Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

Sommario

Questo manoscritto descrive l'uso di un ceppo bioluminescente di tripanosomi africani per consentire il monitoraggio dell'infezione in fase avanzata e dimostra come l'imaging dal vivo in vivo possa essere utilizzato per visualizzare le infezioni all'interno del sistema nervoso centrale in tempo reale.

Abstract

La tripanosomiasi africana umana (HAT) è una malattia a più stadi che si manifesta in due stadi: uno stadio precoce del sangue e uno stadio tardivo quando il parassita invade il sistema nervoso centrale (SNC). Lo studio in vivo dello stadio avanzato è stato limitato in quanto le metodologie tradizionali richiedono la rimozione del cervello per determinare la presenza dei parassiti.

L'imaging a bioluminescenza è una forma di imaging ottico non invasiva e altamente sensibile che consente la visualizzazione di un patogeno trasfettato con luciferasi in tempo reale. Utilizzando un ceppo di tripanosoma trasfettato che ha la capacità di produrre una malattia in fase avanzata nei topi, siamo in grado di studiare la cinetica di un'infezione del SNC in un singolo animale durante il corso dell'infezione, oltre a osservare il movimento e la disseminazione di un'infezione sistemica.

Qui descriviamo un protocollo robusto per studiare le infezioni del SNC utilizzando un modello di bioluminescenza della tripanosomiasi africana, fornendo osservazioni non invasive in tempo reale che possono essere ulteriormente analizzate con approcci opzionali a valle.

Introduzione

La tripanosomiasi africana umana (HAT), o malattia del sonno, è causata dai parassiti protozoari trasmessi da vettori del Trypanosoma brucei spp¹. Il numero stimato di casi attuali è inferiore a 7mila ogni anno, con quasi 70 milioni di persone esposte al rischio di infezione parassitaria all'interno del continente africano. La malattia, che il più delle volte è letale se non trattata, comprende uno stadio emolinfatico precoce in cui i parassiti sono presenti nel sangue, che progredisce fino allo stadio avanzato in cui i parassiti invadono il sistema nervoso centrale (SNC) e non sono più suscettibili al trattamento con farmaci tripanosomici in stadio iniziale². Le attuali terapie farmacologiche per l'HAT in fase avanzata hanno regimi di trattamento complessi e prolungati ed effetti avversi gravi, nonché resistenza riportata, pertanto la ricerca di nuove terapie farmacologiche è imperativa^3,4.

Lo studio della tripanosomiasi africana umana (HAT) in fase avanzata all'interno di modelli murini tradizionali è lungo e complesso, con la rimozione del tessuto cerebrale necessaria per monitorare il carico parassitario⁵. Il ceppo infettivo animale T. b. brucei è utilizzato come modello di studio della tripanosomiasi con lo stadio tardivo che compare 21 giorni dopo l'infezione (dpi). Per monitorare l'infezione da parassiti non bioluminescenti wild type nel modello murino, le pellicole di sangue periferico o la PCR quantitativa sono gli unici metodi per determinare il carico di parassiti. Per il carico di parassiti nel cervello, il topo deve essere abbattuto, il cervello asportato e la qPCR eseguita sui tessuti, rendendo impossibile tracciare i parassiti attraverso più punti temporali nella fase avanzata dell'infezione. Ciò si traduce nell'incapacità di seguire in tempo reale le infezioni all'interno del sistema nervoso centrale (SNC).

L'imaging a bioluminescenza in vivo (BLI) può fornire un rilevamento altamente sensibile e non invasivo della disseminazione del parassita e della progressione della malattia in un modello murino che può essere seguito in un singolo animale per l'intero esperimento⁶. Il BLI si basa sull'emissione di luce nello spettro visibile prodotta da una reazione catalizzata dalla luciferasi. I fotoni emessi vengono quindi rilevati da una fotocamera CCD (Charge Coupled Device)⁷. A questo scopo, l'agente patogeno viene geneticamente modificato per esprimere una proteina luciferasi e il substrato, la luciferina, viene introdotto nei punti di interesse per iniezione. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di effettuare studi longitudinali, in cui lo stesso animale può essere visualizzato più volte con effetti avversi minimi. Il segnale di bioluminescenza acquisito può essere quantificato, indicando così il carico di agenti patogeni.

