ml dH 2 O a DMAB, aggiungere 30 ml di DMAB per ogni array, e premere LOAD .
  3. L'analisi dei dati Kinomic 19,20
    1. Aprire software di analisi e caricare l'immagine Analisi App. Senare cartella di immagini contenente immagini tutta una serie codice a barre e data e ora per la PTK o STK dati, il numero abbinato Seleziona articoli file di layout array (86312 per la PTK e 87102 per STK), e il carico generato in precedenza gamma di annotazione File.
    2. Verificare il corretto gridding di tutte le immagini, ed eseguire tempo di esposizione Scaling App. Statisticamente confrontare i valori log2 trasformato l'esposizione / pendenza, e convalidare con prelavaggio curve cinetiche 19-21.
    3. Eseguire monte software chinasi previsione per interrogare i profili kinomic alterati tra le condizioni per la chinasi a monte 22,23.

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Risultati

Abbiamo dimostrato che il sistema cultura Biogel 3D supporta la crescita a lungo termine e la funzione di molteplici tipi di cellule. In questo progetto di collaborazione, xenolines GBM pazienti-derivato (PDX) vengono utilizzati per la produzione di centinaia di microtumors. Cellule dissociate (3 x 10 5) o neurospheres (40 - 50) sono stati incorporati in perline Biogel (2 mm) e dopo gelificazione pratica sono coltivate in un bioreattore personalizzata NB-media riempito. vitali...

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Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo prevalentemente riguardano microtumor generazione, nonché il dosaggio del farmaco e manutenzione. Poiché le perle microtumor sono fragili e facilmente strappata, estrema cura è necessaria in entrambe le fasi di sviluppo di un test e manutenzione. Se si verifica un errore durante uno di questi processi, l'interpretazione sperimentale può essere compromessa, provocando l'estensione o inutili ripetizioni di esperimenti o addirittura l'esclusione dei dati.

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Dichiarazioni

R.S. e R.S.S. sono dipendenti di Vivo Biosciences. J.C.A. è parzialmente finanziato dal Kinome Core dell'UAB.

Ringraziamenti

Supportato da NIH R21 concessione (PI: C. Willey, CA185712-01), Cervello premio tumore SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151.129-03) e il contratto SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi-I Sigma-AldrichCO130
Tripsina EDTA (10x)Invitrogen15400-054 
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 IntegratoreLife Technologies17502-0481x concentrazione finale
B-27 Integratore senza vitamina ALife Technologies12587-0101x concentrazione finale
FGF-basic Life Technologies umano ricombinantePHG0266concentrazione
finale 10 ng/mlEGF umano ricombinanteLife TechnologiesPGH0315concentrazione finale 10 ng/ml
L-GlutamminaCorning Cellgro Mediatech25-005-CI2 mM concentrazione finale
FungizoneOmega ScientificFG-702.5 &; g/ml
concentrazione finale Penicillina StreptomicinaOmega ScientificPS-20100 U/ml Penicillina G, 100 µ g/ml Concentrazione finale di streptomicina
GentamicinLife Technologies15750-06050 ng/ml concentrazione finale
MTTLife TechnologiesM6494preparato a 5 mg/ml in PBS e filtrato in modo sterile, 1 mg/ml in pozzetto
SDSFisherBP166per tampone di lisi MTT, preparato al 10% in 0,01  M HCl, 5% nel pozzo
HClFisherA144SI-212per tampone di lisi MTT, preparato a 0,01  M con SDS, 5 mM in pozzetto
Calcein AMLife TechnologiesC14301 mM in DMSO stock, 2  µ M in soluzione colorante PBS, 1  µ M in pozzo
Halt' s Cocktail di inibitori della fosfatasi proteica Pierce ThermoScientific78420Rapporto 1:100 in MPER 
Inibitore della proteasi proteica di HaltPierce ThermoScientific87786Rapporto 1:100 in
MPER Reagente per l'estrazione di proteine di mammifero (MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisherBP231per la dissoluzione di calceina AM e composti
Soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca/MgLonza17-517Qdiluito a 1x con acqua ultrapura MiliQ e filtrato sterile (per colture cellulari)
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco con Ca/MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CVdiluita a 1x con acqua ultrapura MiliQ (per lavaggio pre-fissaggio)
Formalina tamponata neutra al 10%Protocollo032-060
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
InibitoreVivo BiosciencesHDHG-5
Pierce78420
Inibitore della proteasi proteica di HaltPierce87786
Reagente per l'estrazione di proteine dei mammiferi (MPER)Thermo Scientific78501
Chip di profilazione array di proteina tirosina chinasi (PTK)PamGene86312
tampone PTK chinasiPamGene36000300 µ l 10x PK buffer stock in 2,7  ml dH2O, numero di catalogo per il kit di reagenti PTK
ATPPamGene36000numero di catalogo per il kit di reagenti PTK
PY20- Anticorpo coniugato FITCPamGene36000numero di catalogo per il kit di reagenti
PTK Additivo PTKPamGene32114
Provetta PTK-MM1 (10x BSA)PamGene36000numero di catalogo per il kit
di reagenti PTKChip di profilazione array serina/treonina chinasi (STK)PamGene87102
tampone chinasi STKPamGene32205numero di catalogo per il kit di reagenti STK
Miscela di anticorpi primari STK (provetta DMAB)PamGene32205per il kit di reagenti STK
Anticorpo secondario coniugato FITCPamGene32203
STK-MM1 (100x BSA)PamGene32205numero di catalogo per il kit di reagenti STK
STK Antibody BufferPamGene32205numero di catalogo per il kit di reagenti STK
Equipment
#11 Lame, steriliFisher3120030
#3 manici di bisturi, steriliFisher08-913-5
Piastre di Petri in vetro da 100 mmFisher08-748D
Pinze semicurveFisher12-460-318
Pallone di tripsinizzazioneFisher10-042-12B
Agitatore magneticoFisher14-490-200
3/4" ancoretteFisher14-512-125
B-D colino cellulare Fisher#352340
B-D 50 ml Provetta da centrifugaFisher#352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 software di analisi kinomica PamGene
Evolve SoftwarePamGene
UpKin (previsione delle chinasi a monte)PamGene
gentleDissociatore MACSMiltenyi Biotec130-093-235
Sistema di coltura cellulare rotante (RCCS)SyntheconRCCS-Dcon HARV monouso da 10 ml
della proteina fosfatasi di Halt ad alta densità Hubiogel Numero di catalogo Provetta Software per il saggio delle chinasi per l'app

Riferimenti

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