L'ottimizzazione e la convalida di un T. b. brucei bioluminescente spostato verso il rosso ha permesso lo studio dell'infezione in fase avanzata attraverso procedure non invasive, rilevando i parassiti prima della microscopia con film di sangue e riducendo notevolmente il tempo, il costo e il numero di animali necessari per studiare l'infezione del SNC e lo screening dei farmaci nella tripanosomiasi in fase avanzata^8,9. In questo protocollo dimostriamo l'infezione di topi con tripanosomi bioluminescenti e come visualizzare i parassiti in vivo per la quantificazione della progressione della malattia e della penetrazione nel SNC.

Protocollo

Etica
Tutto il lavoro è stato realizzato sotto l'approvazione del Regno Unito per la casa Ufficio Animali (procedure scientifiche) Act 1986 e la London School of Hygiene & Tropical Medicine Animal Welfare and Ethics Review Board. ARRIVARE linee guida sono seguite in questo rapporto.

1. In Vivo Passaggio di Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

1. Rimuovere uno stock crioconservati (stabilate definito) di T. b. brucei ceppo GVR35-VSL-2 (disponibile dal professor John Kelly presso la London School of Hygiene & Tropical Medicine attraverso MTA) ⁹ da azoto liquido e permettono di equilibrare a temperatura ambiente. Diluire stabilate a 2 x 10 ⁴ trypanosomes / ml in sterile tampone fosfato glucosio (PBS-G) pH 8,0 (1 L PBS + 15 g di glucosio) ^10.
   Nota: T. b. brucei GVR35-VSL-2 non è contagioso per gli esseri umani e richiede SAPO licenza strutture per effettuare esperimenti.
2. inject 20-25 g femminile del mouse CD1 con 0,2 ml trypanosomes diluiti per via intraperitoneale (ip) con un ago da 25 G. Questo è il "mouse donatore". Posizionare il mouse infetto in uno specifico patogeno libero (SPF) -cage e mangimi ad libitum.
   Nota: i topi CD1 sono un ceppo outbred e T. b. infezioni brucei GVR35 sono ben caratterizzati in questo ceppo. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a ceppi inbred o geneticamente modificati, ma è importante notare che il colore della pelliccia possono influire sulla sensibilità dell'imaging ^6,9.
3. Monitorare parassitemia periferica dal prelievo di sangue. Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione di plastica e prendere 5 ml di sangue dalla coda per via venosa con 21 G ago o venesection e mescolare 1/10 con cloruro di ammonio sterile 0,85% per la lisi dei globuli rossi e consentire una più facile conteggio.
4. Contare il sangue diluito in un Neubauer emocitometro.
   1. Caricare il sangue diluito in entrambe le camere. Conta l'intero gr centraleid di una camera per dare n trypanosomes. Concentrazione di trypanosomes nel sangue = n x 10 ⁴ trypanosomes / ml, regolare per qualsiasi fattore di diluizione e calcolare la media delle due camere.
      Nota: Dopo circa 5-7 giorni dopo l'infezione, parassitemia periferica dovrebbe aumentare in misura sufficiente a svolgere una infezione ad una concentrazione di 2 x 10 ⁴ tripanosomi / ml.
5. Quando i livelli di trypanosome sono sufficienti per il numero di topi richiesti alta, passare al punto 1.6. Un livello parassitemia di 6 x 10 ⁴ trypanosomes / ml in un topo donatore è sufficiente per infezione di 10 topi.
   Nota: Per le dimensioni statisticamente significative del gruppo, n = 6 per ogni gruppo di trattamento di topi sono necessari ^8. Per gli altri modelli di infezione, calcoli di potenza dovrebbero essere applicati per determinare le dimensioni dei gruppi appropriati.
6. Topi posto in una scatola di calore (a 28-30 ° C per circa 5-10 minuti) per consentire le vene coda di dilatarsi.Per indurre anestesia terminale, somministrare 20 mg / kg ev pentobarbital con un ago 25 G. Conferma del mouse è anestetizzato premendo delicatamente i cuscinetti plantari per garantire che non vi è alcun riflesso di ritiro.
7. Eparinizzare un ago G 21 aliquotandolo 5 ml eparina a 5.000 USP unità / ml in un tubo Bijou e succhiare due volte dentro e fuori l'ago di una siringa da 1 ml.
8. Prendere la eparinizzato 21 G ago e siringa da 1 ml, ed eseguire puntura cardiaca sul mouse passaggio anestetizzato inserendo l'ago centralmente sotto la gabbia toracica (una goccia di sangue piscina nella base dell'ago) e tirare delicatamente lo stantuffo in modo da non comprimere la camera del cuore. Raccogliere un minimo di 0,7 ml di sangue.
9. Diluire sangue infetto per produrre un inoculo di 2 x 10 ⁴ trypanosomes / ml in PBS-G pH 8,0 come al punto 1.1.
   Nota: A questo punto, il sangue rimanente può essere crioconservati per produrre stabilate miscelando con 8% glicerolo, 20% inattivato al calore ca fetalesiero lf (hi-FCS) e il 72% di sangue infetto. Lentamente congelare a -80 ° C usando un lento congelamento contenitore congelamento per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 ° C / min, prima del trasferimento a azoto liquido.

2. L'infezione di topi sperimentale

1. Posizionare CD1 topi di sesso femminile (~ 21-25 g) in una scatola di riscaldamento a delicatamente calda per dilatare le vene. Posizionare i topi riscaldati in un sistema di ritenuta di plastica e iniettare 0,2 ml inoculo diluito per via endovenosa con un ago G 25 nella vena della coda, pari a 4.000 trypanosomes per topo. Mettere pressione al sito di iniezione in seguito per fermare l'emorragia.
   Nota: infezione intraperitoneale è un percorso valida di infezione ed è stato utilizzato in studi precedenti ^10, ma abbiamo trovato questo meno riproducibile rispetto alla via endovenosa.
2. Randomize topi infetti e la gabbia in gruppi di 3 in gabbie SPF-ventilati. Come controllo, iniettare CD1 topi femmina con wild type parassita non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
3. Monitorare l'infezione attraverso il sangue Film Microscopia
   1. Spot 5 ml di sangue da prelievo venoso o salasso su un vetrino ed eseguire uno striscio di sangue (utilizzando un secondo vetrino spingere delicatamente la goccia di sangue in tutto il vetrino per produrre un film sottile). Lasciare le diapositive asciugare all'aria.
   2. Fissare lo striscio di sangue con il 100% di metanolo e macchia con Giemsa per 10 minuti prima di risciacquare con dH ₂ O e lasciare asciugare all'aria. Sotto obiettivo 100X contare il numero di tripanosomi in 10 campi di vista (FOV).
      Nota: le riprese sangue viene eseguita insieme a tutto l'animale di imaging non invasivo più presto dopo l'infezione di un giorno. Durante l'elaborazione di un numero di animali, questo metodo di quantificazione tripanosoma è preferito rispetto conteggio emocitometro come i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente e successivamente contati.

3. bioluminescenza Imaging per tenere traccia delle infezioni

Nota: Per monitorare l'infezione, tutto animAl imaging non invasivo può essere utilizzato.

1. Preparare una soluzione stock di D-luciferina, il substrato luciferasi di lucciola, in Dulbecco tampone fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro sterilizzare e congelare in aliquote a -20 ° C.
   Nota: D-Luciferin è sensibile alla luce, quindi proteggerlo dalla luce avvolgendo aliquote in un foglio. Non più volte di gelo-disgelo luciferina in quanto può influenzare l'attività ^11.
2. Scaldare una aliquota di D-luciferina a temperatura ambiente. Rimuovere ogni mouse dalla gabbia (compresi topi di controllo infettate con nonbioluminescent ceppo wild type parassita) e iniettare 150 mg / kg di D-luciferina riscaldato (diluito in DPBS) per via intraperitoneale con un ago 25 G. Posizionare il mouse in una camera isofluorane per circa 5 minuti per indurre l'anestesia con il 2% isofluorane / O ₂ miscela a 2,5 L / min.
   Nota: I topi diventano immobile quando sono sotto anestesia. Per l'imager qui utilizzato, 3 topi possono essere elaborati in un momento. Se i topi sono anesthetzato per più di 30 minuti, unguento oftalmico lacrima artificiale può essere applicato per prevenire gli occhi dei topi si secchi.
3. Per l'imager qui descritto, aprire il software e inizializzare la macchina utilizzando il software secondo le istruzioni del produttore. Acquisire le immagini una volta fotocamera e la piastra riscaldata hanno raggiunto la temperatura.
   Nota: questo strumento non è di solito spento, consentendo alla macchina di eseguire calibrazioni di fondo durante la notte. Nel caso in cui deve essere riavviata o deve eseguire un controllo di calibrazione prima.
4. Mettere i topi anestetizzati nella termocamera (cfr 3,5). Utilizzare grandi separatori neri tra i topi per ridurre al minimo sanguinare attraverso di qualsiasi segnale bioluminescente luminoso. topi immagine utilizzando una serie di tempi di esposizione; 1, 3, 10, 30, 60 e 180 secondi, con medie discretizzazione, 1 f / stop e un filtro aperto, e il campo visivo E (12.5 x 12.5 cm ^2).
   Nota: I topi di controllo infettati con il tipo selvatico parassiti GVR35 nonbioluminescent forniscono un backgrvalore di bioluminescenza ound. Da un esperimento di cinetica di luciferina (Figura 6), con questo modello, abbiamo trovato che i picchi di segnale bioluminescenza a 10 minuti dopo la somministrazione e l'imaging dura circa 5 minuti per 3 topi. Prendete questo lasso di tempo in considerazione quando anestetizzare e di imaging i topi.
5. Per garantire l'imaging approfondito dei topi, ruotare per ottenere una ventrale, dorsale e vista laterale. Mantenere la coerenza dell'ordine di orientamento per l'imaging tra animali sequenziali.
6. Dopo l'imaging, permettono topi per recuperare da anestesia sotto osservazione prima di tornare a SPF-gabbia.
7. Continuare l'imaging topi ogni 7 giorni fino al giorno 21 dopo l'infezione. Ci dovrebbe essere un costante aumento del segnale bioluminescenza sull'intera animale.
8. Al D21, immagini e striscio di sangue dei topi come descritto in precedenza, e la dose topi con 40 mg / kg per via intraperitoneale Diminazene aceturato. Questo farmaco cancellerà il parasitemia periferico, ma non attraverserà la barriera emato-Brain barriera, e permette quindi una migliore visualizzazione dell'infezione CNS.
   Nota: Diminazene aceturato è un farmaco comunemente utilizzate per il trattamento di tripanosomiasi animale fase iniziale.
9. Continuare l'imaging e il monitoraggio a D28 e D35.

4. Conferma CNS infezione

1. Al D35, topi immagine sopra descritto (passi 3,1-3,4).
2. Dopo l'imaging, permettono di recuperare i topi da topi anestesia e Exsanguinate come dettagliato nella fase 1,6-1,8, raccolta di sangue per ulteriori analisi.
3. Dopo puntura cardiaca, perfusione topi con 20 ml di PBS (opzionale: aggiungere 3 mg / ml di luciferina alla soluzione di perfusione) attraverso il cuore per cancellare il sangue dagli organi e di reintrodurre etichetta luciferina che potrebbero aver eliminato dalla regione del cervello durante l'intervallo di tempo dal punto 4.1.
4. Rimuovere delicatamente il cervello, utilizzando forbici curve, tagliando dalla base attorno alla circonferenza del cranio e sollevamento fuori la parte superiore del cranio, per permettere al cervelloper essere delicatamente tirato fuori con le pinze curve.
5. Posizionare il cervello asportato su una sezione di plastica nera e pipettare 50 ml di 15 mg / ml luciferina sopra l'organo prima di imaging, per garantire un'adeguata luciferina è stato aggiunto al cervello asportato. Immagine utilizzando le impostazioni come sopra. Questo dimostrerà localizzazione dell'infezione agli emisferi cerebrali.
   Nota: quantificazione valle parassitemia sul cervello asportato può essere effettuata da qPCR come precedentemente descritto ^8. Altre applicazioni a valle alternative potrebbero includere l'istologia o immunoistochimica per identificare i parassiti nel tessuto cerebrale dopo la fissazione.

5. La quantificazione della bioluminescenza Imaging

Nota: bioluminescenza sia quantificabile secondo la regione di interesse (ROI) con il software di imaging e corretta per lo sfondo bioluminescenza.

1. Utilizzando lo strumento ROI, creare un ROI di forma rettangolare per intero animale quantificazione unnd posizionarlo dell'immagine mouse sopra per coprire punta del naso alla base della coda del topo. Utilizzare la stessa casella di dimensione per ogni animale e ogni punto del tempo. Osservando il ROI per il cervello, utilizzare una ROI circolare nello stesso modo, posizionandolo sopra la regione della testa del mouse nell'immagine.
2. Se necessario, regolare le immagini a comparire sullo stesso spettro per una rappresentazione visiva di infezione.
   Nota: il software utilizzato qui genera una mappa di colori per ogni immagine regolata automaticamente per i conteggi minimo e massimo di fotoni. Per consentire un confronto visivo tra una serie di immagini, la scala di colore deve essere impostato gli stessi valori per tutte le immagini.
   1. Usando l'immagine con il più alto bioluminescenza e la scheda 'Regolazione immagine' sulla tavolozza degli strumenti, selezionare una scala logaritmica e un adeguato minima scala di colori e massima (da determinare empiricamente). Applicare questa scala a tutte le immagini di tutto l'esperimento.

Risultati

Questo protocollo dimostra come seguire la progressione della malattia dopo l'infezione di topi con T. b. brucei, un modello per la tripanosomiasi africana umana. La figura 1 mostra la sequenza temporale del protocollo sperimentale, dimostrando il calendario per la fasi di trattamento e di imaging. La Figura 2 mostra un tipico campo di vista in uno striscio di sangue Giemsa-macchiate fisso utilizzato per quantificare parassitemia periferico,...

Discussione

Lo sviluppo di un T. bioluminescente b. brucei GVR35 ceppo permette la visualizzazione di una infezione tripanosoma dalla presto per la fase tardiva. Precedenti modelli di infezione erano in grado di rilevare la fase avanzata, quando i parassiti sono nel cervello, in tempo reale dalla microscopia striscio di sangue, e richiedevano l'abbattimento e la rimozione dei cervelli dal topi infettati per determinare parassita fardello ^12. La bioluminescenza riduce la variabilità inter-mouse come ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PBS	Sigma, UK	P4417	compresse pH 7,4
Glucosio	Sigma, UK	G8270	99,5% (molecolare) grado
Cloruro di ammonio	Sigma, UK	A9434	99,5% (molecolare) grado
Eparina (sale di litio)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Filtrato sterile
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturato	Sigma, UK	D7770	Grado analitico
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, Regno Unito		altri bioimager disponibili ad es da Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, software proprietario del Regno Unito		per gli strumenti Perkin Elmer IVIS; altri strumenti possono avere la propria
siringa da 1 ml Fisher	Scientific, Regno Unito	10142104
Siringa da 20 ml	Fisher Scientific, Regno Unito	10743785
aghi	da 25 GGreiner Bio-one	N2516
21 G Aghi	Greiner Bio-one	N2138
Vetrino per microscopio a doppia smerigliatura	VWR, UK	631-0117
Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml	StarLab, UK	I1415-1000
Provetta Bijou da 7 ml	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse retrattile	Sigma, UK	Z756903	Il nostro sistema di ritenuta è stato realizzato internamente, questo è un modello simile